专利名称：油菜茎基溃疡病菌分子标准样品及其制备方法
技术领域：
本发明涉及油菜茎基溃疡病菌分子标准样品，另外本发明还涉及其制备方法，属于植物检疫技术研究领域。
背景技术：
国内外关于动物病毒及食品微生物标准物质的报道甚多，而植物病原菌的标准物质研究则刚刚起步，很多问题都亟待解决。国内外植物病原菌检测时多购买美国菌种保藏中心(ATCC)的菌株作为阳性对照，其价格非常昂贵，国内几乎无法购买到，而植物病原菌分子检测的分子DNA标准物质鲜见相关研究报道，所以全面深入的研究解决植物病原菌检测DNA标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国植物检疫性病原菌检测分子 DNA标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供油菜茎基溃疡病菌分子标准样品及其制备方法和应用说明。本发明油菜茎基溃疡病菌分子标准样品，以油菜茎基溃疡病菌菌株提取高纯度 DNA为原料制得，标准样品具有下述的理化性质(1)形状纯白色粉末状；(2)每管的含量 5μδ 士0. ;(3)DNA 纯度:0D260/280=1. 8 2 ； (4)易溶于水，或 TE (Tris-EDTA)缓冲液中。所述DNA 纯度0D260/280=1. 85。本发明油菜茎基溃疡病菌分子标准样品的制备方法，包括如下步骤
(1)油菜茎基溃疡病菌菌株采用马铃薯蔗糖(PD)液体培养基，置于20 22°C条件下培养5 7天；
(2)提取油菜茎基溃疡病菌DNA，采用CTAB方法提取DNA；
(3)核酸标准样品的制备将测定浓度后的DNA按士0.5μδ /管进行分装，每种核酸分子标样分装100-400管，然后冻干，即为目的标准品。所述提取油菜茎基溃疡病菌DNA，包括如下步骤
①取0.1 g干菌丝置于预冷的研钵中，在液氮中迅速研磨成粉末状，把粉末迅速转入 1.5 ml的离心管中(同时做多管)；
②向①中装有干菌丝粉末的离心管中加入800μ 65°C预热的CTAB提取缓冲液，涡旋振荡充分混勻，65°C水浴50 min，每隔10 min轻轻颠倒混勻一次；
③冷却至室温，再向②中离心管加入800μ 1的氯仿异戊醇混合液(体积比为M :1)， 轻轻颠倒混勻，静置10 min, 40C 10000 rpm离心10 min，取上清；
④向③中所得上清液中加入与该上清液等体积的氯仿异戊醇混合液(体积比为M 1)，轻轻颠倒混勻，静置10 min, 40C 10000 rpm离心10 min，取上清；
⑤向④中所得上清液中加入与该上清液等体积的异丙醇或2倍体积冰无水乙醇，轻轻颠倒混勻，出现DNA絮状沉淀，放在冰上放置30 min沉淀DNA，4°C 12000 rpm离心10 min,弃上清，离心管倒置滤纸上干燥，用800 μ 1浓度70 %冰乙醇清洗沉淀两次，以除去盐离子等。加入800 μ 1浓度70 %冰乙醇后，轻轻颠倒离心管几次，将沉淀于底部的DNA弹起，放置离心管10 min,4°C 10000 rpm离心1 min，弃上清；再用800 μ 1浓度70 %冰乙醇洗DNA 沉淀，方法同上，4°C 15000 rpm离心3 min，弃上清，风干去除乙醇；
⑥向⑤中所得DNA沉淀中加入200μ 1 TE溶解DNA沉淀。待充分溶解后，加入3 μ 1 RNase(10 mg/ml)，37°C水浴30 min ；然后按③一⑤步相同处理方法进行处理；
⑦将第⑥步处理后的干燥DNA沉淀，用100μ TE溶解，-20°C保存备用。 所述对标准样品定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析， 来确认所制备的核酸为目的DNA
取制备的核酸标准样品，加入50μ1ΤΕ，溶解后作为模板使用，经采用特异性引物 Phom I和Wlom II进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品，
