检测肠道病毒中和抗体的方法及其专用重组病毒的制作方法

专利名称：检测肠道病毒中和抗体的方法及其专用重组病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测肠道病毒中和抗体的方法及其专用重组病毒。
背景技术：
肠道病毒71 型(enterovirus71,EV71)及柯萨奇病毒 A16 (coxsackievirus A16,CA 16)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员，它们是在儿童中引发手足口病(hand and foot and mouth disease,HFMD)主要的两种病原。我国在20世纪80 90年代流行的HFMD病原体以CA 16为主，但是自2008年以来，中国内地很多地区出现手足病的局部暴发，基本上是EV71和CA16的共循环所致(曲梅，李洁，贾蕾，檀晓娟，高志勇，严寒秋，郭婧，李锡太，黎新宇，王全意，许文波，黄芳；北京市2009年手足口病的病原构成及柯萨奇A组16型病毒基因特征分析；病毒学报；第26卷第6期；432-436页)。手足口病的免疫保护以特异性中和抗体为主，血清中和抗体水平是判断人群及个体对EV71敏感性的重要指标；手足口病中和抗体的检测也是疾病确诊的重要依据。另一方面，因为手足口病主要危害低龄儿童，病死率又高，针对EV71和CA16的疫苗的研制十分紧迫。而疫苗能否在体内诱导出高滴度的中和抗体是疫苗评估和质量控制的重要依据。因此开发出适合于快速，大规模地检测EV71和CA16病毒的中和抗体滴度的方法十分重要。目前比较常用的检测中和抗体效价的方法有三大类病毒中和试验，酶标记检测方法，抗原-抗体间接凝集抑制试验。(English reference Stanley, Plotkin, WalterOrenstein, Paul Offit ；Vaccines, Fifth edition ；poliovirus vaccine(inactivated,IPV)Page 618-19 ;查锦芬，肖长义，佐满珍；疫苗中和抗体体外检测方法的研究进展；中国 医药生物技术2008年10月第3卷第5期；374-377页)。病毒的中和试验是一种以比较病毒受血清中和后残存的感染力为依据，进而判定免疫血清中和病毒能力的方法。早期的病毒中和试验用动物接种，检测病毒感染后血清中残留病毒的感染力，现在已全部被细胞水平的中和试验代替。此类方法均以判定残留的病毒感染力作为标准，主要包括以下几种方法1.细胞病变中和试验。通过观察中和抗体中和病毒后的细胞病变程度来判定血清中和抗体的水平。但是观察到细胞病变需要时间较长，且受观察者主观因素的影响较大，并且很难根据细胞病变的程度对于中和抗体的活性给出一个定量的评估。2.斑点减少中和试验。正常细胞代谢时会摄入活性染料，但是在病毒感染导致细胞死亡时，细胞会丧失该能力，从而形成无色的噬斑。所以，如果病毒被中和的话，病毒感染导致的噬斑就会减少。与细胞病变一样，产生噬斑的时间也较长，因而根据其数量的变化从而判断残存的感染力同样也需要较长时间，而且受观察者主观因素的影响较大。3.快速突光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)。将一定量的病毒与系列稀释的待测血清在体外中和后，加入敏感细胞孵育，最后用荧光标记的针对病毒衣壳蛋白的抗体染色，以检测未被抗体中和的残余病毒量(荧光灶)，最后与病毒对照组相比较，可以算出各种待测血清降低病毒的荧光灶50%的稀释度。最后与已知中和抗体滴度的参照血清比较，最终算出每种待测血清的中和抗体滴度(SirkkaVene, Mats Haglund, Ake Lundkvist, Lars Lindquist, Marianne Forsgren ；Study ofthe serological response after vaccination against tick-borne encephalitis inSweden ；Vaccine 25(2007)366-372)。病毒中和试验是WHO规定的目前检测中和抗体的参考方法，但该试验不仅耗时，而且由于试验中多使用活病毒，所以还需要相应的生物安全设备。试验对技术人员操作的要求高，成本也较昂贵，不适合大规模的筛选试验。此外，活病毒的传代易造成病原漂变，不利于试验的均一性。酶标记检测方法可用于大量快速的中和抗体的定量检测。主要的酶标记检测方法有1. ELISA方法。ELISA方法既简单(不需要特殊的试验设备)又安全(不需要活病毒)、可快速,定量检测抗体。Muhamuda等利用小鼠中和性单克隆抗体和人体免疫后血清抗体之间的竞争性建立了竞争性ELISA(即C-ELISA)方法检测狂犬病疫苗中和抗体，增加了ELISA 方法的特异性(Kader Muhamuda, Shampur Narayan Madhusudana*, VasanthapuramRavi ；Development and evaluation of a competitive ELISA for estimation of rabies neutralizing antibodies after post-exposure rabies vaccination in humans ；International Journal of Infectious Diseases (2007) 11，441-445) 2.中和组织培养酶联免疫测定法。2005 年，Eyal 等(Osnat Eyal, Udy Olshevsky，Shlomo Lustig, NirParan, Menachem Halevy, Paula Schneider， Gil Zomber, Pinhas Fuchs ；Developmentof a tissue-culture-based enzyme-immunoassay method for the quantitation ofanti-vaccinia-neutralizing antibodies in human sera ；Journal of VirologicalMethods 130(2005) 15-21)提出了一个灵敏、可重复性高且快速的用来检测抗牛痘病毒中和抗体的中和组织培养酶联免疫测定方法(neutralization tissue-culture enzymeimmunoassay, NTC-EIA)。