专利名称：利用异源启动子控制大肠杆菌基因组n-乙酰基转移酶表达重组菌及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用异源启动子控制大肠杆菌基因组 N-乙酰基转移酶表达重组菌及应用。
背景技术：
蛋白和多肽的N-末端乙酰化修饰是真核细胞中普遍存在的一种修饰，50%以上的真核细胞胞浆蛋白都有这种修饰。初步的功能研究表明N-末端乙酰化可通过改变N-端的电荷性，封闭N-端等方式，对许多蛋白和多肽的空间结构、配体识别、抗降解等特性产生重要影响。如小分子GIPaes-Arl3P蛋白的N-末端乙酰化修饰促进了其与膜受体Syslp/ hSysl的识别，并使其定位到膜上。胎儿血红蛋白的N-末端乙酰化可以使其四聚体的解聚能力提高30倍。胸腺素α 1 (thymosin α 1, T α 1)的Ν_末端乙酰化对其在血浆中的稳定性具有重要作用。除了 Τα 1外，还有如黑色素细胞刺激素(Melanocyte-Mimulating Hormones, a -MSH)、胸腺素β 4 (Thymosin β 4，T β 4)等一批在临床上具有重要应用的多肽也需要N-末端乙酰化修饰。与真核生物中的普遍存在现象明显不同的是，原核生物的N-末端乙酰化修饰非常罕见。在大肠杆菌内源蛋白中已知发生N-末端乙酰化修饰的只有核糖体亚基L7、S5、 S18、延长因子EF-Tu和伴侣蛋白kcB等为数不多的几种蛋白。大肠杆菌中已经发现的参与蛋白和多肽的N-末端乙酰化修饰的乙酰基转移酶只有负责核糖体亚基S5乙酰化修饰的 RimI，核糖体亚基S18乙酰化修饰的RimJ，和核糖体亚基L7乙酰化修饰的RimL。这些乙酰基转移酶有很强的底物专一性。除上述每个酶对应的特异性底物外，未知其能修饰大肠杆菌的其它蛋白或多肽。胸腺素α是一族具有相同或相似的N-端序列的免疫调节多肽，它们包括胸腺素 α原、胸腺素a 1、胸腺素a 11及其各种融合蛋白等。胸腺素a 1和胸腺素a 11是胸腺素 α原在体内降解的产物，它们分别包括了胸腺素α原的化端观和35个氨基酸。不同物种的胸腺素α具有很高的保守性。胸腺素α的氨基酸序列上某些位点存在多态性，如其 N-端第13位氨基酸残基，有的是苏氨酸，有的是异亮氨酸，它们具有相同或相似的功能。胸腺肽是一类动物胸腺中提取的包含各种胸腺素α及其它胸腺来源肽类的免疫制剂，已广泛用于病毒性肝炎、肿瘤等的治疗。但动物提取的胸腺肽存在成分复杂，纯度低， 其中混有动物来源的污染物，易产生过敏反应等问题。化学合成的N-乙酰化胸腺素al， 是一种采用多肽化学合成方法制备的N-乙酰化胸腺素a 1，此种方法获得的T a 1纯度高、 活性高、没有明显的副反应，如kiClone公司的“日达仙”，已被包括我国在内的多个国家批准用于病毒性肝炎的治疗获作为免疫调节药物；但化学合成N-乙酰化胸腺素a 1这样一个观个氨基酸的多肽，合成和纯化工艺复杂，得率较低，因此制品价格高，限制了该药的广泛应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组菌。本发明提供的一种重组菌，为将胸腺素α的编码基因导入重组菌A中得到的重组菌；所述胸腺素α为一种多肽或蛋白，其N末端的观个氨基酸残基与序列表中序列 3的N末端的观个氨基酸相同或其N末端的观个氨基酸残基与序列表中序列3的N末端的28个氨基酸至少具有90%同源性；所述重组菌A为将外源诱导型启动子插入宿主菌的乙酰基转移酶编码基因的上游，用于启动所述乙酰基转移酶编码基因的表达，得到的重组菌。所述胸腺素α的编码基因通过重组载体导入所述的重组菌A;所述重组载体为将所述胸腺素α编码基因插入表达载体中，得到表达胸腺素α 的重组载体；所述的诱导型启动子为乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酯酶启动子、色氨酸启动子、噬菌体Τ7、P。Pk启动子或含有这些启动子部分元件的杂合启动子Tac、；所述乙酰基转移酶为RimL或RimJ，所述RimL为如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)与a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述RimJ为如下(d)、(e)或(f)所示的蛋白(d)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(e)将序列表中序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(f)与d)或e)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。所述胸腺素α编码基因为一种多核苷酸，其核苷酸序列为序列表中的序列4或与序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸相同或者与序列表中的序列4的5’末端起84 位核苷酸同源性至少具有90%的DNA分子；所述表达载体优选为pBV220或ρΕΤ2^。所述宿主菌为大肠杆菌；所述诱导型启动子为噬菌体Τ7启动子或启动子，所述噬菌体T7启动子的核苷酸序列为序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸或序列表中序列6的自5’ 末端第1119-1135位核苷酸；所述I\PK启动子的核苷酸序列为序列表中序列9的自5’末端第2100-2411位核苷酸。本发明的另一个目的是提供一种重组菌。本发明提供的重组菌，为将外源诱导型启动子插入宿主菌的乙酰基转移酶编码基因的上游，用于启动所述乙酰基转移酶编码基因的表达，得到的重组菌。所述诱导型启动子为乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酯酶启动子、色氨酸启动子、噬菌体Τ7、PL, Pe启动子或含有这些启动子部分元件的杂合启动子Tac、PJV
