专利名称：天山雪莲sikDh2基因在培育抗寒植物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从菊科凤毛菊属植物天山雪莲(Saussurea involucrata Kar. et Kir)中克隆得到sikDh2基因，构建组成型植物表达载体，转化植物，并对抗寒效果进行评 价，增加植物的抗寒性能。
背景技术：
低温是限制植物地理分布及生物产量的重要因素，也是危害农业生产的主要自然 灾害之一。低温往往造成植物细胞脱水，破坏膜脂双分子层表面的水合保护体系，造成膜脂 双分子层间距的减小，引起膜融合以及膜结构的严重破坏。脱水素(Dehydrins)羧基末端含有富含Lys基序的K-区段(consensus sequence :EKKGIMDKIKEKLPG)，许多脱水素包含由6个以上丝氨酸组成的S-区段 (S-segment),大部分也包含一个或多个 Y-区段(Y-segment) (consensus sequence {V/ T}DEYGNP)。在氨基酸终止区和K-区段之间也有一些保守序列，包括甘氨酸和苏氨酸 序列，它们的特点都是高度亲水，可以在极性氨基酸之间替代。K-区段形成α-螺旋， 它可以稳定大分子和亚细胞结构(Emergence of a biochemical roleof a family of plant dehydration proteins. Physiol Plant 97 795~80)、(Structural motifs in LEA proteins ofhigher plants. In :Close TJ and Bray EA(eds)Response of Plants to Cellular Dehydration DuringEnvironmental Stress. Rockville American Society of Plant Physiologists, pp 91-103)。S-区段可以作为磷酸化位点，与核定位信号肽相结 合参与运输(The maize abscisic acid-responsive protein Rab 17 islocated in the nucleus and interacts with nuclear localization signals. Plant Cell 6:351—360)、 (Expression,tissue distribution and subcellular localization of dehydrin TAS14 in salt-stressed tomato plants. Plant MolBiol 26:1921-1934)。免疫定位表明脱水 素不仅存在于细胞核，而且在胞质中也存在(Nuclear mdcytoplasmic localisation of maize embryo and aleurone dehydrin. Protoplasma 177 :87_94)。Y-区段序列与分子 伴侣部分核酸结合序列同源(Identification Of nucleotide-binding regions in the chaperonin proteinsGroEL and GroES· Nature 366:279-282)。不同的脱水素其K-区段、Y-区段的数目，以及其它序列的特征都是不一样的。植物基因组中包含许多的脱水素序列，然而到目前为止，仅个别几个物种中的被确定为冷调节脱水素，其它的脱水素都是在种子发育过程中受干旱和盐胁迫表达的。冷调 节脱水素在大小，保守区段的种类上是不同的，不是一种类型。Y-区段变化较大，有的有，有 的没有。脱水素能与细胞的膜结构相互作用，包括细胞质膜和细胞内膜，表明脱水素应该具有稳定膜结构的作用(Close TJ. Dehydrins :a commonalty in the response of plants todehydration and low temperature[J]. Physl Plant，1997，100 :291_296)。