该方法的主要步骤为用连续不同稀释度的血清中和一定量的牛痘病毒，再感染敏感细胞。最后再用ELISA方法测定残余病毒的量。3.酶联免疫斑点(enzyme-linked immunospot，ELISP0T)。Abai 等(Anna Maria Abai,Larry R. SmithiMaryK. Wloch Journal of Immunological Methods 322 (2007) 82-93)用 ELISP0T 的方法建立了适合在临床上评估HCMV疫苗效价的一种高通量微量中和试验方法。酶标记检测类的方法中ELISA的方法虽然有诸多优点，但是使用病毒的糖蛋白做ELISA检测，其结果与病毒中和试验的一致性欠佳。而其他相关性较高的酶标记检测方法则需要用到活病毒，这对技术人员的操作和安全设备要求比较高。此外，活病毒的传代易造成病原漂变，不利于试验的均一 f生。抗原-抗体间接凝集抑制试验利用抗原与抗体混合后不能再与致敏颗粒结合，因此不会出现凝集现象的原理检测中和抗体的滴度。Stephenson等(Iain Stephenson，RoseGaines Das, John M. Wood, Jacqueline M. Katz ；Comparison of neutralising antibodyassays for detection of antibody to influenza A/H3N2 viruses An internationalcollaborative study ；Vaccine 25 (2007) 4056-4063)比较了用于检测抗流感病毒中和抗体的 HI (haemagglutinin inhibition)试验和病毒中和(virus neutralization, VN)试验之间的可重复性，他们分别用这2种方法对8个国家11个试验室的血清样本进行了检测。HI法测定的抗体滴度可重复性较好，而VN法则在敏感性上优于HI法；HI法的另外一个缺点是每次观察凝集现象都必须釆用新鲜的血细胞。此外，不是所有病毒的中和抗体都能抑制血凝作用，因此该方法比较适合配合病毒的中和试验一同使用，也不大适合于大规模的中和抗体的筛选试验。目前检测中和抗体的方法如活病毒的中和试验多采用完全具有传染性的病毒，此类方法的结果虽然可靠，但是缺点是活病毒在传代过程中易发生抗原漂移，更重要的是在试验操作过程中有危险性，因此对于技术人员的操作和安全设备都要求较高。而其他一些不需要用到活病毒的检测方法也存在各种缺陷。例如与作为标准的病毒中和试验的结果相关性不好(ELISA法)，操作繁琐(抗原-抗体间接凝集抑制试验)，成本昂贵(快速荧光灶抑制试验)，因此不适合大规模的快速筛选。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA分子。本发明所提供的DNA分子，是将肠道病毒属病毒的基因组RNA对应的cDNA中的所有结构蛋白的编码基因替换为报告基因得到的重组DNA。 所述DNA分子为如下I)或2)所示所述DNA分子是将肠道病毒71型的基因组RNA对应的cDNA中的所有结构蛋白的编码基因替换为报告基因得到的重组DNA;所述所有结构蛋白的氨基酸序列为序列表中序列I所示。所述报告基因为荧光素酶报告基因；所有结构蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因I)其核苷酸序列为序列表中序列2第733位到3315位所示；2)在严格条件下与I)所示的基因杂交且编码所述结构蛋白的基因；3)与I)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述结构蛋白的基因；所述荧光素酶基因的核苷酸序列如序列表中序列3第771位到2420位所示。所述DNA分子为序列表中序列3第I位到6544位所示的DNA分子。含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。所述重组载体为在载体P⑶NA6/HisA的多克隆位点间插入所述DNA分子得到的重组载体。本发明的另一个目的是提供一种用于检测肠道病毒中和抗体的组合物。本发明用于检测肠道病毒中和抗体的组合物，为组合物A或组合物B ；所述组合物A为如下I)或2)或3)所示I)由权利要求1-4中任一所述的DNA分子和权利要求1_3中任一所述的所有结构蛋白的编码基因组成的组合物；2)由权利要求1-4中任一所述的DNA分子和柯萨奇病毒A16的所有结构蛋白I的编码基因组成的组合物；所述所有结构蛋白I的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5第733位到3315位所示；3)由权利要求1-4中任一所述的DNA分子和融合基因I组成的组合物；所述融合基因I为如下a)或b)所示a)所述融合基因I是由报告基因、肠道病毒的2APM蛋白酶的识别位点和权利要求1-3中任一所述的所有结构蛋白的编码基因依次连接而成；