所述宿主菌为大肠杆菌；所述诱导型启动子为噬菌体T7启动子或启动子，所述噬菌体T7启动子的核苷酸序列为序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸或序列表中序列6的自5’ 末端第1119-1135位核苷酸；所述I\PK启动子的核苷酸序列为序列表中序列9的自5’末端第2100-2411位核苷酸；所述乙酰基转移酶为RimL或RimJ，所述RimL为如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)与a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述RimJ为如下(d)、(e)或(f)所示的蛋白(d)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(e)将序列表中序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(f)与d)或e)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。上述另一个目的提供的重组菌按照如下方法制备1)将pKD46质粒导入宿主菌中，得到重组菌1 ；2)将含有T7启动子的DNA分子或含有启动子DNA分子导入步骤1)得到的重组菌1中，得到重组菌2;3)将步骤2、得到的重组菌2分别在含氯霉素的培养基和含氨苄青霉素的培养基中培养，若能在含氯霉素的培养基上生长，但不在含氨苄青霉素的培养基生长的即为重组菌；所述含有T7启动子的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列5或序列表中的序列6 ；所述含有启动子DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列9。上述重组菌在制备N-乙酰化胸腺素中的应用也是本发明保护的范围。本发明的第三个目的是提供一种制备N-乙酰化胸腺素α的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤发酵所述的重组菌，收集发酵产物，即得到N-乙酰化胸腺素α。所述发酵的温度为42°C，所述发酵时间为12h。本发明的实验证明，本发明构建了 N-乙酰基转移酶和胸腺素α的编码基因进行共表达得到的重组菌，发酵该重组菌，得到胸腺素α均大多为N-乙酰化胸腺素α，不仅可以提高N-乙酰化胸腺素α的产率，而且可以通过减少非乙酰化胸腺素α的比例，方便 N-乙酰化胸腺素α的分离，具有明显的应用前景。
图1为red同源DNA分子1结构示意2为大肠杆菌中T7诱导表达rimL对α乙酰化水平的影响(横坐标表示保留时间(min)，纵坐标代表紫外吸收值(mAU))
图3为red同源DNA分子2结构示意4为大肠杆菌中T7诱导表达rimj对α乙酰化水平的影响(横坐标表示保留时间(min)，纵坐标代表紫外吸收值(mAU))图5为red同源DNA分子3结构示意6为大肠杆菌中ΡΛ诱导表达rimj对α乙酰化水平的影响(横坐标表示保留时间(min)，纵坐标代表紫外吸收值(mAU))
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述的序列均可人工合成。实施例1、利用T7启动子的乙酰基转移酶rimL和胸腺素α原共表达的重组菌采用Red重组技术，将带有乳糖操纵子的T7启动子(来源于PET22b质粒，该质粒购自Novagen公司)插入到大肠杆菌BL21 (DE3)的N-乙酰基转移酶rimL基因开放阅读框 (ORF)的上游，该菌基因组中带有的受乳糖启动子控制的T7RNA聚合酶基因。当培养基中加入乳糖或其类似物，如IPTG时，乳糖启动子控制的T7RNA聚合酶基因表达，合成的T7RNA聚合酶与人为插入到rimL基因开放阅读框(ORF)的上游的T7启动子结合，同时T7启动子下游的乳糖操纵子去阻遏，控制N-乙酰基转移酶rimL基因的高效转录，从而实现N-乙酰基转移酶rimL的过表达。具体方法包括一、两端带有rimLORF上游同源臂和ORF起始区同源臂及FRT位点的氯霉素抗性基因的扩增1、氯霉素抗性基因的PCR扩增。合成引物5Cm AgCgATTgTgTAggCTggAg3Cm TAATTAACggCTgACATgggAATTAg提取BW25141/pKD3 (购自耶鲁大学的CGSC，CGSC#7631)的质粒pKD3为模板，以 5Cm和3Cm为引物进行PCR扩增，得到105^pPCR产物，经测序为序列5的自5’末端第 41-1095位核苷酸，将该PCR产物命名为Cm。2、带有乳糖操纵子的T7启动子DNA片断的PCR扩增合成引物3Cm5T7 cTAATTcccATGTcAGccGTTAATTAtcgagatctcgatcccgcga3T7catatgtatatctccttcttaaag其中3Cm5T7引物带有氯霉素抗性基因3’序列和T7启动子的5’序列。以PET2^质粒为模板，以3T7和3Cm5T7为模板进行PCR扩增，得到的HObpPCR 产物，经过测序，其中T7启动子为序列表中序列5的第1119-1135位核苷酸，将该PCR产物命名为T7。3、带有rimLORF上游同源臂和ORF起始区同源臂的Red重组用DNA的PCR扩增合成引物