脱 水素κ片段形成的α“螺旋能使脱水素与部分变性蛋白质的疏水位点相结合，起到了类似于分子伴侣的作用，阻止蛋白质的进一步变性；还可以替代水分子的位置，其分子内羟基 与磷脂分子中的极性键形成氢键，使膜脂的状态仍类似于未脱水状态；脱水素的α “螺旋 能与低温下细胞内形成的冰晶表面紧密结合，阻止冰晶的进一步扩大，防止由于水分凝固 而对细胞造成的伤害(Wisniewski M, Webb R, Balsamo R, Close T J, Yu X_M，Griffith Μ. Purification, immunolocalization, cryoprotective, and antifreeze activity of PCA60 :A dehydrinfrom peach(Prunuspersica L. )[J].Physl Plant,1999,105 600-608)。由于脱水素具有高度的水合能力，它与膜脂结合能够阻止细胞内水分的过多流 失，维持膜结构的水合保护体系，防止膜脂双分子层间距的减小，进而阻止膜融合以及生物 膜结构的破坏(Allagulova C R, Gimalov F R, Shakirova F M, Vakhitov V A. The plant dehydrins structure and putative functions[J] · Biochemistry，2003，68 :945_951)。低温、干旱等逆境会破坏植物细胞自由基代谢的平衡，增加活性氧自由基的产生， 进而引发或加剧膜脂的过氧化，造成细胞膜系统的损伤。有证据表明，脱水素能够清除植物 iffllfi^ W^tifi S(Hara Μ, Fujinaga Μ, Kuboi Τ. Radical scavenging gactivity and oxidative modification of citrusDehydrin[J]. Plant Physiol Biochem,2004,42 657-662)(Hara M,Terashima S,Fukaya T,Kuboi T. Enhancement of cold tolerance and inhibition of lipid peroxidation by citrus dehydrin in transgenic tobacco[J]. Planta，2003，217 :290_298.)。脱水素在植物体内表现为对生物膜和蛋白质结构的稳定作用，从而减小逆境和脱 7jcilfMX^tii^MM^J ^W (Close T J. Dehydrins =Emergence of a biochemical role of a family of plant dehydration proteins.Physio Plant,1996,97 (4) :795_803)。作为新疆的特色植物，新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar. et Kir)，又名天 山雪莲、雪莲花等。属菊科凤毛菊属，主要生长于海拔2400 4100m的高山草甸、高山冰碛 石和流石滩石隙、悬崖峭壁石缝等处。那里气候多变，冷热无常，雨雪交替，最高月平均温 3 5°C，最低月平均温-19 -21 °C，年降水量约800毫米，无霜期仅有50天左右。天山雪莲经过长期的自然选择，形成了稳定的特殊结构、功能和遗传基因，产生了 适应极端环境条件下的生理和生化机制，这种与环境相适应的机制，与一般的耐冷、抗寒应 答性的适应机制不同，主要表现在其低温条件下能够正常的生长发育，而一般的抗寒性植 物在相应的低温条件下，生长发育受到抑制。近年来植物抗寒基因工程得到迅速发展，并研究出了多种转基因抗寒植物，为培 育抗寒植物开辟了新途径。雪莲生活在极端环境中，是一种极好的抗寒基因的资源，至今， 国内外对雪莲脱水素的研究还未见文献报道。利用这种具有特色稀有植物，从中筛选、克隆 出与抗寒直接相关的基因，揭示雪莲适应性的机制，研究其遗传基础，充分发掘其潜在的基 因资源，并将其用于农作物品种改良，具有巨大的学术和经济价值。
发明内容
本发明的一个目的是为植物抗寒育种提供有价值的冷诱导脱水素基因sikDh2，其 发明的目还在于构建植物表达载体pBin438-sikDh2，在转基因植物中得到表达，提高转基 因植物的抗寒性，通过该基因的过量表达，使植物的抗低温胁迫性能得到提高，最终获得抗 (耐)低温能力明显增强的植物。
本发明的目的是通过以下过程和方法实现的本发明所述的从天山雪莲中克隆sikDh2基因，其序列为<210>1。本发明的从天山雪莲中克隆sikDh2基因的过程如下以天山雪莲cDNA文库单克隆质粒为模板，用DPl其序列为<210>2和DP2其序列 为<210>3为引物进行扩增，得到目的基因；sikDh2基因植物表达载体构建构建植物表达载体PBin438-sikDh2 ；