b)所述融合基因I是由报告基因、肠道病毒的2APM蛋白酶的识别位点和柯萨奇病毒A16的所有结构蛋白I的编码基因依次连接而成；所述所有结构蛋白I的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5第733位到3315位所示；所述组合物B为由权利要求5所述的重组载体和重组载体I组成的组合物；所述重组载体I为如下c)或d)或e)所示c)含有权利要求1-3中任一所述的所有结构蛋白的编码基因的重组载体；d)含有柯萨奇病毒A16的所有结构蛋白I的编码基因的重组载体；所述所有结构蛋白I的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5第733位到3315位所示；e)含有所述融合基因I的重组载体。所述融合基因I中所述报告基因为绿色荧光蛋白的编码基因；该绿色荧光蛋白基 因也可以替换为其它种类的荧光蛋白或者报告基因。所述肠道病毒的2APM蛋白酶的识别位点如序列表中序列3第3342位到3356位所示或序列表中序列5第718位到732位所示；所述绿色荧光蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2第I位到717位所示或序列表中序列5第I位到717位所示；所述融合基因I的核苷酸序列如序列表中序列2第I位到3315位所示或序列表中序列5第I位到3318位所示。本发明的又一个目的是提供一种重组病毒。本发明所提供的重组病毒，是将所述用于检测肠道病毒中和抗体的组合物在离体的哺乳动物细胞中包装得到的重组病毒。所述重组病毒是将所述用于检测肠道病毒中和抗体的组合物在293T细胞中包装得到的重组病毒。所述DNA分子、所述表达盒、所述重组载体、所述转基因细胞系、所述重组菌、所述重组病毒、所述组合物或所述重组病毒在检测肠道病毒中和抗体中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种检测肠道病毒中和抗体的方法。本发明所提供的检测肠道病毒中和抗体的方法，包括以下步骤将所述重组病毒与系列稀释的待测抗体混合，得到混合物；用所述混合物感染对肠道病毒敏感的细胞，根据所述对肠道病毒敏感的细胞中报告基因的表达物所产生的信号定性检测待测抗体的有效性或定量检测待测抗体的效价。本发明的又一个目的是提供一种检测肠道病毒中和抗体的试剂盒。本发明所提供的检测肠道病毒中和抗体的试剂盒，含有所述DNA分子、所述表达盒、所述重组载体、所述转基因细胞系、所述重组菌、所述重组病毒、所述组合物或所述重组病毒。本发明利用EV71 FY的假病毒系统和Cox A16假病毒系统检测中和抗体的方法由于采用了单周期感染的假病毒，所以没有使用活病毒时的安全问题。中和试验的病毒残余量则对应于进入细胞内的病毒RNA亚基因组(删除了结构基因，而代替以荧光素酶基因的病毒基因组)在细胞内表达得到荧光素酶的量。向细胞裂解液加入荧光素酶的底物发生化学发光反应后，荧光素酶的量可由化学发光仪精确定量。荧光素酶化学发光反应读数的对数在较大范围内和残留的病毒量有良好的线性关系。试验过程操作简便，对技术人员要求不高。从成本来说，该方法也比较低廉，可以在96孔细胞内进行大规模的筛选试验。经过多个试验，其结果表明该发明中所陈述的假病毒系统是一种安全，灵敏，快速，特异，简便且成本低廉的检测中和抗体的方法。基于以上特点，该假病毒系统非常适合于快速，大规模地检测中和抗体的试验，对于病毒疫苗的研制及检测患者个体及人群手足口病特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。本发明的方法还 具有以下优点(I)易于标准化产生假病毒时，只需要先对293T细胞转染包含了假病毒的结构基因的质粒，然后再转染病毒的RNA复制子。病毒的结构蛋白基因被构建在质粒上，可以在_20°C稳定地贮存。因此假病毒系统可以克服活病毒在传代过程中易发生抗原漂移的缺点。因此采用假病毒系统做中和抗体的检测，试验的稳定性高，易于标准化。(2) 一致性平行地用野生型活病毒和EV71 FY假病毒检测一组血清的中和抗体。比较双盲试验结果，发现相关性很高。这说明假病毒系统在检测病毒中和抗体时与经典的活病毒中和试验有很好的一致性。(3)简便假病毒的中和试验可以在96孔细胞培养板上进行，每种血清的不同稀释梯度可以做多个复孔，从统计学的角度来讲可以消除孔间差异。假病毒和检测样品的混合物加入细胞培养板后10-20小时，即可将用裂解液裂解细胞，并用排枪取5-10ul裂解样品用于化学发光仪的读数。获取数据时，只需要用化学发光仪自动读取荧光素酶化学发光反应的读数即可。化学发光反应所需要的试剂包括裂解液，荧光素酶的底物，荧光素酶的反应缓冲液，成本低廉。因此假病毒系统检测中和抗体方法快速简便而且数据可靠，成本低廉
MTv ο(4)单周期感染假病毒颗粒的包装系统由两部分组成。一个质粒上构建了病毒的结构蛋白基因，另一个质粒上构建了病毒的RNA复制子。EV71 FY的假病毒进入细胞时将脱衣壳，并把病毒的复制子RNA释放到细胞内部。复制子的5’末端为核糖体内部进入位点(IRES)。因此，该元件后的荧光素酶以及非结构蛋白基因都可以被细胞内的核糖体直接翻译。非结构蛋白被翻译后可帮助复制子在细胞内进行复制。假病毒颗粒内的单链正义RNA基因组的结构蛋白基因被删除了，并且为荧光素酶基因所代替。因此，假病毒在单次侵入细胞之后，不能够翻译出结构蛋白，所以无法组装出新的感染性病毒颗粒。假病毒感染系统消除了活病毒首次感染后，重复进入细胞的问题。在同一种细胞系上进行感染试验时，假病毒最终感染细胞所得的荧光素酶化学发光反应的读数只受到病毒颗粒在侵入细胞时受到干扰因素(如抗体中和)的影响。(5)特异性用特异性和非特异性的抗血清对EV71 FY假病毒做中和试验，试验结果表明EV71 FY的假病毒能够选择性地被EV71 FY的特异中和抗体所中和，但是不能够被非特异的抗血清中和。所以，EV71 FY的假病毒表现出很好的检测到特异性中和抗体的作用。(6)高灵敏度假病毒系统对于检测中和抗体有很高的灵敏度。试验过程中，保持病毒量不变，将血清稀释IO5至IO6倍后，仍然能够特异性中和EV71 FY的假病毒。所以，仅需少量的血清便检测血清中特异的中和抗体。


