专利名称：天山雪莲sikPrx基因在培育抗逆植物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从菊科凤毛菊属植物天山雪莲(Saussurea involucrata Kar. et Kir)中克隆得到SikPrx基因，构建植物表达载体，转化植物，并对植物抗旱、抗寒和抗盐效 果进行评价，增加了植物的抗逆性能。
背景技术：
在有氧环境下，各种生物的代谢产物中普遍含有活性氧族(ROS)，其中包括过氧 化氢(H2O2)、这些活性氧在机体的大量堆积可导致蛋白质损伤、膜脂过氧化、碱基突变、 DNA断裂等，妨碍各种生理生化代谢过程的正常进行，严重时导致细胞、组织死亡，因此逆 境对植物的伤害实际上可以归结为过量的ROS对植物产生的伤害。为了减轻活性氧对植 物伤害，生物在进化过程中发展形成了各种抗氧化系统，以抵抗这些活性氧族的破坏作 用，并由一些酶类来修复由氧化作用所致的损害。抗氧化剂包括维生素E、维生素C、维生 素A、类胡萝卜素、超氧歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶以及 peroxiredoxin (Prx)等。peroxiredoxin (Prx)基因是新近发现的一类编码过氧化物酶的基因，主要包括硫 氧化还原蛋白过氧化物酶(TPx)、烷基过氧化氢还原酶C(AhpC)等，其中最早报道的是在酿 酒酵母中发现的TPx。该抗氧化酶系分布广泛，几乎存在于所有酵母、真菌、植物、寄生虫、哺 乳动物和人类等多种生物体内。最初对Prx功能的描述主要来源于对细菌和酵母的研究。 其编码蛋白属于抗氧化蛋白超家族，其催化活性和蛋白序列与其它抗氧化剂完全不同，它 除了在清除活性氧中具有重要作用以外，还具有刺激细胞增殖，参与细胞的信号转导等其 它多种功能。由于它在清除活性氧族中具有重要作用，已成为近年来研究的热点。Prx不含有结合金属的离子，无需与金属离子结合就具有抗氧化作用。其抗氧化活 性是通过分解烷基过氧化物和过氧化氢，从而阻止强氧化剂-羟自由基的产生。Prx含高 度保守的具还原活性的半胱氨酸，与酶的抗氧化活性有关。根据已知的Prx基因序列与氨 基酸序列，可将其分为I-Cys和2-Cys两类。前者仅在47位上有一个高度保守的半胱氨酸 残基，后者则在47位和170位上分别有一个高度保守的半胱氨酸残基。此外，2-Cys类Prx 在Cys47周围的保守序列为苯丙氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-脯氨酸，简称FVCP，而I-Cys类 Prx在Cys47周围的保守序列为脯氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-苏氨酸，简称PVCT。2-Cys类Prx是通过一条肽链上的Cys47巯基与对应肽链上的Cysl70巯基之间 脱氢形成分子内二硫键即Cys47S-SCysl70，以供氢而还原氧化，然后再依靠其他供氢体将 还原型辅酶II的H+转移至Prx，使其恢复原来的结构和功能。例如酵母的TPx，其结构为 25kDa的二聚体，当与过氧化物反应时，首先是一条肽链上的Cys47巯基被氧化为Cys47硫 键，再与另1条肽链上的Cysl70巯基结合，这样氢离子可还原过氧水，从而发挥抗氧化作 用。尔后通过硫氧化还原蛋白氧化态与还原态间的转换，将还原型辅酶II的氢离子转移给 Prx，使Prx再生。许多试验证明植物的2-CysPrxs大都定位于叶绿体中。正常条件下，当叶绿体中产生0_2后即能快速地为SOD歧化为H2O2和02，H2O2及其衍生物则被APX、GPX或2_Cys Prxs 快速地清除或还原。然而，在受到干旱、盐碱、低温逆境条件下，叶绿体的S0D、APX、GPX等活 性氧清除酶的生成易被抑制或易失活。因此，如何激活叶绿体清除酶或调节其基因表达，或 导入能够高效表达的活性氧清除酶基因，对提高植物抗逆性具有重要意义。新疆雪莲(Sasussured involucrate Kar. et Kir.)为多年生一次性开花结实的 高山草本植物，主要分布在2400 4000m的高原寒带地区，其境特异，最高月平均温度3 5°C，最低月平均温度19 21°C。与一般抗寒植物不同，雪莲在极端低温下通过积极的生命 活动来适应严寒，在雪中能旺盛生长并且开花。具有极强的耐寒、抗辐射、抗风沙、抗缺氧的 能力，是天山雪线以上的惟一大型高等植物。雪莲长年生长在极端环境下，决定了其具有许 多特殊的抗逆功能基因，其表达产物可能在逆境条件下，具有更好的稳定性和更好的活性 功能。目前还未见关于天山雪莲peroxiredoxin (Prx)基因sikPrx的报道。