利用上述基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化获得抗寒转基因植 物以未转化烟草植株叶片为对照，转基因株系在模拟抗寒胁迫8小时后，与未转基 因株系相比，叶片相对电导率下降48. 6%。当温度高于_2°C时，转基因烟草和未转基因植 株烟草叶片的电导率并没有明显差别，但是当温度达到_4°C时，未转基因烟草叶片的电导 率明显高于转基因烟草叶片，说明在-4°C时，未转基因烟草叶片细胞已经不能耐受低温，细 胞膜破裂，内容物溢出，导致电导率上升，而转基因烟草叶片细胞能够耐受低温，电导率并 未出现大的变化。MDA是膜脂过氧化的产物之一，其含量可以表示脂质过氧化的程度。转基因植株被 鉴定后，通过无性繁殖获得无菌苗，在MS培养基上生根后。烟草经不同低温温度处理，MDA 的含量均有所提高。不同处理的烟草MDA含量上升幅度依次为21.9%、24.9% ；12.9%, 18.5%。从结果中分析得出，不管是0°C，_4 °C低温处理8hr，野生型烟草比转基因烟草的 MDA含量增加大，说明野生型植株膜质的过氧化程度相对较高。原因可能在于转基因烟草降 低了脂质过氧化的程度。本发明不仅首次得到天山雪莲抗寒相关冷诱导脱水素基因sikDh2，而且将其构建 成的植物表达载体，在转基因植物中研究了该基因在提高植物耐低温性能中的重要功能。 这对于揭示雪莲的抗寒机理，丰富植物抗寒分子生物学理论，提高植物的耐低温能力，具有 重要的意义。
图 1 是天山雪莲 sikDh2 基因 PCR 扩增图 Figl :sikDh2gene PCR amplified图 2 是 pUCm-sikDh2PCR 鉴定图 Fig2 :PCR identification of pUCm_sikDh2图 3 是 sikDh2 进化分析图 Fig3 =Phylogenetic analysis sikDh2图 4 是 pBin438-sikDh2PCR 鉴定 Fig4 :PCR identification ofpBin438-sikDh2图 5 是 pBin438-sikDh2 酶切鉴定 Fig5 =Restriction enzyme digestion identification of pBin438_sikDh2 6 ^ 转 it GV3101PCR 'M 定 Fig6 :PCR identification of pBin438-sikDh2-GV3101图 7 是转化烟草 PCR 检测 Fig7 :PCR identification of transformed tobacco图 8 是转基因烟草 RT-PCR 分析 Fig8 :RT-PCR analysis on transgenic tobacco图9是sikDh2基因转化烟草叶片相对电导率的测定Fig9 =Relative conductivity of tobacco leaves图10是不同温度处理对烟草MDA含量的影响Fig. 10 =Effect of temperaturetreatment onthe content of MDA in tobacco 图11是植物表达载体是pBin438-sikDh2的构建流程 1 中1 阴性对照；2 :sikDh2 ；M =Marker图 2 中1 :pUCm-sikDh2 ；2 阴性对照；M =Marker图 4 中1-4 :pBin438-sikDh2 ；5 阴性对照；M =Marker图 5 中1,2 :pBin438-sikDh2 ；M =Marker图6 中1 阴性对照；2-5 :pBin438-sikDh2-GV3101 ；M =Marker图 7 中1 阴性对照；2-6 :sikDh2 转化烟草；M =Marker图 8 中1 阴性对照；2，3 :sikDh2 转化烟草；M =Marker