图I为融合基因I和融合基因II的结构图。图2为定性检测肠道病毒EV71中和抗体的有效性的结果。图3为EV71 FY假病毒系统的特异性检测结果。图4为定量检测肠道病毒EV71的中和抗体的效价的结果。图5为EV71 FY假病毒系统的线性范围。图6为EV71 FY假病毒的沉降系数。图7为Cox A16假病毒系统的特异性检测结果。 图8为野生型EV71 FY活病毒和EV71 FY假病毒中和试验的一致性检测结果。图9为EV71 FY假病毒系统和Cox A16假病毒系统的特异性比较结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。RD细胞(来源于人横纹肌肉瘤)(购自ATCC，产品目录号为CCL-136 )和293T细胞(来源于人胚胎肾细胞)(购自ATCC，产品目录号为CRL-11268 )在10% FBS(胎牛血清，购自GIBC0，产品目录号为10099-141)的DMEM中培养。RD细胞为用于检测中和抗体试验的敏感细胞系。293T细胞被用来包装EV71的假病毒。实施例I、检测肠道病毒EV71的中和抗体一、定性检测肠道病毒EV71的中和抗体的有效性及定量检测肠道病毒EV71的中和抗体的效价I、构建EV71FY结构蛋白表达质粒和EV71FY复制子质粒(I)制备 EV71 FY cDNA取EV71 FY的活病毒EV71/Fuyang. Anhui. P. R. C (公众可从北京生命科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是Zhang, Y. , Zhu, Z. , Yang, ff. , Ren, J. , Tan, X. , Wang,Y. , Mao, N. , Xu, S. , Zhu, S. , Cui, A. , Zhang, Y. , Yan, D. , Li, Q. , Dong, X. , Zhang, J. , Zhao,Y. , Wan, J. , Feng, Z. , Sun, J. , Wang, S. , Li, D. and Xu, ff. An emerging recombinant humanenterovirus 71 responsible for the 2008outbreak ofhand foot and mouth diseasein Fuyang city of China. Virol. J. 7,94(2010))培养液。EV71 FY 的 RNA 用 TrizolReagent (购自Invitrogen，产品目录号为15596-018)提取。所得的RNA被用作反转录PCR的模板，用Random Pimer(购自Takara,产品目录号为3801)作为引物，反转录出cDNA。(2)构建 EGFP EV71 FY pCDNA6. OA根据国内几个EV71 FY序列的比对结果，通过PCR的办法克隆EV71 FY全基因组，并在病毒基因组结构蛋白N端插入EGFP基因。EGFP和EV71结构蛋白基因序列之间插入2APM的蛋白酶酶切位点。最后将EGFP EV71 FY克隆到pCDNA6. OA(购自Invitrogen，产品目录号为V22001)上。克隆EGFP EV71 FY pCDNA6. OA所用的引物为T7EV715， -f 5’ -CAGAGGTAGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTG-3’，EV713，PolyA-b
5’ -GTGCAACCCGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTATTCTGGTTATAACAAA-3’。(3)构建EV71 FY结构蛋白表达质粒将绿色荧光蛋白(EGFP)的基因序列与EV71 FY所有结构蛋白的基因序列拼接，并将2A_蛋白酶的酶切位点插入EGFP基因的C末端，拼接得到融合基因I (图I中A)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，其中第I位到717位为绿色荧光蛋白的编码基因；第718位到732位为EV71 FY的2ApM蛋白酶的识别位点；第733位到3315位为EV71 FY所有结构蛋白的编码基因，编码由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质，即EV71 FY的所有结构蛋白(图I中A的VP4、VP2、VP3和VPl表示EV71 FY的所有结构蛋白)。同时，通过引物在拼接得到DNA片段的5’端和3’端分别引入NheI和AgeI酶切位点；将引入酶切位点后的融合基因I用NheI (购自New England BioLabs ;产品目录号为R0131)和AgeI (购自New England BioLabs ;产品目录号为R0552)酶切，克隆到pCDNA6/HisA的载体(购自Invitrogen,产品目录号为V22001)上,得到重组质粒。重组质粒验证方法1.挑单克隆，并摇菌，提质粒；2.用NheI和AgeI对重组质粒进行双酶切鉴定；3.挑选酶切图谱正确的克隆 送奥科测序公司进行测序。将得到的重组质粒命名为pEGFP EV71 FY Capsid0引入NheI和AgeI酶切位点所用的引物如下FY-capsid-GFP-NheI-f :5，-CCCGGGCTAGCACCGCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3，，FY-capsid-GFP-AgeI_b : 5 ’ -GACGGACCGGTTTAAAGAGTGGTGATCGCTGTGC-3，。(4)构建EV71 FY复制子质粒构建含有表达荧光素酶基因的EV71FY的复制子质粒，方法如下将EV71 FY的5’ UTR，荧光素酶基因和EV71 FY基因组的非结构蛋白基因及其之后的序列用重叠PCR方法拼接，得到融合基因II，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中第29位到770位为EV71 FY的5’ UTR核苷酸序列；第771位到2420位为荧光素酶基因的核苷酸序列 ’第2421位到2435位为EV71 FY的2ΑΡ1Γ°蛋白酶的识别位点；第2436位到6431位为EV71 FY非结构蛋白的编码基因；同时在所得到的融合基因II的5’ UTR前引入T7promoter的序列，以用于体外转录(图I中B，其中2A、2B、2C、3A和3B表示EV71 FY非结构蛋白基因)。