发明内容
本发明的一个目的是为植物抗逆育种提供有价值的天山雪莲 peroxiredoxin (Prx)的基因sikPrx，其发明的目还在于构建植物表达载体 pBI121-sikPrx，在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗寒性、抗旱性和耐盐性，通 过该基因的过量表达，使植物的抗逆胁迫性能得到提高，最终获得抗寒性、抗旱性和耐盐性 能力明显增强的植物。通过天山雪莲低温诱导下基因的表达谱分析，从已建的天山雪莲cDNA文库中筛 选到了一个peroxiredoxin (Prx)的基因sikPrx，其序列为<210>1。该基因基因全长935bp， 开放阅读框为792bp，编码263个氨基酸。通过亚细胞定位在线软件分析表明，该蛋白质含 有定位于叶绿体信号肽，长54个氨基酸。在成熟肽的第62位和182位含有2个-Cys，Cys62 位周围含保守序列为苯丙氨酸_缬氨酸_半胱氨酸_脯氨酸(FVCP)，属2-Cys类Prx，与已 知的油菜(Brassica napus)的 2_Cys-peroxiredoxin 同源性最高。本发明的目的是通过以下过程和方法实现的本发明所述的从天山雪莲中克隆sikPrx基因，其序列为<210>1。本发明的从天山雪莲中克隆sikPrx基因的过程如下以天山雪莲cDNA文库单克隆质粒为模板，用PPl其序列为<210>2和PP2其序列 为<210>3为引物进行扩增，得到目的基因；sikPrx基因植物表达载体构建构建植物表达载体pBI121-SikPrx ；利用上述基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化获得转基因植物NaCl处理后，转sikPrx基因烟草的相对含水量比对照烟草的含水量高；伤害率较 对照减弱；MDA含量较低；过氧化物酶活性是对照烟草的10倍。转sikPrx基因烟草在盐胁 迫下表现出极强的抗盐性。不同浓度PEG6000处理后，转sikPrx基因烟草的相对含水量比对照烟草的含水量 高；随着PEG6000浓度的升高，伤害率呈上升趋势，较对照烟草低；MDA含量较低；过氧化物 酶活性始终高于对照烟草。水分胁迫试验中，转sikPrx基因烟草的相对含水量始终高于对照组烟草，随着胁迫的时间延长，相对含水量的下降趋势小于对照烟草；伤害率较对照减弱，下降的幅度高达 10倍；MDA含量较对照较低；过氧化物酶的活力呈现明显的上升趋势。转SikPrx基因烟草 在干旱胁迫下表现出极强的抗旱性。低温胁迫试验中，转SikPrx基因烟草的相对含水量始终高于对照组烟草，相对含 水量的下降趋势小于对照烟草；伤害率较对照低；MDA含量较对照较低；过氧化物酶的活力 呈现明显的上升趋势。转SikPrx基因烟草在低温下表现出极强的抗寒性。转天山雪莲peroxiredoxir^Prx)基因sikPrx烟草的抗逆功能分析表明，转基因 烟草对干旱、高盐和低温都表现出了极强的抗性水平。
图 1 是天山雪莲 pGM-sikPrx PCR 鉴定图 Figl :The amplification of pGM-sikPrx图 2 是天山雪莲 pGM-sikPrx 酶切鉴定图 Fig2 :The enzyme digestion ofpGM-sikPrx图3是天山雪莲sikPrx氨基酸同源性分析Fig3 :The homology analysis of amino acid of sikPrx图 4 是 pBI121-sikPrx PCR 鉴定 Fig4 :PCR identification ofpBI121-sikPrx图 5 是 sikPrx 转化烟草 PCR 检测 Fig5 :The amplification of transgenic tobacco ofsikPrx图 6 是 sikPrx 转基因烟草 RT-PCR 分析 Fig6 =RT-PCR analysis on sikPrx transgenic tobacco图7是逆境胁迫对转基因烟草形态的影响图8是盐胁迫对转基因烟草生理指标的影响图9是PEG6000胁迫对转基因烟草生理指标的影响图10是水分胁迫对转基因烟草生理指标的影响图11是低温胁迫对转基因烟草生理指标的影响图12是天山雪莲sikPrx植物表达载体pBI121_SikPrx的构建流程 1 中1, MarkerIII 2-3, pGM-sikPrx 1, MarkerIII 2-3, pGM-sikPrx图 2 中1. enzyme digestion(Xbal/SacI) 3. enzyme digestion (EcoRl)2. 