具体实施例方式实验所涉及的药品琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为上海生工公司生产；LA PCRTM in vitro CloningKit 购自 TaKaRa 公司；RNA 酶、Taq 酶、T4-DNA 连接酶(T4-DNA ligase)、 Marker、TRNzol总RNA提取试剂购于TIANGEN公司；BamH I、Sal I等限制性内切酶为 Fermentas公司原装；IPTG、X-gal及抗生素、植物激素购自上海Sangon公司；其他试剂及 配制MS培养基的各种试剂均为国产分析纯。具体实验操作依据[美]J.萨姆布鲁克D. W.拉 塞尔的《分子克隆实验指南》。实施例1 天山雪莲cDNA文库单克隆质粒的提取取天山雪莲cDNA文库单克隆保存的甘油管于IOmlLB液体培养基(Cm 50 μ g/ml) 中，37°C 220rpm振荡培养过夜。蘸取菌液于LB固体培养基(Cm 50 μ g/ml)平板上划线培 养，37°C暗培养12-16hr。挑取单克隆于20mlLB液体培养基(Cm 50 μ g/ml)中，37°C 220rpm 振荡培养14hr，提取质粒，具体方法如下1)将菌液分装于1. 5ml Ep管，12000rpm离心3min，弃上清液；2)加入400ml STE溶液，重悬，12000rpm离心3min，弃上清液；3)沉淀用150 μ L碱裂解溶液I重悬，混勻；4)加入新鲜配制的300 μ L碱裂解溶液II，轻轻混勻，至溶液清澈；5)加入225 μ L碱裂解溶液III，轻轻混勻，冰上放置5min ；离心(12000rpm， 5min)；6)吸取上清于另一新Ep管，加入等体积三氯甲烷，充分混勻，室温放置5min ；离心 (10000rpm,5min)；7)小心吸取上清于另一新Ep管，加入两倍体积无水乙醇约为850 μ L，-20°C放置 IOmin ；离心(12000rpm, 5min)；
8)弃去上清，沉淀用70%乙醇洗涤两次，室温吹干后溶于40 μ L TE (含RNase A 20 μ g/ml)溶液中，37°C温育 30min。实施例2 从天山雪莲中克隆到sikDh2基因以天山雪莲cDNA文库单克隆质粒为模板，用DPl其序列为<210>2和DP2其序列 为<210>3为引物进行扩增，同时以去离子水为模板进行扩增作为阴性对照。
DP1 为<210>25' GGATCC AAAATG GCACAACAC GGAT 3'BamHIDP2 为<210>35' GTCGAC ATGAAATGATTA CTT CTGACC CC 3'SalIPCR 反应体系(20 μ 1)为IOXPCRBuffer2. 0 μ 1dNTPs (各 2. 5mM)0. 5 μ 1MgC12(25mM)Ι.ΟμΙ上游引物(25μ Μ)0· 5 μ 1下游引物(25μ Μ)0. 5μ 1模板DNA (ddH20)0. 5 μ 1Taq DNA Polymerase (2. 5U/ μ 1) 0. 3 μ 1ddH2014. 7 μ 1Total20. 0μ 1PCR 反应程序为94°C预变性 5min ；94°C变性 30s，57°C复性 30s，72°C延伸 45s， 30cycles ；72°C延伸 7min ；4°C保温。PCR反应结束后，产物经浓度为1. 0 %的琼脂糖凝胶电泳分离后，使用上海生工 的琼脂糖凝胶回收试剂盒按照说明书方法分别回收目的基因，得到的目的片段命名为 sikDh2。如图1、2所示。实施例3 构建sikDh2基因植物表达载体构建植物表达载体PBin438-sikDh2。用BamHI/Sall分别双酶切植物表达载体 pBin438，获得载体片段。回收目的基因片段和载体片段。将目的基因片段与载体片段进行 体外连接，经鉴定正确的重组质粒分别命名为pBin438-sikDh2。在本实施方案中，我们选用 烟草作为转基因植物材料，也可选用其它植物作为转基因材料。如图4、5所示。在本实施方案中，sikDh2基因和pBin438构成一个植物表达载体，用于植物的转 化。根据本发明的这一实施方案，构建所选用的植物表达载体除了 pBin438之外，还可以选 用其他植物表达载体。实施例4 农杆菌的转化4. 1农杆菌感受态的制备1)从新鲜的GV3101平板上挑取一个单菌落于LB液体培养基(5ml)+Rif (50ug/ ml)+Gen(50ug/ml)中，于 28°C、200rpm 振荡培养 48hr ；2)取 200ul 菌液于 20ml 的含 Rif (50ug/ml)及 Gen (50ug/ml)的 LB 液体培养基中活化培养至OD6tltl = 0. 5-0. 8收集菌液，冰浴30min ；3)分装菌液于1. 5ml离心管，于4°C，6000rpm离心5min，弃尽上清，收集农杆菌细 胞；4)将沉淀的农杆菌用750ul预冷的0. 05mol/LCaCl2重悬，4 °C，8000rpm离心 5min ；5)弃上清用75ul 0.05mol/lCaCl2(10%甘油)重悬细胞，保存于_70°C。4. 2植物表达载体转化根癌农杆菌GV3101 (冻融法)1)吸取10 μ 1上述重组载体质粒(约0. 