5rimLCm AGCCAGGCGGCTTTTTTAACAACTGCATGGATTGACTGGAAgCgATTgTgTAggCTggArimL0RF5pt7 GTMTTCMGTGATTCGCTTACTTTTATCGTTTCAGTCATatgtatatctccttctta其中5rimLCm含有rimLORF上游同源臂(划线部分)和氯霉素抗性基因5’序列， rimL0RF5pt7为rimLORF起始区同源臂(划线部分)和T7启动子5’序列的反向互补序列。以上述获得的制备的DNA片段Cm和DNA片段T7各Iul为模板，以5rimLCm和 rimL0RF5pt7为引物，进行PCR扩增，得到lM6bpPCR产物，经过测序，核苷酸序列为序列5， 命名为Red重组DNAl，结构示意图如图1所示。因扩增的DNA片段中可能混有质粒PKD3，可能造成假阳性现象，所以将回收的DNA 片段用Dpn I 37°C恒温水浴处理lh，以消除质粒pKD3。4、同源重组阳性克隆BL21 (DE3) /T7rimL的获得1)大肠杆菌 BL21 (DE3) /pKD46 的制备将pKD46 质粒(genbank AY048746，其构建方法见 Datsenko KA，PNAS USA2000, 97(12) :6640-5，也可从各种保藏中心获得，如耶鲁大学的CGSC，该中心的带有pKD46质粒的大肠杆菌BW25141/pKD46的保藏号为7634。抗氨苄青霉素。该质粒含有RED重组酶。) 转化BL21(DE3)(购自北京博大泰克生物基因技术有限公司，产品目录号CD601)涂布含氨苄青霉素的LB平板，30°C过夜培养，次日挑取单克隆，提取质粒，送去测序即为pKD46质粒， 将含有该质粒的重组菌命名为BL21 (DE!3)/pKD46。2)两端带有rimLORF上游同源臂和ORF起始区同源臂及FRT位点的氯霉素抗性基因的DNA片段的电转化将上述获得的BL21 (DE3) /pKD46接种于LB培养基中30°C培养至OD6tltlnm约为0. 2， 加入终浓度为0. 2 %的L-阿拉伯糖(L-ara)诱导约Ih (OD600nm小于0. 6)，将细胞置冰中迅速冷却lOmin，以4000rpm于4°C离心lOmin，用冰冷的10%甘油将细胞洗三次，最后将细胞用冰冷的10%甘油浓缩至原菌液体积的1/200，100 μ 1/管分装，-70°C保存备用。每100 μ L感受态细胞加入0. 2-1 μ g上述制备的Red重组DNA，混勻后转至0. Icm电击杯中，用Bio-Iab 电击仪作电击转化。电击后立即加入600 μ 1 LB培养基，150rpm，30°C培养lh，涂布含氯霉素(Cm)的LB平板，37°C过夜培养，pKD46在37°C培养过程中不稳定，可自发丢失，次日挑取单克隆，并再在含氯霉素(Cm)的LB平板上划线培养分离单菌落，即为获得Red重组DNAl 的单克隆。将获得Red重组DNAl的单克隆分别接种含氯霉素(Cm)的LB平板和含氨苄青霉素(Amp)的LB平板，37°C过夜培养，能在Cm平板上生长，但不能在Amp平板生长的即为丢失PKD46质粒的克隆。提取丢失pKD46质粒的克隆的质粒，用合成的鉴定引物5rimLPout和3rimLpout 进行PCR鉴定，5rimLPout GCGTCAAAGAGGTGTAAACT3rimLpout GATAAAGAGGTTTGACGTGA将PCR产物经琼脂糖电泳分析，得到1Kb的为带有Cm基因的T7启动子插入大肠杆菌rimL基因ORF上游的阳性质粒，得到IOObp的为阴性克隆不含有Cm基因的T7启动子，将含有阳性质粒的克隆命名为BL21 (DE3) /T7rimL。5、重组菌 BL21 (DE3)/T7rimL 表达 rimL
将BL21(DE3)/T7rimL用浓度为ImM的IPTG (异丙基-D-硫代半乳糖苷，购自上海生工生物工程技术服务有限公司)诱导(37°c培养培养池后，诱导他)，收集上清，进行 SDS-PAGE电泳，得到20KD的片段，说明表达出rimL。二、利用插入基因组中的T7启动子构建含有表达N-乙酰化胸腺素α原(Thr13) 的重组菌pBV220-proT α (Thr13)按照如下方法制备将ProT α (Thr13)基因(一种胸腺素 α，其核苷酸序列为序列4，其氨基酸序列为序列幻插入pBV220载体(购自上海闪晶分子生物科技有限公司。)的BamHI和EcoRI位点，得到的载体，proT α基因由pBV220载体上的PJ3k启动子控制。将上述获得的质粒pBV220-proTa (Thr13)电击转化入上述一得到的BL21 (DE3)/ T7rimL中，得到转化子，提取质粒，经过测序，为pBV220-prOT a (Thr13)，将含有该质粒的菌命名为 BL21 (DE3) (T7rimL/proT a (Thr13))。用同样方法，将pBV220-proT a (Thr13)电击转化BL21 (DE3)中，得到转化子，提取质粒，结果为pBV220-proT a (Thr13)，将含有该质粒的菌命名为BL21 (DE3) (proT a (Thr13))。