4 Plasmid 5. MarkIII图 4 中l.Markerlll 2. Negaive 3-5. PCR of pBI121_sikPrx图 5 中l-10.pBI121-sikPrx 转化烟草 0. Negative Μ· Marker III图 6 中3-5.pBI121-sikPrx 转化烟草 2. Negative Μ· Marker III图 7 中
l,500mmoINaCl 处理 2，30% PEG6000 处理 8d 3，干旱胁迫 9d 的实验
具体实施例方式实验涉及的药品琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为Tiangen公司生产；EcoR I、XbaI、 SacI、T41igase和Taq酶均购于上海生物公司；pGM-Τ载体购于北京Tiangen公司；DNA琼 脂糖凝胶回收试剂盒购于北京百泰克公司。具体实验操作依据[美]J.萨姆布鲁克D. W.拉 塞尔的《分子克隆实验指南》。实施例1 天山雪莲cDNA文库单克隆质粒的提取取天山雪莲cDNA文库单克隆保存的甘油管于IOmlLB液体培养基(Cm 50 μ g/ml) 中，37°C 220rpm振荡培养过夜。蘸取菌液于LB固体培养基(Cm 50 μ g/ml)平板上划线培 养，37°C暗培养12-16hr。挑取单克隆于20mlLB液体培养基(Cm 50 μ g/ml)中，37°C 220rpm 振荡培养14hr，提取质粒，具体方法如下1)将菌液分装于1. 5ml Ep管，12000rpm离心3min，弃上清液；2)加入400ml STE溶液，重悬，12000rpm离心3min，弃上清液；
3)沉淀用150 μ L碱裂解溶液I重悬，混勻；4)加入新鲜配制的300 μ L碱裂解溶液II，轻轻混勻，至溶液清澈；5)加入225 μ L碱裂解溶液III，轻轻混勻，冰上放置5min ；离心(12000rpm， 5min)；6)吸取上清于另一新Ep管，加入等体积三氯甲烷，充分混勻，室温放置5min ；离心 (10000rpm,5min)；7)小心吸取上清于另一新Ep管，加入两倍体积无水乙醇约为850 μ L，-20°C放置 IOmin ；离心(12000rpm, 5min)；8)弃去上清，沉淀用70%乙醇洗涤两次，室温吹干后溶于40 μ L TE (含RNase A 20 μ g/ml)溶液中，37°C温育 30min。实施例2 从天山雪莲中克隆到SikPrx基因以天山雪莲cDNA文库单克隆质粒为模板，用PPl其序列为<210>2和PP2其序列 为<210>3为引物进行扩增，同时以去离子水为模板进行扩增作为阴性对照。PP1 为<210>2
5' TCTAGAAGATTCAACGATGGCT 3'
PP2为<210>3
5’ GAGCTCTTAGTTATACAGCTGCAA 3’
PCR反应体系(20 μ 1)为:
10XPCR Buffer 2. 0 μ 1
dNTPs (各 2. 5mM) 0. 5 μ 1
MgCl2 (25mM)1. 2μ 1
上游引物(25 μ Μ)0. 5μ 1
下游引物(25 μ Μ)0. 5μ 1
模板 DNA (ddH20)0. 5μ 1
Taq DNA Polymerase(2. 5U/μ 1)0. 3μ 1
ddH2014. 5μ 1Total20. 0μ 1PCR 反应程序为95°C预变性 4min ；95°C变性 30s，60°C 复性 30s，72°C 延伸 45s， 30cycles ；72°C延伸 IOmin ；4°C保温。PCR反应结束后，产物经浓度为1. 0 %的琼脂糖凝胶电泳分离后，使用Tiangen 的琼脂糖凝胶回收试剂盒按照说明书方法分别回收目的基因，得到的目的片段命名为 sikPrxο 如图 1、2。实施例3 构建sikPrx基因植物表达载体构建植物表达载体pBI121-SikPrx。用Xbal/SacII分别双酶切植物表达载体 PBI121，获得载体片段。回收目的基因片段和载体片段。将目的基因片段与载体片段进行 体外连接，经鉴定正确的重组质粒分别命名为pBI121-sikPrx。在本实施方案中，我们选用 烟草作为转基因植物材料，也可选用其它植物作为转基因材料。