5 μ /g μ 1)，与75 μ 1 GV3101感受态细胞 轻轻混勻，冰浴30min，然后液氮冻存5min ；2)迅速置于37°C水浴2min ；3)加入 600 μ 1 液体 LB 培养基(Rif+Gen)，28°C、200rpm 振荡培养 5hr ；4)将上述培养液于6000rpm离心5min，收集农杆菌细胞，弃去500 μ 1液体培养 基，剩余100 μ 1重悬细胞；5)将菌液涂布在含有 Kan 50 μ g/ml, Rif50 μ g/ml 及 Gen50 μ g/ml 的固体 LB 培 养基平板上，28°C培养24-48hr。4. 3阳性克隆筛选挑取若干单菌落，进行菌落PCR，将筛选出的阳性克隆命名为 pBin438-sikDh2-GV3101。在本实施方案中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。冻融法为本领域技 术人员非常熟悉的技术操作，不是本发明的关键。通过PCR检测阳性的农杆菌菌株，用于转 化植物。如图6所示。实施例5 烟草遗传转化及再生本发明中对于靶植物的转化方法不是关键，可以使用本领域技术人员所熟悉的各 种不同的转化技术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但不仅限于农 杆菌侵染法，微粒轰击法，显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法 等均可。本方案中用于将转化细胞再生成植株的方法，可以使用适合于其他靶植物。最好 使被转化的序列稳定的整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代的过程中不被丢 失。另外，用于转化靶植物的核苷酸序列可以以线性，环形或其它重组载体的形式如人工染 色体的形式存在。5. 1农杆菌浸染液的制备1)从-70°c保存的含有PBin438-sikDh2-GV3101的GV3101农杆菌甘油管中挑取 菌块，接种于5ml附加有Kan 50 μ g/ml, Rif50 μ g/ml, Gen 50 μ g/ml的LB液体培养基中， 28 0C，200rpm 振荡培养约 30hr ；2)吸取 200 μ 1 菌液，再用 20ml LB 液体培养基(Kan 50 μ g/ml，Ri f 50 μ g/ml，Gen 50 μ g/ml)稀释，28°C，200rpm 振荡培养约 4hr ；3)活化的菌液培养至OD6tltl = 0. 4-0. 6时，即为转化用的浸染液。5. 2 浸染1)超净工作台上将浸染液倒入无菌培养皿中，将无菌烟草叶片剪成Icm2大小的方块，放入菌液中，振荡浸染IOmin ；2)取出烟草叶片，用滤纸吸干净叶盘上附着的菌液；3)在共培养基(MS+6-BA2. 0mg/L+IAA0. 3mg/L)上覆一张无菌滤纸，将浸染过的叶 盘均勻地摆放在滤纸上；在26°C暗培养条件下共培养2-3天。5. 3抗性愈伤组织筛选及出芽诱导将共培养过的烟草叶盘转移至MS+6-BA 2. Omg/L+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的烟草诱导选择培养基上，叶盘伤口充分接触培养基。每15-20天转接一次，转接
1-2次以后，叶盘边缘逐渐产生淡绿色、致密的愈伤组织，继续培养直至诱导出丛生芽。5. 4转化植株的生根培养和移栽待丛生芽长至2-3cm左右时，将其切下转接到MS+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的烟草生根选择培养基上进行生根培养。转基因烟草15天左右开始有根生成，待根系发达时，将根系生长良好的转化植 株，去除封口膜，室温环境中进行炼苗7天左右，然后用水洗净培养基，将苗转入基质(蛭 石腐质土 =2 1)中，26°C，16hr 40 μ mol · πΓ2 · s—1光照，70%相对湿度条件下培养，前