实施例2、BL21 (DE3) (T7rimL/proT a (Thr13))制备 N-乙酰化胸腺素 α 原1、蛋白粗提液将BL21 (DE3) (T7rimL/proT a (Thr13))和对照菌 BL21 (DE3) (proT a (Thr13))分别接种于50ml LB液体培养基中，37°C摇床培养过夜，然后转接至含500ml培养基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨10g/L，磷酸二氢钠20mM，磷酸氢二钠30mM)的3L摇瓶中，37 °C培养培养 2h后，加入1. 25ml 0. 2mol/L的IPTG (0. 5mM)诱导，继续培养6h，发酵液离心，收集菌体。将收集的菌体用水重悬(每克菌加IOml水)，超声波破壁，离心收集上清，在上清液中加入冰乙酸调节PH至4. 5，静置30分钟，离心收集上清液，即为蛋白粗提液。2、纯化1)SP FFOl. 6 X 20cm柱纯化(阳离子交换层析)将上述获得的上清液(蛋白粗提液)用SP FFcm.6X20cm柱(介质购自美国GE 公司，空柱购自华美实验仪器厂)进行纯化。具体条件为A液QOmM乙酸钠和乙酸组成的缓冲液，PH4. 5)，B液(A液+IM NaCl)，SP FF柱先用A液平衡，然后从A通道将上述含有 N-乙酰化胸腺素α的粗提液上样至SP FF柱中，再用A液洗去未结合的蛋白，最后在0 — 30 分钟Α从100%— 0% ;Β从100%线性梯度洗脱，分段收集洗脱液。将收集到的各级份洗脱液取样作SDS-PAGE分析和HPLC分析，合并含胸腺素α原的洗脱液(30% -60% B洗脱液中)，获得N-乙酰化胸腺素α原的粗制品。2) RP-HPLC 层析取样进行RP-HPLC层析，采用ΗΡ1090高压液相色谱仪，C18柱6 X 250mm，中科院大连化学物理所)，A液为含0. 1%TFA(体积百分含量)的纯水；B液为含0. 1%TFA(体积百分含量)的色谱纯乙腈，梯度洗脱0min，A 100%, B 0% ；5min，A 82%,B18% ；25min A 78%, B 22% ；28min A0%, B 100% ；30min A0%, B 100% ；31min A 100%, B0%, 214nm 紫外检测，流速为lmL/min，分别收集保留时间为9. 9min的洗脱液，得到A峰样品，收集保留时间为10. Imin的洗脱液，得到B峰样品。
作图如图2所示，图左对照菌BL21 (DE3) (proT α (Thr13))制备的胸腺素α原 (Thr13)；图右:BL21(DE3) (T7rimL/proT α (Thr13))制备的胸腺素 α 原(Thr13)。分别将对照菌和实验菌收集的A峰样品和B峰样品分别用质谱检测，方法 Wu J, Chang S, Gong X, Liu D, Ma二Q. Identification of N-terminal acetylation of recombinant human prothymosin alpha in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 2006 ； 1760 (8) :1241-7.，质谱测定A、B两个组分之间分子量相差42Da，B组分的分子量比A组分大42 (乙酰基的分子量)。质量肽谱确定这种分子量的增加发生在N-端肽段， 用串联质谱对该肽段进行测序发现该肽段为N-端乙酰化修饰的胸腺素α原N-端肽段，发现乙酰化修饰发生在N端第一个氨基酸——丝氨酸残基上。上述结果表明，峰A样品为非乙酰化修饰的胸腺素α原，峰B样品为乙酰化修饰的胸腺素α原。可以看出，A峰样品为非乙酰化胸腺素α原(Thr13) ；B峰样品为N-乙酰化胸腺素 α原(Thr13)，结合图2所示，从图中可以发现，对照菌BL21(DE3) (proT α (Thr13))制备的胸腺素α中N-乙酰化胸腺素α为41% (B峰)，而BL21 (DE3) (T7rimL/proT α (Thr13))制备的胸腺素α中N-乙酰化胸腺素α为82% (B峰)，这种N-乙酰化修饰率的提高，为提高产率提供了基础，因此具有良好的应用前景。实施例3、利用Τ7启动子的乙酰基转移酶rimj和胸腺素α原共表达的重组菌本实施例与实施例1方法类似，也采用Red重组技术，将带有乳糖操纵子的T7启动子(来源于PET22b质粒，该质粒购自Novagen公司)插入到大肠杆菌BL21 (DE3)的N-乙酰基转移酶rimj基因开放阅读框(ORF)的上游，该菌基因组中带有的受乳糖启动子控制的 T7RNA聚合酶基因。当培养基中加入乳糖或其类似物，如IPTG时，乳糖启动子控制的T7RNA 聚合酶基因表达，合成的T7RNA聚合酶与人为插入到rimj基因开放阅读框(ORF)的上游的 T7启动子结合，同时T7启动子下游的乳糖操纵子去阻遏，控制N-乙酰基转移酶rimj基因的高效转录，从而实现N-乙酰基转移酶rimj的过表达。具体方法包括一、两端带有rimJORF上游同源臂和ORF起始区同源臂及FRT位点的氯霉素抗性基因的扩增1、氯霉素抗性基因的PCR扩增，与实施例1中一的1相同，得到1055bp Cm，测序为序列6的自5，末端第41-1095位核苷酸；2、带有乳糖操纵子的T7启动子DNA片断的PCR扩增，与实施例1中一的2相同， 得到140bp含T7启动子的片段，测序，T7启动子为序列6的自5’末端第1118-1138位核