如图4、12。在本实施方案中，sikPrx基因和pBI121构成一个植物表达载体，用于植物的转 化。根据本发明的这一实施方案，构建所选用的植物表达载体除了 PBI121之外，还可以选 用其他植物表达载体。实施例4 农杆菌的转化4. 1农杆菌感受态的制备1)从新鲜的GV3101平板上挑取一个单菌落于LB液体培养基(5ml)+Rif (50ug/ ml)+Gen(50ug/ml)中，于 28°C、200rpm 振荡培养 48hr ；2)取 200ul 菌液于 20ml 的含 Rif (50ug/ml)及 Gen(50ug/ml)的 LB 液体培养基中 活化培养至OD6tltl = 0. 5-0. 8收集菌液，冰浴30min ；3)分装菌液于1. 5ml离心管，于4°C，6000rpm离心5min，弃尽上清，收集农杆菌细 胞；4)将沉淀的农杆菌用750ul预冷的0. 05mol/LCaCl2重悬，4 °C，8000rpm离心 5min ；5)弃上清用75ul 0.05mol/lCaCl2(10%甘油)重悬细胞，保存于_70°C。4. 2植物表达载体转化根癌农杆菌GV3101 (冻融法)1)吸取10 μ 1上述重组载体质粒(约0. 5 μ g/ μ 1)，与75 μ 1 GV3101感受态细胞 轻轻混勻，冰浴30min，然后液氮冻存5min ；2)迅速置于37°C水浴2min ；3)加入 600 μ 1 液体 LB 培养基(Rif+Gen)，28°C、200rpm 振荡培养 5hr ；4)将上述培养液于6000rpm离心5min，收集农杆菌细胞，弃去500 μ 1液体培养 基，剩余100 μ 1重悬细胞；5)将菌液涂布在含有 Kan 50 μ g/ml, Rif50 μ g/ml 及 Gen50 μ g/ml 的固体 LB 培 养基平板上，28°C培养24-48hr。4. 3阳性克隆筛选挑取若干单菌落，进行菌落PCR，将筛选出的阳性克隆命名为 pBI121-sikPrx-GV3101。在本实施方案中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。冻融法为本领域技术人员非常熟悉的技术操作，不是本发明的关键。通过PCR检测阳性的农杆菌菌株，用于转 化植物。实施例5 烟草遗传转化及再生本发明中对于靶植物的转化方法不是关键，可以使用本领域技术人员所熟悉的各 种不同的转化技术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但不仅限于农 杆菌侵染法，微粒轰击法，显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法 等均可。本方案中用于将转化细胞再生成植株的方法，可以使用适合于其他靶植物。最好 使被转化的序列稳定的整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代的过程中不被丢 失。另外，用于转化靶植物的核苷酸序列可以以线性，环形或其它重组载体的形式如人工染 色体的形式存在。5. 1农杆菌浸染液的制备1)从-70°C保存的含有pBI121-sikPrx-GV3101的GV3101农杆菌甘油管中挑取 菌块，接种于5ml附加有Kan 50 μ g/ml, Rif 50 μ g/ml, Gen 50 μ g/ml的LB液体培养基中， 28 0C，200rpm 振荡培养约 30hr ；2)吸取 200 μ 1 菌液，再用 20ml LB 液体培养基(Kan 50 μ g/ml，Rif50 μ g/ml，Gen 50 μ g/ml)稀释，28°C，200rpm 振荡培养约 4hr ；3)活化的菌液培养至OD6tltl = 0. 4-0. 6时，即为转化用的浸染液。5. 2 浸染1)超净工作台上将浸染液倒入无菌培养皿中，将无菌烟草叶片剪成Icm2大小的方 块，放入菌液中，振荡浸染IOmin ；2)取出烟草叶片，用滤纸吸干净叶盘上附着的菌液；3)在共培养基(MS+6-BA2. 0mg/L+IAA0. 3mg/L)上覆一张无菌滤纸，将浸染过的叶 盘均勻地摆放在滤纸上；在26°C暗培养条件下共培养2-3天。5. 3抗性愈伤组织筛选及出芽诱导将共培养过的烟草叶盘转移至MS+6-BA 2. Omg/L+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的烟草诱导选择培养基上，叶盘伤口充分接触培养基。每15-20天转接一次，转接