正向引物5' - CACCAATTGGATCCCCTA -3，
反向引物5，- AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA -3，
反应体系
模板1 2正向引物1 μ 反向引物1 μ iTaq 酶0. 2UdNTP4 μ IOXBuffer3 μ Total30 μ
反应条件
940C 3min 94°C 30s 53°C 30s
72°C 40s循环；35 次
72 °C 5min。本发明油菜茎基溃疡病菌分子标准样品以实验室自行分离的油菜茎基溃疡病菌菌株为原料，通过特定条件大量培养，提取高纯度DNA，进行分装、冻干，得到油菜茎基溃疡病菌的分子标准品，理化性质优异，可采用特异性的引物通过PCR方法检测出，灵敏度达到 10_4倍。经检测试验，该标准品DNA完整性、均勻性、稳定性好，可用于进出口检测中，作为阳性参照物质，提高检测结果的准确性。四
图1是油菜茎基溃疡病菌总DNA电泳图。图2是油菜茎基溃疡病菌特异性引物扩增电泳结果图，其中1、2、3为目的DNA。图3是本发明标准样品灵敏度检测结果图，其中由左到右，每两格为一组，依次是 IO"1, IO"2, 10_3，10_4，10_5。五具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。实施例1
油菜茎基溃疡病菌分子标准样品制备方法按如下步骤进行
(1)油菜茎基溃疡病菌菌株采用马铃薯蔗糖(PD)液体培养基，置于20 22°C条件下培养5 7天。(2)提取油菜茎基溃疡病菌DNA，采用CTAB方法提取DNA，具体步骤如下
①取0.1 g干菌丝置于预冷的研钵中，在液氮中迅速研磨成粉末状，把粉末迅速转入 1.5 ml的离心管中(同时做多管)；
②向①中装有干菌丝粉末的离心管中加入800μ 65°C预热的CTAB提取缓冲液，涡旋振荡充分混勻，65°C水浴50 min，每隔10 min轻轻颠倒混勻一次；
③冷却至室温，再向②中离心管加入800μ 1的氯仿异戊醇混合液(体积比为M :1)， 轻轻颠倒混勻，静置10 min, 40C 10000 rpm离心10 min，取上清；
④向③中所得上清液中加入与该上清液等体积的氯仿异戊醇混合液(体积比为M 1)，轻轻颠倒混勻，静置10 min,40C 10000 rpm离心10 min，取上清；
⑤向④中所得上清液中加入与该上清液等体积的异丙醇或2倍体积冰无水乙醇，轻轻颠倒混勻，出现DNA絮状沉淀，放在冰上放置30 min沉淀DNA，4°C 12000 rpm离心10 min, 弃上清，离心管倒置滤纸上干燥，用800 μ 1 70 %冰乙醇清洗沉淀两次，以除去盐离子等。加入800 μ 1 70 %冰乙醇后，轻轻颠倒离心管几次，将沉淀于底部的DNA弹起，放置离心管10 min,4°C 10000 rpm离心1 min，弃上清；再用800 μ 1 70 %冰乙醇洗DNA沉淀，方法同上， 40C 15000 rpm离心3 min，弃上清，风干去除乙醇；
⑥向⑤中所得DNA沉淀中加入200μ 1 TE溶解DNA沉淀。待充分溶解后，加入3 μ 1 RNase(10 mg/ml)，37°C水浴30 min ；然后按③一⑤步相同处理方法进行处理；
⑦将第⑥步处理后的干燥DNA沉淀，用100μ TE溶解，-20°C保存备用。(3)核酸标准样品的制备将测定浓度后的DNA按管进行分装，每种核酸分子标样分装150管，然后冻干，即为目的标准品，具有下述的理化性质形状纯白色粉末状；每管的含量士0· 5μδ ； DNA纯度:0拟60Λ80=1. 8 2 ；易溶于水，或TE(Tris-EDTA) 缓冲液中。(4)取制备的核酸标准样品，加入50μ1ΤΕ，溶解后作为模板使用，经采用特异性进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品。例