苷酸；3、带有rimj ORF上游同源臂和ORF起始区同源臂的Red重组用DNA的PCR扩增合成引物5rimJPcat CATTTTGGACTTTTCACAGGGTCTGGTTGCGCAGGTATAGArCrATTrTrTArrCTrrA3rimJPcat GTTAAGCGCACTTTTGGCACGTTACTGCGATAGCCAAACATatRtatatctccttctta其中5rimJPCat含有rimJORF上游同源臂(划线部分)和氯霉素抗性基因5’序列，3rimJPcat为rimJORF起始区同源臂(划线部分)和T7启动子5’序列的反向互补序列。以上述制备的DNA片段Cm和DNA片段T7各Iul为模板，5rimJPcat和3rimJPcat为引物，进行PCR扩增，得到1247bpPCR产物，经过测序，核苷酸序列为序列6，命名为Red重组DNA2，结构图如图3所示。4、同源重组阳性克隆BL21 (DE3)/T7rimJ的获得将pKD46 质粒(genbank AY048746，其构建方法见 Datsenko KA，PNAS USA2000, 97(12) :6640-5，也可从各种保藏中心获得，如耶鲁大学的CGSC，该中心的带有pKD46质粒的大肠杆菌BW25141/pKD46的保藏号为7634。抗氨苄青霉素。)转化BL21 (DE3)(购自北京博大泰克生物基因技术有限公司)涂布含氨苄青霉素的LB平板，30°C过夜培养，次日挑取单克隆，提取质粒，送去测序即为PKD46质粒，将含有该质粒的重组菌命名为BL21 (DE3)/ pKD46。2)两端带有rimJORF上游同源臂和ORF起始区同源臂及FRT位点的氯霉素抗性基因的DNA片段的电转化将上述获得的BL21 (DE3) /pKD46接种于LB培养基中30°C培养至OD6tltlnm约为0. 2， 加入终浓度为0. 2 %的L-阿拉伯糖(L-ara)诱导约Ih (OD600nm小于0. 6)，将细胞置冰中迅速冷却lOmin，以4000rpm于4°C离心lOmin，用冰冷的10%甘油将细胞洗三次，最后将细胞用冰冷的10%甘油浓缩至原菌液体积的1/200，100 μ 1/管分装，-70°C保存备用。每100 μ L感受态细胞加入0. 2-1 μ g上述制备的Red重组DNA2，混勻后转至0. Icm电击杯中，用Bio-Iab 电击仪作电击转化。电击后立即加入600 μ 1 LB培养基，150rpm，30°C培养lh，涂布含氯霉素(Cm)的LB平板，37°C过夜培养，pKD46在37°C培养过程中不稳定，可自发丢失，次日挑取单克隆，并再在含氯霉素(Cm)的LB平板上划线培养分离单菌落，即为获得Red重组DNA2 的单克隆。将获得Red重组DNA2的单克降分别接种含氯霉素(Cm)的LB平板和含氨苄青霉素(Amp)的LB平板，37°C过夜培养，能在Cm平板上生长，但不能在Amp平板生长的即为丢失PKD46质粒的克隆。提取丢失pKD46质粒的克隆的质粒，用合成的鉴定引物5rimJPout和3rimJpout 进行PCR鉴定，5rimJPout ACGTCGCTTTGATAGAGAG3rimJpout ACCAGACGCACGACCAGT经琼脂糖电泳分析，得到1Kb的为带有Cm基因的T7启动子插入大肠杆菌rimj 基因ORF上游的阳性质粒，得到IOObp的为阴性克隆不含有Cm基因的T7启动子，将含有阳性质粒的克隆命名为BL21 (DE3)/T7rimJ。5、重组菌 BL21 (DE3) /T7rimJ 表达 rimj与实施例1的一的5方法相同，得到18KD的片段，证明表达出rimj。二、利用插入基因组中的T7启动子构建含有表达N-乙酰化胸腺素α原(Thr13) 的重组菌与实施例1 的二相同，不同的是将 pBV220-proTa (Thr13)转入 BL21 (DE3)/T7rimJ 中，得到 BL21 (DE3) (T7rimJ/proT a (Thr13))。用同样方法，将pBV220-proT a (Thr13)电击转化BL21 (DE3)中，得到转化子，提取质粒，结果为pBV220-proT a (Thr13)，将含有该质粒的菌命名为BL21 (DE3) (proT a (Thr13))。
实施例4、BL21 (DE3) (T7rimJ/proT α (Thr13))制备 N-乙酰化胸腺素 α 原1、蛋白粗提液，与实施例3方法相同；2、纯化1)SP FFOl. 6X20cm柱纯化，与实施例3方法相同;2) RP-HPLC层析，与实施例3方法相同；分别收集保留时间为9. 9min的洗脱液，得到A峰样品，收集保留时间为10. Imin的洗脱液，得到B峰样品。作图如图4所示，图左对照菌BL21 (DE3) (proT α (Thr13))制备的胸腺素α原 (Thr13)；图右:BL21(DE3) (T7rimJ/proT α (Thr13))制备的胸腺素 α 原(Thr13)。分别将对照菌和实验菌收集的A峰样品和B峰样品分别用质谱检测，方法 Wu J, Chang S, Gong X, Liu D, Ma二Q. Identification of N-terminal acetylation of recombinant human prothymosin alpha in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 2006 ； 1760 (8) :1241-7.，质谱测定A、B两个组分之间分子量相差42Da，B组分的分子量比A组分大42 (乙酰基的分子量)。质量肽谱确定这种分子量的增加发生在N-端肽段， 用串联质谱对该肽段进行测序发现该肽段为N-端乙酰化修饰的胸腺素α原N-端肽段，发现乙酰化修饰发生在N端第一个氨基酸——丝氨酸残基上。上述结果表明，峰A样品为非乙酰化修饰的胸腺素α原，峰B样品为乙酰化修饰的胸腺素α原。