1-2次以后，叶盘边缘逐渐产生淡绿色、致密的愈伤组织，继续培养直至诱导出丛生芽。5. 4转化植株的生根培养和移栽待丛生芽长至2-3cm左右时，将其切下转接到MS+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的烟草生根选择培养基上进行生根培养。转基因烟草15天左右开始有根生成，待根系发达时，将根系生长良好的转化植 株，去除封口膜，室温环境中进行炼苗7天左右，然后用水洗净培养基，将苗转入基质(蛭 石腐质土 =2 1)中，26°C，16hr 40 μ mol · πΓ2 · s—1光照，70%相对湿度条件下培养，前
2-3天需遮阴、避光、保湿。实施例6 转基因烟草的分子检测6. 1转基因烟草的PCR鉴定6. 1. 1 烟草 DNA 的提取(SDS 法)(1)称取植物幼嫩叶片约0. Ig于研钵中，加液N充分研磨至粉末状。
(2)将粉末分装至1. 5mL的小离心管中，加入800 μ 1的CTAB提取缓冲液，充分混 勻，于 65°C水浴 20-30min。(3)将离心管冷却至室温后，加入400 μ 1的氯仿，充分混勻后，于10，OOOrpm离心 5min。(4)吸取上清至另一离心管，加入1/10V的10%的CTAB和600 μ 1的氯仿，充分混 勻后，10，OOOrpm离心5min。(重复一次)(5)吸取上层液体至另一离心管，加入1/10V的NaAC(pH5. 2)和2V的预冷的无水 乙醇，在_20°C沉淀IOmin。(6) 10，OOOrpm离心IOmin后，倒掉液体，可在离心管底部看到白色胶状物质即为 DNA。(7)用70%的乙醇洗沉淀2次后，吸干液体，吹干后加入40 μ 1的ddH20溶解。6. 1.2转基因烟草的PCR鉴定以提取的转化基因的烟草DNA为模板，用LPl其序列为<210>2和LP2其序列为 <210>3为引物进行扩增，同时以去离子水为模板进行扩增作为阴性对照，扩增体系如实施 例2。如图5。6. 2转基因烟草的RT-PCR检测6. 2. 1待检测植株总RNA的提取TIANGEN公司的TRNzol总RNA提取试剂提取已鉴定的转基因烟草和未转化的烟草 总 RNA 1)将研钵及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的枪头、离心管均 使用0. 1 %的DEPC处理，高压灭菌；2)取植物幼嫩叶片约0. Ig于研钵中，加液N充分研磨至粉末状；3)将粉末分装至1. 5mL的小离心管中，加入Iml的TRNzol提取试剂，充分快速混 勻，室温放置3-5min。4) 10000rpm，4°C离心5min，吸上清至一新的离心管，加入200 μ 1氯仿，剧烈振荡 混勻；5) 10000rpm，4°C离心5min，吸取上层液体至另一新的离心管后，加入600 μ 1预冷 的异丙醇，于_20°C沉淀30min ；6) IOOOOrpm,4°C离心IOmin后，倒掉液体，在离心管底部即可见到白色沉淀，即为 总 RNA。7)用70%的乙醇(DEPC处理)洗涤沉淀2次后，吸干液体，吹干后加入30 μ 1 ddH20 (DEPC处理)溶解，保存于_20°C备用。6. 2. 2cDNA 第一链的合成在DEPC 处理的 0. 2ml 离心管中加入 RNA 2 μ 1，dNTP (2. 5mM) 1 μ 1，Oligo dT 1 μ LddH2O 5μ 1后，在70°C水浴5min后迅速置于冰上lmin。然后在离心管中加入Rnase Inhibitor 0. 5 μ 1，AMV 反转录酶 0. 5 μ 1，42°C 0. 5hr,95°C 5min 后，冷却至 4°C。6. 2. 3cDNA第二链的合成及扩增在PCR反应管中加入cDNA第一链反应产物1 μ l，5XTaq buffer 4 μ 1， MgCl2 (25mM) 1. 0μ 1，dNTP (2. 5mM) 0. 5 μ 1，上下游引物(25ymol)各 0· 5 μ 1，ddH20 补至20 μ 1，条件同实施例2。如图6。实施例7转基因植株抗逆生理指标的测定过氧化物酶(POD)的活力测定、丙二醛(MDA)含量的测定、相对含水量的测定和伤 害率的测定参照李合生(李合生.植物生理生化实验原理和技术[Μ].北京高等教育出版 社，2003. Ρ164-165，，Ρ260-261，Ρ261-263)。重复 3 次。如图 8、9、10、11。转基因植株被鉴定后，通过无性繁殖获得无菌苗，在MS培养基上生根后。