2-3天需遮阴、避光、保湿。实施例6 转基因烟草的分子检测6. 1转基因烟草的PCR鉴定6. 1. 1 烟草 DNA 的提取(SDS 法)1)取0. Ig新鲜叶片，用玻棒在1. 5ml离心管内充分研磨；2)加入400 μ 1提取缓冲液，充分混勻，12000rpm离心5min ；3)小心吸取300 μ 1上清液，加入300 μ 1异丙醇，室温沉淀20min, 12000rpm离心 lOmin，收集沉淀；4)将沉淀充分风干，加400 μ 1 TE溶解沉淀；5)加入400 μ 1氯仿/异戊醇(24/1)，充分混勻，静置20min，12000rpm离心 IOmin ；6)小心吸取上清，加入40μ 1 3Μ NaAC(pH5. 2)，800 μ 1无水乙醇，-20°C沉淀过 夜；7)4°C，12000rpm 离心 15min，弃上清；8) 70%酒精洗涤两次，吹干后用30 μ 1 ddH20溶解。6. 1.2转基因烟草的PCR鉴定以提取的转化基因的烟草DNA为模板，用DPl其序列为<210>2和DP2其序列为 <210>3为引物进行扩增，同时以去离子水为模板进行扩增作为阴性对照，扩增体系如实施 例2。如图7所示。6. 2转基因烟草的RT-PCR检测6. 2. 1待检测植株总RNA的提取TIANGEN公司的TRNzol总RNA提取试剂提取已鉴定的转基因烟草和未转化的烟草 总 RNA 1)将研钵及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的枪头、离心管均 使用0. 1 %的DEPC处理，高压灭菌；
2)取植物幼嫩叶片约0. Ig于研钵中，加液N充分研磨至粉末状；3)将粉末分装至1. 5mL的小离心管中，加入Iml的TRNzol提取试剂，充分快速混勻，室温放置3-5min。4) 10000rpm，4°C离心5min，吸上清至一新的离心管，加入200 μ 1氯仿，剧烈振荡 混勻；5) 10000rpm，4°C离心5min，吸取上层液体至另一新的离心管后，加入600 μ 1预冷 的异丙醇，于_20°C沉淀30min ；6) IOOOOrpm,4°C离心IOmin后，倒掉液体，在离心管底部即可见到白色沉淀，即为 总 RNA。7)用70%的乙醇(DEPC处理)洗涤沉淀2次后，吸干液体，吹干后加入30 μ 1 ddH20 (DEPC处理)溶解，保存于_20°C备用。6. 2. 2cDNA 第一链的合成在DEPC 处理的 0. 2ml 离心管中加入 RNA 2 μ 1，dNTP (2. 5mM) 1 μ 1，Oligo dT 1μ l,ddH20 5μ 1后，在70°C水浴5min后迅速置于冰上lmin。然后在离心管中加入Rnase Inhibitor 0. 5 μ 1，AMV 反转录酶 0. 5 μ 1，42°C lhr,95°C 5min 后，冷却至 4°C。7. 2. 3cDNA第二链的合成及扩增在PCR反应管中加入cDNA第一链反应产物1μ l，5XTaq buffer 4 μ 1， MgCl2 (25mM) 1. 0μ 1，dNTP (2. 5mM) 0. 5 μ 1，上下游引物(25ymol)各 0.5 μ 1，ddH20 补足至 20 μ 1，反应条件同实施例2。如图8所示。实施例7转基因植株的模拟寒害处理及叶片质膜透性测定转基因植株被鉴定后，通过无性繁殖获得无菌苗，在MS培养基上生根后。植株成 活后选取生长一致的苗(5-7叶期)，进行模拟寒害处理。分别用打孔器从叶片中打取小圆 片测定叶片质膜透性。如图9所示。实施例8 转基因植株的模拟寒害处理叶片的MDA含量测定转基因植株被鉴定后，通过无性繁殖获得无菌苗，在MS培养基上生根后。MDA是膜 脂过氧化的产物之一，其含量可以表示脂质过氧化的程度。烟草经不同低温温度处理，MDA 的含量均有所提高。不同处理的烟草MDA含量上升幅度依次为21.9%、24.9% ；12.9%, 18.5%。从结果中分析得出，不管是0°C，_4 °C低温处理8hr，野生型烟草比转基因烟草的 MDA含量增加大，说明野生型植株膜质的过氧化程度相对较高。原因可能在于转基因烟草降 低了脂质过氧化的程度。如图10所示。序列表<110>石河子大学<120>天山雪莲sikDh2基因在培育抗寒植物中的应用<160>3<210>1<211>360<212>DNA<213> 天山雪莲(Saurrea. involucrata Kar. et Kir.)<220>