可以看出，A峰样品为非乙酰化胸腺素α原(Thr13) ；B峰样品为N-乙酰化胸腺素 α原(Thr13)，结合图4所示，从图中可以发现，对照菌BL21(DE3) (proT α (Thr13))制备的胸腺素α中N-乙酰化胸腺素α为40% (B峰)，而BL21 (DE3) (T7rimJ/proT α (Thr13))制备的胸腺素α中N-乙酰化胸腺素α为82% (B峰)，这种N-乙酰化修饰率的提高，为提高产率提供了基础，因此具有良好的应用前景。实施例5、利用PUR启动子的乙酰基转移酶rimj和胸腺素α原共表达的重组菌本实施例与实施例1方法类似，也采用Red重组技术，将带有Ι\ΡΚ启动子(来源于PBV220质粒，购自上海闪晶分子生物科技有限公司公司)插入到大肠杆菌BL21(DE3)的 N-乙酰基转移酶rimj基因开放阅读框(ORF)的上游。当培养基温度上升至42°C时，PlPe 启动子控制N-乙酰基转移酶rimj基因的高效转录，从而实现N-乙酰基转移酶rimj的过表达。具体方法包括一、两端带有rimJORF上游同源臂和ORF起始区同源臂及FRT位点的氯霉素抗性基因的扩增1、氯霉素抗性基因的PCR扩增，与实施例1中一的1相同，得到1055bp Cm，序列9 的自5，末端第41-1095位核苷酸；2、启动子DNA片断的PCR扩增，方法与实施例1中一的2相同，合成引物3Cm5PLCTAATTCCCATGTCAGCCGTTAATTAAGAGCGCCCTTATCTTTCCCTTTAT3PL CCTCCTTAATTTTTAACCAATGCTT以PET22b质粒为模板，以3PL和3Cm5PL为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物， 经过测序，为1342bp，经测序启动子为序列9的自5，末端第2100-M11位核苷酸，将该PCR产物命名为PJV3、带有rimj ORF上游同源臂和ORF起始区同源臂的Red重组用DNA的PCR扩增合成引物5rimJPcat CATTTTGGACTTTTCACAGGGTCTGGTTGCGCAGGTATAGAgCgATTgTgTAggCTggA3rimJPcat GTTAAGCGCACTTTTGGCACGTTACTGCGATAGCCAAACATcctccttaatttttaacc aatgctt其中5rimJPcat含有rimJORF上游同源臂(划线部分)和氯霉素抗性基因5’序列，3rimJPcat为rimJORF起始区同源臂(划线部分)和PJ3k启动子5’序列的反向互补序列。以上述制备的DNA片段Cm和DNA片段PlPk各Iul为模板，5rimJPcat和3rimJPcat 为引物，进行PCR扩增，得到M52bpPCR产物，经过测序，核苷酸序列为序列7，命名为Red重组DNA3，结构图如图5所示。4、同源重组阳性克隆BL21 (DE3)/PLPErimJ的获得将pKD46 质粒(genbank AY048746，其构建方法见 Datsenko KA，PNAS USA2000, 97(12) :6640-5，也可从各种保藏中心获得，如耶鲁大学的CGSC，该中心的带有pKD46质粒的大肠杆菌BW25141/pKD46的保藏号为7634。抗氨苄青霉素。)转化BL21 (DE3)(购自北京博大泰克生物基因技术有限公司)涂布含氨苄青霉素的LB平板，30°C过夜培养，次日挑取单克隆，提取质粒，送去测序即为PKD46质粒，将含有该质粒的重组菌命名为BL21 (DE3)/ pKD46。2)两端带有rimJORF上游同源臂和ORF起始区同源臂及FRT位点的氯霉素抗性基因的DNA片段的电转化将上述获得的BL21 (DE3) /pKD46接种于LB培养基中30°C培养至OD6tltlnm约为0. 2， 加入终浓度为0. 2 %的L-阿拉伯糖(L-ara)诱导约Ih (OD600nm小于0. 6)，将细胞置冰中迅速冷却lOmin，以4000rpm于4°C离心lOmin，用冰冷的10%甘油将细胞洗三次，最后将细胞用冰冷的10%甘油浓缩至原菌液体积的1/200，100 μ 1/管分装，-70°C保存备用。每100 μ L感受态细胞加入0. 2-1 μ g上述制备的Red重组DNA3，混勻后转至0. Icm电击杯中，用Bio-Iab 电击仪作电击转化。电击后立即加入600 μ 1 LB培养基，150rpm，30°C培养lh，涂布含氯霉素(Cm)的LB平板，37°C过夜培养，pKD46在37°C培养过程中不稳定，可自发丢失，次日挑取单克隆，并再在含氯霉素(Cm)的LB平板上划线培养分离单菌落，即为获得Red重组DNA3 的单克隆。将获得Red重组DNA3的单克隆分别接种含氯霉素(Cm)的LB平板和含氨苄青霉素(Amp)的LB平板，37°C过夜培养，能在Cm平板上生长，但不能在Amp平板生长的即为丢失PKD46质粒的克隆。提取丢失pKD46质粒的克隆的质粒，用合成的鉴定引物5rimJPout和3rimJpout 进行PCR鉴定，5rimJPout ACGTCGCTTTGATAGAGAG3rimJpout ACCAGACGCACGACCAGT经琼脂糖电泳分析，得到2Kb的为带有Cm基因的I\PK启动子插入大肠杆菌 rimj基因ORF上游的阳性质粒，得到11Λ的为阴性克隆不含有Cm基因的启动子，将含有阳性质粒的克隆命名为BL21 (DE3)/PLPKrimJ。5、重组菌 BL21 (DE3) /PLrimJ 表达 rimj与实施例1的一的5方法相同，得到20KD的片段，证明表达出rimj。