正向引物5' - CACCAATTGGATCCCCTA -3，
反向引物5，- AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA -3，
反应体系
模板1 2正向引物1 μ 反向引物1 μ iTaq 酶0. 2UdNTP4 μ IOXBuffer3 μ Total30 μ 反应条件
940C 3min ； 94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 40s,35cycles ；72°C 5min。实施例2
对实施例1制得的标准样品进行DNA完整性、均勻性、稳定性测试 1. DNA质量及完整性检测取制备的DNA，进行凝胶电泳、纯度及浓度检测。(I)DNA完整性检测直接法-用提取的DNA直接电泳检查，120V, 1. 5%琼脂糖凝胶电泳，观察条带的完整性，检测结果见图1，条带完整，无弥散状，说明DNA条带完整性较好。(2) DNA浓度及纯度检测紫外分光光度计法-吸取1 μ 1 DNA用分光光度计测定 260nm和280nm的吸收值，然后根据0D26(1/0D28(1值判断DNA纯度，并根据OD26tl计算其浓度。 按以下公式计算
DNA 浓度(ng/μ D=OD26tlX 50 当OD26tZOD28tl < 1. 8，表示蛋白质含量较高；OD26tZOD28tl > 2. 0，表示RNA含量较高；当 OD260/OD280=l. 8 2. 0，表示 DNA 较纯。2.标准样品均勻性分析
为检查制备的目的核酸标准样品的均勻性，采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法及紫外分光光度法，取随机抽取15管样品，每管样品分成2份子样进行测试，结果见(表1 )数据进行F检验(表2)确认样品均勻性。3.标准样品稳定性分析
本有证标准样品参考国外同等带证有证标准样品的稳定性期限规定说明(如美国 SIGMA公司生产规定说明，该有证标准样品在真空、避光、-2 0°C下贮存，稳定有效期为两年)为依据，根据微生物的生物特性，以2年为期，对制备的标准样品分阶段每次取二份样品，按照不同保存条件进行定性测定，每份样品以测定3次值为其定值结果。在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均勻性测试相同。依据上述测定方法分别计算结果，本油菜茎基溃疡病菌标准样品在真空、避光、-2 Q°C下贮存，稳定有效期为2年，测定结果见表3。
稳定性试验中，斜率可用下式计算
^i(Xi-X)(Yi-Y) Ii1 = J=L---= -0.00311
Z(Xi-I)2
3-1
式中f = 5.101 X= 11.6 截距由下式计算:b0 = F-^1X= 5.13692 直线上的点的标准偏差可由下式计算
权利要求
1.油菜茎基溃疡病菌分子标准样品，其特征在于以油菜茎基溃疡病菌菌株提取高纯度DNA为原料制得，标准样品具有下述的理化性质(1)形状纯白色粉末状；(2)每管的含量 ±0. ;(3)DNA 纯度0 拟 60Λ80=1. 8 2 ;(4)易溶于水，或 TE (Tris-EDTA)缓冲液中。
2.根据权利要求1所述的油菜茎基溃疡病菌分子标准样品，其特征在于DNA纯度 0D260/280=1. 85。
3.油菜茎基溃疡病菌分子标准样品的制备方法，其特征是包括如下步骤(1)油菜茎基溃疡病菌菌株采用马铃薯蔗糖(PD)液体培养基，置于20 22°C条件下培养5 7天；(2)提取油菜茎基溃疡病菌DNA，采用CTAB方法提取DNA；(3)核酸标准样品的制备将测定浓度后的DNA按士0.5μδ /管进行分装，每种核酸分子标样分装100-400管，然后冻干，即为目的标准品。