<221>5，UTP<222>(1). . . (9)<220><221>CDS<222>(10)…(339)<220><221>3，UTP<222>(340). . . (360)<400>1Translation of DNAMAN2(10-360)Universal codeTotal amino acid number : 110，MW = 12162Max ORF starts at M pos 3 (nay be DNA pos 10) for 110M(330bases)，MW = 116921 ggatccaaa atg gca caa cac gga tea gga gag cag tac gtg aag gag ggt cac cac ggt1MET Ala Gln His Gly Ser Gly Glu Gln Tyr Val Lys Glu Gly His His Gly70 80 90100 110 12061 aca gac aag tat gtc cgc aat cca ttt cag ate acc cca gta ggt caa gac gtc gga ggt21 Hir Asp Lys Tyr Val Arg Asn Rro Phe Gln lie Hir Pro Val Gly Gln Asp Val Gly Gly130 140 150 160 170 180121 acc gga acc acc gtt caa acg gga gcc get ggt act cac ggc cat gaa gga get ggg aaa41 Hir Gly Hir Hir Val Gln Ihr Gly Ala Ala Gly Hir His Gly His Glu Gly Ala Gly Lys190 200 210 220 230 240181 ggt gtg gtg gag cag ate aag gag aag tta cct ggt ggt gat aat ggt gtc gcc gat gac61 Gly Val Val Glu Gln lie Lys Glu Lys Leu Rro Gly Gly Asp Asn Gly Val Ala Asp Asp250 260 270 280 290 300241 cac aag get gca acc acc acc ggt gat cat ggt gtc gcc gat gga cat aag aag aag gga81 His Lys Ala Ala Ihr Hir Ihr Gly Asp His Gly Val Ala Asp Gly His Lys Lys Lys Gly310 320 330 340 350 360301 gtg atg gag aag ata aag gag aag ttg cca ggg ggt cag aag taa tea ttt cat gtc gac101 Val MET Glu Lys MET Lys Glu Lys Leu Rro Gly Gly Gln Lys * * *<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>2ggatccaaaatggcacaacacggat<210>3<211>29<212>DNA
<213>人工序列<400>3gtcgacatgaaatgattacttctgacccc.
权利要求
一种从天山雪莲中克隆sikDh2基因，其特征在于该基因编码区全长336bp，其序列为<210>1，编码111个氨基酸，5’非编码区3bp，3’非编码区9bp。利用DNAMAN软件对其进行分析，发现其不含有信号肽及跨膜区。
2.一种利用上述基因sikDh2基因构建的植物表达载体。
3.一种从天山雪莲中克隆序列为<210>1的sikDh2基因的用途，其特征在于利用上述 基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得抗寒转基因植物。
全文摘要
本发明涉及一种天山雪莲sikDh2基因在培育抗寒植物中的应用，本发明从天山雪莲中克隆sikDh2基因，利用上述基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得抗寒转基因植物。本发明从天山雪莲中克隆sikDh2基因，并在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗寒性，通过该基因的过量表达，使植物的抗低温胁迫性能得到提高，最终获得抗低温能力明显增强的植物。从天山雪莲中筛选、克隆出与抗寒直接相关的基因，揭示雪莲低温适应性的机制，研究其遗传基础，充分发掘其潜在的基因资源，并将其用于农作物品种改良，具有重要的学术和经济价值。
文档编号C12N15/84GK101818155SQ20091011359
公开日2010年9月1日 申请日期2009年12月22日 优先权日2009年12月22日
发明者刘红玲, 张煜星, 王爱英, 祝建波 申请人:石河子大学