二、利用插入基因组中的I\PK启动子构建含有表达N-乙酰化胸腺素α原(Thr13) 的重组菌与实施例1的二相同，不同的是将pBV220_proT α (Thr13)转入BL21 (DE3) / PLPErimJ 中，得到 BL21 (DE3) (PLPErimJ/proT α (Thr13))。用同样方法，将pBV220-proT α (Thr13)电击转化BL21 (DE3)中，得到转化子，提取质粒，结果为pBV220-proT α (Thr13)，将含有该质粒的菌命名为BL21 (DE3) (proT α (Thr13))。实施例6、BL21 (DE3) (T7rimJ/proT α (Thr13))制备 N-乙酰化胸腺素 α1、蛋白粗提液，与实施例3方法相同；2、纯化1)SP FFOl. 6X20cm柱纯化，与实施例3方法相同;2) RP-HPLC层析，与实施例3方法相同；分别收集保留时间为9. 9min的洗脱液，得到A峰样品，收集保留时间为10. Imin的洗脱液，得到B峰样品。作图如图6所示，图左对照菌BL21(DE3)(proTa (Thr13))制备的胸腺素α原 (Thr13)；图右:BL21(DE3) (PLPErimJ/proT α (Thr13))制备的胸腺素 α 原(Thr13)。分别将对照菌和实验菌收集的A峰样品和B峰样品分别用质谱检测，方法 Wu J, Chang S, Gong X, Liu D, Ma^Q. Identification of N-terminal acetylation of recombinant human prothymosin alpha in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 2006 ； 1760 (8) :1241-7.，质谱测定A、B两个组分之间分子量相差42Da，B组分的分子量比A组分大42 (乙酰基的分子量)。质量肽谱确定这种分子量的增加发生在N-端肽段， 用串联质谱对该肽段进行测序发现该肽段为N-端乙酰化修饰的胸腺素α原N-端肽段，发现乙酰化修饰发生在N端第一个氨基酸——丝氨酸残基上。上述结果表明，峰A样品为非乙酰化修饰的胸腺素α原，峰B样品为乙酰化修饰的胸腺素α原。可以看出，A峰样品为非乙酰化胸腺素α原(Thr13) ；B峰样品为N-乙酰化胸腺素 α原(Thr13)，结合图6所示，从图中可以发现，对照菌BL21(DE3) (proT α (Thr13))制备的胸腺素 α 中 N-乙酰化胸腺素 α 为 40% (B 峰)，而 BL21 (DE3) (PLPErimJ/proT α (Thr13))制备的胸腺素α中N-乙酰化胸腺素α为88% (B峰)，这种N-乙酰化修饰率的提高，为提高产率提供了基础，因此具有良好的应用前景。实施例7、用BL 21 (DE3) /T7rimJ制备各种N-乙酰化胸腺素α采用实施例3的方法制备分别表达下述表1中的各种胸腺素α (各种胸腺素α 的氨基酸序列如下表1所示，这些氨基酸序列与序列表中的序列3的N端观个氨基酸相同或者同源性在90%以上。)的重组菌，采用实施例4的方法进行发酵和检测，结果如下表1 所示表1制备各种N-乙酰化胸腺素α的乙酰化率重组菌名称胸腺索α名称胸腺索α氨基酸序列氨基酸数目N-乙酰化胸腺素α原BL21(DE3) (T7rimJ/NproT )NproTSDAAVDTSSEITTKDLKEKKE WEEAEN GRD APANGNANEENGEQEADNE VDEEE EEGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAES ATGKRAAEDDEDDDVDTKKQKTDEDD10982%BL21(DE3 (T7rimJ/ NproT(Ilel3))NproT(Ilel3)SDAAVDTSSEITIKDLKEKKE WEEAENG RD APANGNANEENGEQEADNE VDEEEE EGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAESA TGKRAAEDDEDDDVDTKKQKTDEDD10983%BL21(DE3) (T7rimJ/NproT -C)NproT-CMSDAAVDTSSEITTKDLKEKKE WEEAE NGRD APANGNANEENGEQEADNE VDEE EEEGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAE SATGKRAAEDDEDDDVD9986%BL21(DE3) (T7rimJ/NproT -G36A,G43A )NproT-G36A,G43AMSDAAVDTSSEITTKDLKEKKE WEEAE NGRD APANANANEENAEQEADNE VDEE EEEGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAE SATGKRAAEDDEDDDVDTKKQKTDEDD.10984%BL21(DE3) (T7rimJ/NproT G36A,G43A-C)NproT G36A,G43A-CMSDAAVDTSSEITTKDLKEKKE WEEAE NGRD APANANANEENAEQEADNE VDEE EEEGGEEEEEEEEGDGEEEDGDEDEEAE SATGKRAAEDDEDDD VD.9986% 从上表中可以看出，按照实施例3的方法制备的重组菌经过发酵均能获得含量高的N-乙酰化胸腺素α。
权利要求