克隆EV71 FY复制子的步骤1.以构建好的EGFP EV71 FY pCDNA6. OA为模板进行PCR扩增，分别得到EV71 FY的5，UTR(UTR, untraslated region ;非编码区)，非结构蛋白基因，3’UTR;以pLuc(购自Agilent Technologies，产品目录号为219087)为模板扩增firefly Iuciferase基因。2.将第一步所得到的片段通过PCR拼接起来得到EV71FY-Fluc. 3.将片段 EV71 FY-Fluc 用 NotI (购自 New England BioLabs，产品目录号为R0189)和XmaI (购自New England BioLabs，产品目录号为R0180)酶切，并克隆到pCDNA6/HisA(购自Invitrogen，产品目录号为V22001)上。克隆鉴定方法1.挑取单克隆，并摇菌，提质粒。2.用NotI和XmaI对所得重组质粒用酶切鉴定。3.挑选酶切图谱正确的单克隆测序。测序结果表明，在P⑶NA6/HisA载体上插入了序列表中序列3所示的DNA序列，说明重组质粒构建正确，将所得的重组质粒命名为PEV71 FY-Fluc pCDNA6/HisA。2、DNA 的转染转染前12-14小时在IOcm2的细胞培养板上接种293T细胞。转染当天，293T的密度应该达到60-70%。转染前一小时，用无抗生素的10% FBS-DMEM (购自Invitrogen公司，产品目录号为 11965500BT)培养 293T 细胞。用 Lipofectamine 2000 transfectionreagent (购自 Invitrogen，产品目录号为 11668-019)转染 24 μ g重组质粒pEGFP EV71FYcapsid，在37°C细胞培养箱内培养。转染后4小时，换成10% FBS-DMEM培养20小时。在荧光显微镜下观察EGFP荧光蛋白从而判断结构蛋白的表达水平。3、RNA复制子的产生以及假病毒的包装假病毒的包装需首 先在体外转录出EV71 FY的RNA复制子。而要体外转录反应需先得到相应的DNA模板。纯化该RNA复制子的DNA模板步骤如下(I)将 pEV71 FY-Fluc pCDNA6/HisA 用 SmaI (购自 New England BioLabs，产品目录号为R01141V)在25°C下消化10小时。(2)向该体系中加入SDS溶液(购自Amresco，产品目录号为0227)和蛋白酶K(购自Qiagen，产品目录号为19131)。SDS终浓度为O. 5%，蛋白酶K的终浓度为100_200ug/ml ο 50-55 °C 消化 30min。(3)加与酶切反应体系等体积的酚/氯仿/异戊醇(25 24 I)溶液，剧烈混勻，12000-15000rpm 离心 IOmin0(4)重复步骤2。(5)取上清液，加入0.7倍体积冷异丙醇(_20°C )或2倍体积冷无水乙醇(-20 0C )。(6)加入 1/10 体积的 3M NaAc (PH5. 2)，置于-80°CT 60min。(7) 12000-15000rpm, 4°C离心 IOmin(8)倒弃液体留下沉淀，用冷70 %乙醇洗涤沉淀(9)弃去乙醇，并在超净台内将DNA吹干。(10)用适量的水溶解所得DNA沉淀，分装成小体积，_20°C保存。由如上步骤所得的线性的DNA可作为体外转录试验的DNA模板。以线性化的 pEV7IFY-Fluc pCDNA6/HisA 为模板，使用 RiboMAX Large Scale RNA ProductionSystem-T7 (购自Promega,产品目录号为P1300)体外转录出单链正义RNA,用无RNase的无水乙醇沉淀该RNA。弃乙醇，待管内残留的乙醇挥发尽后，用适量的无RNase的水(购自TAKARA，产品目录号为D602)溶解RNA沉淀，分装并储存在_80°C备用。用Lipofectamine 2000transfection reagent (购自 Invitrogen,产品目录号为 11668-019)转染10 μ g RNA到已经转染了 pEGFP EV71FY capsid的293T细胞内。4小时后，将培养基换成2% FBS-DMEM。24小时后，将细胞上清收集到15ml管中，在细胞表面留下约500ul的培养基。用剩余培养基将293T细胞重悬起来，并用干冰反复快速冻融两次。将之前收集的培养基上清和冻融过的沉淀混匀，然后再用离心机2，500g离心5分钟，弃沉淀，收集上清，并分装到I. 5ml的EP管中，贮存在_80°C冰箱备用。4、假病毒的中和试验在96孔的细胞培养板(购自Becton Dickinson，产品目录号为353078)上接种RD细胞，放在37°C，5% CO2的细胞培养箱内培养。接种时，需注意保证细胞均匀的分布在培养板上。感染当天，细胞需达到80%左右的密度。在I. 5ml的EP管中稀释待测抗血清(SI、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、Sll、S12、S13、S14、S15)(以上待测血清均来自中国食品药品检定研究院；不同的工艺制备的疫苗对SPF级的兔子进行免疫，然后取血得到的血清和几株未经过抗原免疫的兔血清作为阴性对照血清；注该实验过程为双盲实验，故做活病毒中和实验的一方和假病毒中和实验的一方都不知道血清具体来源，以保证该实验结果的可信度；根据实验结果推断可知S6、S7、SlO和S15均为阴性对照血清)。用2%FBS-DMEM三倍倍比稀释4个梯度的抗血清I : 60，I : 180，I 540，I 1620。按照每孔加40ul的血清的量计算。阴性对照血清采用抗乙型脑炎病毒的兔血清(用乙型脑炎疫苗(国药准字S10900004 ;采用的是流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2减毒株)对SPF级的兔子进行免疫，取血得到的血清)，也用2%FBS DMEM去稀释同样的4个梯度。