植株成 活后选取生长一致的苗(5-7叶期)，用打孔器打取已检测的阳性转基因烟草和非转基因的 烟草(NC89)植株的叶片各10片，放入装有IOml的去离子水的玻璃试管中。低温胁迫设置 四个温度梯度15°C，4°C，0°C，-4°C。在低温培养箱中，待温度降到设定温度时，处理8h，后 取植株第二到第五片叶片进行各项生理指标测定。PEG6000 模拟干旱设置四个浓度梯度0% PEG6000,10% PEG6000,20% PEG6000, 30% PEG6000, NC89空白烟草对照组，每个浓度分别处理三棵，各组每株每天施IOOml PEG6000溶液，高浓度的PEG6000溶液从低浓度开始，每隔24h递增10%，直到达到终浓度， 处理9d后取植株第二到第五片叶片进行各项生理指标测定。NaCl 设置四个浓度梯度0mmolNaCl、IOOmolNaCl，200mmolNaCl，500mmolNaCl， NC89空白烟草对照组，每个浓度分别处理三棵，各组分别每株每天施IOOmlNaCl溶液，高浓 度的NaCl溶液从低浓度开始，每隔24h递增lOOmmolNaCl直到达到终浓度，处理8d后取植 株第二到第五片叶片进行各项生理指标测定。序列表<110>石河子大学<120>天山雪莲SikPrx基因在培育抗逆植物中的应用<160>3<210>1<211>935<212>DNA<213> ^Lljll^ (Saurrea. involucrata Kar. etKir.)<220><221>5，UTP<222>(1). . . (9)<220><221>CDS<222>(10). . . (801)<220><221>3，UTP<222>(802). . . (935)<400>1Translation of DNAMAN2(10—801)Universal codeTotal amino acid number :263，MW = 340940162]Max0163]10164]10165]0166]610167]210168]0169]1210170]410171]0172]1810173]610174]0175]2410176]810177]0178]3010179]1010180]0181]3610182]1210183]0184]4210185]1410186]0187]4810188]1610189]0190]5410191]1810192]0193]6010194]2010195]0196]6610197]2210198]0199]7210200]241
Max ORF starts at AA pos 3(may be DNA pos 9)for 263AA(789bases), Mff = 29085 gattcaacg atg get tgt tea tct get tea cct get ctt ctt tct tct cca ate get aga Met Ala Cys Ser Ser Ala Ser Pro Ala Leu Leu Ser Ser Pro lie Ala Arg 70809010010120
tac att tcc ccc aaa tcc gtt ctc tcc caa acc cta agt ttt tcc ggt tc
aac Asn
ttc Ser
tcc Ser
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ctc gat caa ttt cag ate caa Ser lie Asn Phe Arg Ser Lys 190200
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aga ctt cga age aga age cgt ttt Asp Phe Glu Ala Glu Ala Val Phe
310320
tat egg gag gaa ata tgt ggt act lie Gly Arg Lys Tyr Val 370
tga gat cac tgc ttt Glu lie Ihr Ala Phe 430
ggg tgt ttc tgt aga Gly Val Ser Val Asp
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tga tea aga gtt cat caa Asp Gln Glu Phe lie Asn
330340