1.一种重组菌，为将胸腺素α的编码基因导入重组菌A中得到的重组菌；所述胸腺素α为一种多肽或蛋白，其N末端的观个氨基酸残基与序列表中序列3的 N末端的观个氨基酸相同或其N末端的观个氨基酸残基与序列表中序列3的N末端的观个氨基酸至少具有90%同源性；所述重组菌A为将外源诱导型启动子插入宿主菌的乙酰基转移酶编码基因的上游，用于启动所述乙酰基转移酶编码基因的表达，得到的重组菌。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于所述胸腺素α的编码基因通过重组载体导入所述的重组菌A;所述重组载体为将所述胸腺素α编码基因插入表达载体中，得到表达胸腺素α的重组载体；所述的诱导型启动子为乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酯酶启动子、色氨酸启动子、噬菌体Τ7、ΡρΡκ启动子或含有这些启动子部分元件的杂合启动子Tac、PJ\ ；所述乙酰基转移酶为RimL或RimJ，所述RimL为如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)与a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述RimJ为如下(d)、(e)或(f)所示的蛋白(d)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(e)将序列表中序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(f)与d)或e)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于所述胸腺素α编码基因为一种多核苷酸，其核苷酸序列为序列表中的序列4或与序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸相同或者与序列表中的序列4的5’末端起84位核苷酸同源性至少具有90%的DNA分子；所述表达载体优选为PBV220或pET22b ；所述宿主菌为大肠杆菌；所述诱导型启动子为噬菌体T7启动子或启动子，所述噬菌体T7启动子的核苷酸序列为序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸或序列表中序列6的自5’末端第1119-1135位核苷酸；所述动子的核苷酸序列为序列表中序列9的自5’末端第 2100-2411位核苷酸。
4.一种重组菌，为将外源诱导型启动子插入宿主菌的乙酰基转移酶编码基因的上游， 用于启动所述乙酰基转移酶编码基因的表达，得到的重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述诱导型启动子为乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酯酶启动子、色氨酸启动子、噬菌体17、&、&启动子或含有这些启动子部分元件的杂合启动子Tac、PJV
6.根据权利要求4或5所述的重组菌，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌；所述诱导型启动子为噬菌体T7启动子或启动子，所述噬菌体T7启动子的核苷酸序列为序列表中序列5的自5’末端第1119-1135位核苷酸或序列表中序列6的自5’末端第1119-1135位核苷酸；所述动子的核苷酸序列为序列表中序列9的自5’末端第 2100-2411位核苷酸；所述乙酰基转移酶为RimL或RimJ， 所述RimL为如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)与a)或b)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白； 所述RimJ为如下(d)、(e)或(f)所示的蛋白(d)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(e)将序列表中序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(f)与d)或e)限定的氨基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。
7.权利要求1-6中任一所述的重组菌在制备N-乙酰化胸腺素α中的应用。
8.一种制备N-乙酰化胸腺素α的方法，包括如下步骤发酵权利要求1-3中任一所述的重组菌，收集发酵产物，即得到N-乙酰化胸腺素α。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于 所述发酵的温度为42°C，所述发酵时间为12h。
全文摘要
本发明公开了一种利用异源启动子控制大肠杆菌基因组N-乙酰基转移酶表达重组菌及应用。本发明提供的重组菌，为将外源诱导型启动子插入宿主菌的乙酰基转移酶编码基因的上游，用于启动所述乙酰基转移酶编码基因的表达，得到的重组菌。本发明的实验证明，本发明构建了N-乙酰基转移酶和胸腺素α的编码基因进行共表达得到的重组菌，发酵该重组菌，得到胸腺素α均大多为N-乙酰化胸腺素α，具有明显的应用前景。
文档编号C12N1/21GK102352337SQ20111022140
公开日2012年2月15日 申请日期2011年8月3日 优先权日2011年8月3日
发明者刘波, 吴军, 唱韶红, 巩新, 马清钧 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所