假病毒原液用2% FBS-DMEM稀释，按照每孔加IOul病毒原液计算，置于冰上。用排枪向一个未铺细胞的96孔的细胞培养板加入每孔40ul的稀释好的待测血清，然后每孔加入70ul稀释好的假病毒原液。假病毒阳性对照，则加入40ul的2% FBS-DMEM与70ul假病毒稀释液混合。假病毒空白对照，则加入100ul2% FBS-DMEM。采用I : 540和I : 1620稀释梯度的血清做中和试验，每个梯度的血清做四个复孔，其他对照组也同样做四个复孔。用排枪上下吹吸或轻微振荡的方式混匀假病毒与抗血清，然后将其于4°C冰箱中静置I个小时。弃掉RD细胞表面的培养基，并且将假病毒和稀释血清的混合物加到铺有RD细胞的96孔板上，每孔加入IOOul。感染20小时后，弃掉细胞表面的培养上清，向每孔加入50ul的lxPassive LysisBuffer (购自Promega，产品目录号为E1941)，用手轻微振荡，于4°C静置5分钟，然后快速 反复冻融两次。取IOul的细胞裂解液，以D-Iuciferin(购自Becton Dickinson,产品目录号为556678)为底物，设置程序后，用化学发光仪(购自Berthold，产品名称为Centro LB960)检测化学发光反应的读数。定性检测待测血清中和抗体的有效性的结果如图2所示。结果表明，在I : 540和I 1620两个稀释倍数下，待测血清31、52、53、54、55、58、511、512、513和S14与阴性对照血清(NC)相比，能够比较有效地中和假病毒；而待测血清S6、S7、S9、SlO和S15不能有效中和假病毒。定量检测待测血清中和抗体的效价待测血清对假病毒的抑制率inhibition)=(阴性对照血清组的化学发光读数-待测血清组的化学发光读数)/阴性对照血清组的化学发光读数。中和抗体滴度定义为待测血清对假病毒的抑制率为90%时，待测血清的稀释倍数，即IC90。将待测血清用2% FBS 01^依次系列稀释102，103，104，105，106，107，108倍，并用其对假病毒做中和试验，以得到的抑制率为纵坐标，相应的待测血清稀释倍数的对数为横坐标作曲线图；由曲线图可以计算出当待测血清对假病毒的抑制率为90%时，待测血清的稀释倍数也即该待测血清的IC90。定量检测待测血清含中和抗体的结果如图4所示，血清A、血清B、血清C和血清D (血清A，B，C，D为S1-S15中能够中和病毒的四种血清；分别对应于S1、S2、S13、和S14。)的稀释倍数分别为3. 206X 105、4. 643X 106、5. 856 X IO5和3. 106 X 103。待测血清对假病毒的抑制率为90%时，待测血清的稀释倍数，即IC90的数值越高，说明抗体的滴度也越高。血清D在稀释倍数为IO3的数量级，血清A和血清C在稀释倍数为IO5的数量级，血清B在稀释了 4. 643X IO6时，相对抑制率分别都依然能达到90%。以上数据说明该假病毒系统在检测血清中的特异性的中和抗体时，有很高的灵敏度。
二、检验本发明的方法与经典的活病毒中和试验的一致性平行地用野生型EV71FY活病毒和EV71FY假病毒检测一组血清的中和抗体滴度。野生型的EV71病毒株为EV71/Fuyang. Anhui. P. R. C，检定血清N3和血清N12(来自中国食品药品检定研究院，均为感染肠道EV71病毒病人血清)具有抗EV71血清的中和活性。经典的活病毒中和试验结果如图8中A所示。图8中A的血清稀释倍数为抗血清对病毒的抑制达到50%时，抗血清的稀释倍数值。活病毒中和试验中血清对病毒的抑制率通过病毒的噬斑实验来确定。用当半数细胞培养板孔内细胞病变时，抗血清稀释的倍数的大小作为定量地判断血清中和抗体的标准。达到TCID50时，血清稀释的倍数越大，则该血清中中和抗体的滴度越高，稀释倍数越小则，血清中中和抗体的滴度越低。如图8中A可见抗血清N12的中和活性明显优于N3。如图8中所示为血清N3和血清N12在EV71 FY假病毒上做的中和试验的结果。图8中B中相对抑制率的算法参考前文。由该图可知，抗血清N3与血清N12在假病毒中和试验的结果与活病毒中和试验的结果有很好的一致性，且对抗血清的稀释倍数高时，依然能检测到中和抗体的存在，所以更加灵敏。此结果说明假病毒系统在检测病毒中和抗体时与经典的活病毒中和试验有很好的一致性。三、检验EV71 FY假病毒系统的特异性为了检验EV71FY假病毒系统的特异性，使用小鼠来源的针对EV71 FY的特异性抗血清(来自用EV71病毒免疫过的SPF级BALB/c小鼠的血清；来自北京生物制品研究所)和非特异性抗血清(对SPF级BALB/c小鼠的眼眶采血所得到的血清，此为常规制法；SPF级BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司)对EV71 FY假病毒做中和试验。结果如图3所示。计算抗血清的相对抑制百分率的公式如下待测血清对假病毒的抑制率 (% inhibition)=(阴性对照血清组的化学发光读数-待测血清组的化学发光读数)/阴性对照血清组的化学发光读数。结果表明EV71 FY的假病毒能够选择性地被EV71 FY的特异中和抗体所中和，但是不能够被非特异的抗血清中和。因此，EV71 FY的假病毒能够特异性地检测到针对EV71的中和抗体。四、检验EV71 FY假病毒系统灵敏度试验过程中，保持病毒量不变，将待测血清血清A、血清B、血清C和血清D用2%FBSDMEM依次系列稀释102，IO3, IO4, IO5, IO6, IO7, IO8倍，并用其对假病毒做中和试验，以得到的抑制率为纵坐标，相应的待测血清稀释倍数的对数为横坐标作曲线图。中和试验的具体操作步骤如前所述。结果如图4所示，血清A、血清B、血清C和血清D分别是EV71 FY的特异性中和血清。血清D在稀释倍数为IO3的数量级，血清A和血清C在稀释倍数为IO5的数量级，血清B在稀释了 4. 643X IO6时，相对抑制率分别都依然能达到90%。以上数据说明该假病毒系统在检测血清中的特异性的中和抗体时，有很高的灵敏度。五、EV71 FY假病毒系统的线性范围将假病毒原液做系列稀释，感染RD细胞，纵坐标为荧光蛋白素的化学发光反应的读数即相对光单位(RLU, relative light unit)的对数值。对数据进行线性回归分析，得到一个假病毒系列稀释感染的趋势图，如图5所示，由图可见，化学发光仪所读出的荧光素酶化学发光反应读数的对数(lg RLU)的线性范围为从4至9，即RLU的读数在IO4 IO9之内。