ctt ctt cta ccc att gga Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp 380390400
tag cga ccg ata tgc tga att tga Ser Asp Arg Tyr Ala Glu Phe Glu 440450460
cag cgt gtt ctc gca tct tgc ttg Ser Val Phe Ser His Leu Ala Trp 500510520
ttt gaa cta tcc att gat ttc gga Leu Asn Tyr Pro Leu lie Ser Asp 560570580
gat caa aga tea ggg gat age gtt lie Lys Asp Gln Gly lie Ala Leu 620630640
tea gca ctc gac gat caa caa tct Gln His Ser Thr lie Asn Asn Leu 680690700
act tea cgc att gca att tgt aca Leu His Ala Leu Gln Phe Val Gln 740750760
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Leu Ser Phe Ser Gly Ser
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230240
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850 860 870 880 890
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901 tataacaaac ccccccaagc ctaatatagt gatag
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tctagaag attcaacgatggct
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gagctcgagtttaggatcaggc
权利要求
1.一种从天山雪莲中克隆SikPrx基因，其特征在于该基因935bp，其序列为<210>1， 在5’非编码区有9bp，3’非编码区有134bp，最大开放阅读框为792bp，编码263个氨基酸。 通过亚细胞定位在线软件分析表明，该蛋白质含有定位于叶绿体信号肽，长54个氨基酸。 在成熟肽的第62位和182位含有2个-Cys，Cys62位周围含保守序列为苯丙氨酸-缬氨 酸_半胱氨酸_脯氨酸(FVCP)，属2-Cys类Prx。
2.一种利用上述基因SikPrx基因构建的植物表达载体。
3.一种从天山雪莲中克隆序列为<210>1的SikPrx基因的用途，其特征在于利用上述 基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得抗寒转基因植物。
4.一种从天山雪莲中克隆序列为<210>1的SikPrx基因的用途，其特征在于利用上述 基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得抗旱转基因植物。
5.一种从天山雪莲中克隆序列为<210>1的SikPrx基因的用途，其特征在于利用上述 基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得抗盐转基因植物。
全文摘要
本发明涉及一种天山雪莲sikPrx基因在培育抗寒、抗旱和抗盐植物中的应用，本发明从天山雪莲中克隆sikPrx基因，利用上述基因构建植物表达载体，遗传转化获得抗逆转基因植物。本发明从天山雪莲中克隆sikPrx基因，并在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗寒、抗旱和抗盐性，通过该基因的过量表达，使植物的抗低温胁迫、抗旱和抗盐性能得到提高，最终获得抗逆能力明显增强的植物。
文档编号C12N15/53GK102115758SQ200910113590
公开日2011年7月6日 申请日期2009年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者喻娜, 张煜星, 徐登献, 王爱英, 祝建波 申请人:石河子大学