4.根据权利要求1所述的油菜茎基溃疡病菌分子标准样品的制备方法，其特征是所述提取油菜茎基溃疡病菌DNA，包括如下步骤①取0.1 g干菌丝置于预冷的研钵中，在液氮中迅速研磨成粉末状，把粉末迅速转入 1. 5 ml的离心管中；②向①中装有干菌丝粉末的离心管中加入800μ 65°C预热的CTAB提取缓冲液，涡旋振荡充分混勻，65°C水浴50 min，每隔10 min轻轻颠倒混勻一次；③冷却至室温，再向②中离心管加入800μ 1的氯仿异戊醇混合液，轻轻颠倒混勻，静置 10 min, 40C 10000 rpm 离心 10 min，取上清；④向③中所得上清液中加入与该上清液等体积的氯仿异戊醇混合液，轻轻颠倒混勻， 静置 10 min, 40C 10000 rpm 离心 10 min，取上清；⑤向④中所得上清液中加入与该上清液等体积的异丙醇或2倍体积冰无水乙醇，轻轻颠倒混勻，出现DNA絮状沉淀，放在冰上放置30 min沉淀DNA，4°C 12000 rpm离心10 min, 弃上清，离心管倒置滤纸上干燥，用800 μ 1浓度70 %冰乙醇清洗沉淀两次，以除去盐离子等；加入800 μ 1浓度70 %冰乙醇后，轻轻颠倒离心管几次，将沉淀于底部的DNA弹起，放置离心管10 min,4°C 10000 rpm离心1 min，弃上清；再用800 μ 1浓度70 %冰乙醇洗DNA 沉淀，方法同上，4°C 15000 rpm离心3 min，弃上清，风干去除乙醇；⑥向⑤中所得DNA沉淀中加入200μ 1 TE溶解DNA沉淀；待充分溶解后，加入3 μ 1 RNase(10 mg/ml)，37°C水浴30 min ；然后按③一⑤步相同处理方法进行处理；⑦将第⑥步处理后的干燥DNA沉淀，用100μ TE溶解，-20°C保存备用。
5.根据权利要求3所述的油菜茎基溃疡病菌分子标准样品的制备方法，其特征是对标准样品定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的核酸为目的DNA 取制备的核酸标准样品，加入50μ1ΤΕ，溶解后作为模板使用，经采用特异性引物 Phom I和Wlom II进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品，正向引物5' - CACCAATTGGATCCCCTA -3，反向引物5，- AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA -3，反应体系 模板1 2正向引物1 μ 反向引物1 μ iTaq 酶0. 2UdNTP4 μ IOXBuffer3 μ Total30 μ 反应条件940C 3min 94°C 30s 53°C 30s72°C 40s 循环；35 次 72 °C 5min。
6.根据权利要求3所述的油菜茎基溃疡病菌分子标准样品的制备方法，其特征是所述提取油菜茎基溃疡病菌DNA中采用的氯仿异戊醇混合液体积比为M :1。
全文摘要
本发明涉及属于植物检疫技术研究领域。油菜茎基溃疡病菌分子标准样品。油菜茎基溃疡病菌分子标准样品，以油菜茎基溃疡病菌菌株提取高纯度DNA为原料制得，标准样品具有下述的理化性质(1)形状纯白色粉末状；(2)每管的含量5μg±0.5μg；(3)DNA纯度OD260/280=1.8～2；(4)易溶于水，或TE(Tris-EDTA)缓冲液中。本发明油菜茎基溃疡病菌分子标准样品以实验室自行分离的油菜茎基溃疡病菌菌株为原料，通过特定条件大量培养，提取高纯度DNA，进行分装、冻干，得到油菜茎基溃疡病菌的分子标准品，理化性质优异，可采用特异性的引物通过PCR方法检测出，灵敏度达到10-4倍。经检测试验，该标准品DNA完整性、均匀性、稳定性好，可用于进出口检测中，作为阳性参照物质，提高检测结果的准确性。
文档编号C12N15/10GK102277430SQ20111021970
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者刘冉, 曹际娟, 李鑫, 王有福 申请人:刘冉, 曹际娟, 李鑫, 王有福