六、测定假病毒的沉降系数将EV71 FY假病毒颗粒与EV71 FY野生型活病毒颗粒经过蔗糖密度梯度离心分离后，再通过Q-PCR对超高速离心后得到的不同组分检测病毒基因组的拷贝数。结果如图6所示，假病毒颗粒与活病毒颗粒的病毒颗粒分布相同，大部分都集中在Fraction8中。这说明它们之间的沉降系数相同，说明假病毒颗粒和野生型病毒颗粒有相似的三维结构特征。因此，假病毒系统在检测血清中和抗体的试验中能够很好地代替活病毒。
实施例2、检测柯萨奇病毒A16的中和抗体一.定性检测柯萨奇病毒A16的中和抗体的有效性I.构建结构蛋白表达质粒(I)根据柯萨奇病毒A16的GlO株(NCBI序列号NC 001612)的结构蛋白基因的DNA序列，设计全基因合成的引物，并通过PCR反应合成该基因。全基因合成时所用的两端的引物序列如下CA 16GIO-FI-40 TGGACGAGCTGTACAAGGCCATTACTACCCTTGGGTCACA,CA16G10-F2601-2624 AAAATAACAACACTATAAACCGGTAGCAGGTCAGTATGTG(2.构建Cox A16结构蛋白表达质粒将绿色突光蛋白(EGFP)的基因序列与Cox A16所有结构蛋白的基因序列拼接,并将2A_蛋白酶的酶切位点插入EGFP基因的C末端，拼接得到融合基因I，其核苷酸序列如序列表中序列5所示，其中第I位到717位为绿色荧光蛋白的编码基因；第718位到732位为Cox A16的2ΑΡ 蛋白酶的识别位点；第733位到3315位为Cox Α16所有结构蛋白的编码基因，编码由序列表中序列4所不的氣基酸序列组成的蛋白质，即Cox Α16的所有结构蛋白(结构基因的组成方式与图I中A的示意图相似)。同时，通过引物在拼接得到DNA片段的5’端和3’端分别引入NheI和AgeI酶切位点；将引入酶切位点后的融合基因I用NheI (购自 New England BioLabs ;产品目录号为 R0131)和 AgeI (购自 New England BioLabs ;产品目录号为R0552)酶切，克隆到pCDNA6/HisA的载体(购自Invitrogen，产品目录号为V22001)上，得到重组质粒。重组质粒验证方法1.挑单克隆,并摇菌,提质粒。2.用NheI和AgeI对重组质粒进行双酶切鉴定。3.挑选酶切图谱正确的克隆送奥科测序公司进行测序。将得到的重组质粒命名为pEGFP Cox A16capsid。引入NheI和AgeI酶切位点所用的引物如下EGFP CA16-f AAATCAGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGACA16G10-F2601-2624 AAAATAACAACACTATAAACCGGTAGCAGGTCAGTATGTG2、DNA 的转染转染前12-14小时在IOcm2的细胞培养板上接种293T细胞。转染当天，293T的密度应该达到60-70%。转染前一小时，用无抗生素的10% FBS-DMEM (购自Invitrogen公司，产品目录号为 11965500BT)培养 293T 细胞。用 Lipofectamine 2000transfectionreagent (购自Invitrogen,产品目录号为11668-019)转染24 μ g重组质粒pEGFP CoxA16capsid，在37°C细胞培养箱内培养。转染后4小时，换成10% FBS-DMEM培养20小时。在荧光显微镜下观察EGFP荧光蛋白从而判断结构蛋白的表达水平。3、RNA复制子的产生以及假病毒的包装假病毒的包装需首先在体外转录出EV71 FY的RNA复制子。而要体外转录反应需先得到相应的DNA模板。纯化该RNA复制子的DNA模板步骤与实施例I相同。由如上步骤所得的线性的DNA可作为体外转录试验的DNA模板。以线性化的pEV71 FY-Fluc为模板，使用RiboMAX Large Scale RNA Production System_T7 (购自 Promega,产品目录号为 P1300)体外转录出单链正义RNA，用无RNase的无水乙醇沉淀该RNA。弃乙醇，待管内残留的乙醇挥发尽后，用适量的无RNase的水(购自TAKARA，产品目录号为D602)溶解RNA沉淀，分装并储存在 _8CTC备用。用 Lipofectamine 2000transfection reagent (购自 Invitrogen,产品目录号为11668-019)转染IOyg RNA到已经转染了 pEGFP Cox A16capsid的293T细胞内。4小时后，将培养基换成2%FBS-DMEM。24小时后，将细胞上清收集到15ml管中，在细胞表面留下约500ul的培养基。用剩余培养基将293T细胞重悬起来，并用干冰反复快速冻融两次。将之前收集的培养基上清和冻融过的沉淀混匀，然后再用离心机2，500g离心5分钟，弃沉淀，收集上清，并分装到I. 5ml的EP管中，贮存在_80°C冰箱备用。4、假病毒的中和试验为了检验Cox A16假病毒系统的特异性，使用针对Cox A16的特异性兔血清(J15)(来自中国食品药品检定研究院；CA16的疫苗免疫后取血)和非特异性抗血清(N30)(来自中国食品药品检定研究院，为感染了非CA16病毒的病人血清)对Co-X A16假病毒做中和试验，中和试验的操作可参考EV71 FY假病毒的中和试验。计算抗血清的相对抑制百分率的公式如下待测血清对假病毒的抑制率inhibition)=(阴性对照血清组的化学发光读数-待测血清组的化学发光读数)/阴性对照血清组的化学发光读数。结果如图7所示，结果表明Cox A16的假病毒能够选择性地被Cox A16的特异中和抗血清即J15所中和，但是不能够被非特异的抗血清中和。因此，Cox A16的假病毒能够特异性地检测到针对CoxA16的中和抗体。此外，在包装出EV71 FY和Cox A16假病毒后，用对EV71 FY的有较强中和能力的血清A和血清B (请说明血清A为SI血清；B为S2血清。)对所得的EV71和CA16的假病毒分别进行中和试验。结果如图9所示，发现在I : 540稀释倍数的情况下，血清A和血清B对EV71 FY假病毒均有90%左右的抑制率，在I : 1620的血清稀释倍数下，有接近80%的抑制率。然而该组血清的两个稀释梯度对CA16假病毒的感染均无中和作用。在血清稀·释比例为I : 1620时，对CA16病毒的感染反而有一定的促进作用。
权利要求
1.一个DNA分子，是将肠道病毒属病毒的基因组RNA对应的CDNA中的所有结构蛋白的编码基因替换为报告基因得到的重组DNA。
2.根据权利要求I所述的DNA分子，其特征在于 所述DNA分子是将肠道病毒71型的基因组RNA对应的cDNA中的所有结构蛋白的编码基因替换为报告基因得到的重组DNA ;所述所有结构蛋白的氨基酸序列为序列表中序列I所示。
3.根据权利要求I或2所述的DNA分子，其特征在于 所述报告基因为荧光素酶报告基因； 所有结构蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因 1)其核苷酸序列为序列表中序列2第733位到3315位所示； 2)在严格条件下与I)所示的基因杂交且编码所述结构蛋白的基因； 3)与I)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述结构蛋白的基因； 所述荧光素酶基因的核苷酸序列如序列表中序列3第771位到2420位所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子为序列表中序列3第I位到6544位所示的DNA分子。
5.含有权利要求1-4中任一所述DNA分子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒；所述重组载体具体为重组表达载体。
6.一种用于检测肠道病毒中和抗体的组合物，为组合物A或组合物B ； 所述组合物A为如下I)或2)或3)所示 1)由权利要求1-4中任一所述的DNA分子和权利要求1-3中任一所述的所有结构蛋白的编码基因组成的组合物； 2)由权利要求1-4中任一所述的DNA分子和柯萨奇病毒A16的所有结构蛋白I的编码基因组成的组合物；所述所有结构蛋白I的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5第733位到3315位所示； 3)由权利要求1-4中任一所述的DNA分子和融合基因I组成的组合物；所述融合基因I为如下a)或b)所示 a)所述融合基因I是由报告基因、肠道病毒的2APM蛋白酶的识别位点和权利要求1-3中任一所述的所有结构蛋白的编码基因依次连接而成； b)所述融合基因I是由报告基因、肠道病毒的2A_蛋白酶的识别位点和柯萨奇病毒A16的所有结构蛋白I的编码基因依次连接而成；所述所有结构蛋白I的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5第733位到3315位所示； 所述组合物B为由权利要求5所述的重组载体和重组载体I组成的组合物；所述重组载体I为如下c)或d)或e)所示 c)含有权利要求1-3中任一所述的所有结构蛋白的编码基因的重组载体； d)含有柯萨奇病毒A16的所有结构蛋白I的编码基因的重组载体；所述所有结构蛋白I的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5第733位到3315位所示； e)含有所述融合基因I的重组载体。
7.—种重组病毒，是将权利要求6所述的用于检测肠道病毒中和抗体的组合物在离体的哺乳动物细胞中包装得到的重组病毒。
8.权利要求1-4中任一所述DNA分子、权利要求5所述的表达盒、权利要求5所述的重组载体、权利要求5所述的转基因细胞系、权利要求5所述的重组菌、权利要求5所述的重组病毒、权利要求6所述的组合物或权利要求7所述的重组病毒在检测肠道病毒中和抗体中的应用。
9.一种检测肠道病毒中和抗体的方法，包括以下步骤 将权利要求7所述的重组病毒与系列稀释的待测抗体混合，得到混合物；用所述混合物感染对肠道病毒敏感的细胞，根据所述对肠道病毒敏感的细胞中报告基因的表达物所产生的信号定性检测待测抗体的有效性或定量检测待测抗体的效价。
10.一种检测肠道病毒中和抗体的试剂盒，含有下述至少一种物质1)权利要求1-4中任一所述DNA分子、2)权利要求5所述的表达盒、3)权利要求5所述的重组载体、4)权利要求5所述的转基因细胞系、5)权利要求5所述的重组菌、6)权利要求5所述的重组病毒、7)权利要求6所述的组合物、8)权利要求7所述的重组病毒。
全文摘要
本发明公开了检测肠道病毒中和抗体的方法及其专用重组病毒。本发明提供了一个DNA分子。本发明所提供的DNA分子，是将肠道病毒的基因组RNA对应的cDNA中的所有结构蛋白的编码基因替换为报告基因得到的重组DNA。本发明利用EV71 FY的假病毒系统检测中和抗体的方法由于采用了单周期感染的假病毒，所以没有使用活病毒时的安全问题。经过多个试验，其结果表明该发明中所陈述的假病毒系统是一种安全，灵敏，快速，特异，简便且成本低廉的检测中和抗体的方法。基于以上特点，该假病毒系统非常适合于快速，大规模地检测中和抗体的试验，对于病毒疫苗的研制及检测患者个体及人群手足口病特异性中和抗体水平有着重要的应用价值。
文档编号C12N1/21GK102911948SQ20111022047
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者李文辉, 宋子林, 陈盼, 祁永和, 梁争论, 吴星, 沈心亮 申请人:北京生命科学研究所