专利名称：：油菜茎基溃疡病菌的实时荧光pcr检测方法及检测用引物和探针的制作方法
技术领域：
：本发明涉及农业和植物检疫
技术领域：
，具体涉及一种油菜茎基溃疡病菌的检测方法，尤其涉及一种油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法。此外，本发明还涉及检测油菜茎基溃疡病菌的引物和探针。
背景技术：
：油菜黑胫病(Phomastemcanker)又称为“油菜黑腿病”，是世界范围内油菜最严重的真菌病害之一，其病原菌为小球腔菌属，主要包括两个种油菜黑胫病菌Leptosphaeriabiglobosa禾口油菜莲基馈荡病菌Leptosphaeriamaculans,这两禾中病原菌的形态特征相近，但引起油菜茎部感染和基部溃疡的能力不同。前者致病力较弱，一般引起茎中上部为害，造成的损失小，包括中国在内的一些油菜生产国均有分布。后者致病力强，弓丨起茎基部发病，是导致油菜黒胫病严重流行和油菜产量损失的主要因素，在澳大利亚、加拿大、美国、欧洲等油菜主产国有分布，而在我国未见报道。我国油菜产区气候与欧、美、澳三大洲相似，且中国目前的油菜主要栽培品种高度感病。另一方面，随着贸易全球化，病菌传入的风险加剧。2009年8月以来，上海口岸已经从澳大利亚、乌克兰和加拿大等国进境油菜籽样品中多次截获油菜茎基溃疡病菌Lmaculans。油菜茎基溃疡病菌正在一步步逼近我国，严重威胁着我国油菜产业的生产安全。为防止该有害生物的传入，如何高效快速检测成为预防油菜茎基溃疡病传入国内的技术关键。目前，国内针对油菜茎基溃疡病菌的检测方法研究较少，采用的检测手段主要是滤纸培养法和PCR方法，PCR检测方法以其快速、准确和灵敏的特点受到广泛应用。但尚未见利用MGB探针来检测油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法的报道。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法；为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物和探针。在本发明的一方面，提供一种油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤(1)设计引物和探针；该引物的序列为Lmb3:5，-caccaattggatccccta-3，(SEQIDNO.1)或其互补链；R2:5，-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3，(SEQIDNO.2)或其互补链；该探针的序列为Probe-M5'_FAM-cacttgggactcgccttg-MGB_3，(SEQIDNO.3)或其互补链；(2)对油菜籽样品进行过筛处理，然后收集菌丝并提取DNA；(3)采用步骤⑴设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。步骤(2)中，所述对油菜籽样品进行过筛处理具体为用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛，取筛上物和筛下物，液氮研磨后取样。步骤(2)中，所述收集菌丝并提取DNA具体为菌株用PDA培养基繁殖后收集菌丝，液氮研磨后取菌丝粉，用植物基因组提取试剂盒提取DNA。步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25yL，包括12.5μL2XPremixExTaq,5μM步骤(1)设计的引物和探针各1μL、1μL模板DNA、0.5μL50XROXReferenceDyeII、力口无菌7_K补至25μL。步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为95°C预变性10s，然后以95°C变性15s，60°C延伸Imin进行40个循环的扩增。在本发明的另一方面，提供一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物，其序列为上游引物Lmb3:5，-caccaattggatccccta-3，(SEQIDNO.1)或其互补链；下游引物R2:5，-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3，(SEQIDNO.2)或其互补链。在本发明的另一方面，提供一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的探针，其序列为Probe-M5'-FAM-cacttgggactcgccttg-MGB-3，(SEQIDNO.3)或其互补链。上述实时荧光PCR检测方法采用MGB(全称为MinorGrooveBinder)探针。MGB探针一是在探针的3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记；二是探针的3’端另结合了Minorgroovebinder结合物，使探针的Tm值提高，大大增加了探针的杂交稳定性。该方法具有如下优点1、更容易设计；2、探针更短3、提高配对与司E配对模板间的Tm值差异；4、实验结果更精确、分辩率更高；5、杂交的稳定性提高；6、低背景；7、重复性更强。该方法适合病原体的检测、SNP和突变体检测，既可以进行基因定量分析，又可以进行基因突变分析。与现有技术相比，本发明的有益效果在于本发明根据油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeriamaculans与其近似种ITS序列的差异，设计了检测L.maculans的引物Lmb3/R2和探针Probe-M，建立了L.maculans的实时荧光PCR检测方法。试验结果表明，来自加拿大、澳大利亚和乌克兰等国的22株L.maculans菌株都能得到阳性扩增，而供试的30株L.biglobosa菌株和6株其他菌株以及空白对照没有荧光信号的增加。该检测方法的灵敏度达到4pg菌丝DNA，整个检测过程控制在4小时内，其快速、特异和灵敏的特点可以满足进境油菜籽样品的快速初检以及病菌分离物的快速鉴定。图1是供试L.maculans菌株DNA的实时荧光PCR扩增结果示意图；图2是供试biglobosa菌株和相关种菌株DNA的实时荧光PCR扩增结果示意图；图3是实时荧光PCR的检测灵敏度结果示意图；图4是油菜样品及分离物的实时荧光PCR扩增结果示意图。图1-图4中，ARn是第η次循环时的荧光增加值。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork=ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述条件，或按制造厂商所建议的条件。实施例1本实施例根据油菜茎基溃疡病菌L印tosphaeriamaculans与其近似种ITS(internaltranscribedspacer，核糖体基因的转录间隔区)序列的特异性位点差异(G/A)设计特异引物和Taqman-MGB探针将实时荧光PCR技术应用于油菜茎基溃疡病菌L.maculans的检测，实验步骤如下1材料方法1.1供试菌株试验用油菜茎基溃疡病菌L.maculans和油菜黑胫病菌L.biglobosa部分菌株由本实验室(上海出入境检验检疫局)从加拿大、澳大利亚和乌克兰等国进境油菜籽样品中分离纯化后得到，部分菌株由深圳、江苏和宁波出入境检验检疫局技术中心提供，国内油菜黑胫病菌L.biglobosa菌株由安徽农科院李强生老师提供，菌株编号和来源见表1。表1试验菌株Wm分离时间"”~IsolateCodeOriginYearL.maculans8129-5澳大利亚Australia20098129-17澳大利亚Australia20098129-25澳大利亚Australia20096382-1澳大利亚Australia20096382-2澳大利亚Australia20096382-3澳大利亚Australia20098080-1乌克兰Ukraine2009333-13乌克兰Ukraine2009333-15乌克兰Ukraine2009420-3乌克兰Ukraine2009434-1乌克兰Ukraine2009<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表1中，a江苏出入境检验检疫局吴翠萍提供；b深圳出入境检验检疫局程颖慧提供；C宁波出入境检验检疫局张建成提供；d安徽农科院李强生提供。1·2供试引物及探针根据油菜茎基溃疡病菌L印tosphaeriamaculans与其近似种ITS(internaltranscribedspacer，核糖体基因的转录间隔区)序列的特异性位点差异(G/A)设计特异引物和Taqman-MGB探针，供试引物Lmb3(5，-caccaattggatccccta-3，(SEQIDNO.1))/R2(5‘-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3‘(SEQIDNO.2))禾口探针Probe-M(5，-FAM_cacttgggactcgccttg-MGB-3，(SEQIDNO.3))均来源于GenBank中L.maculans的核糖体ITS序列。引物和探针由上海基康公司合成。1.3菌丝收集及DNA提取供试菌株用PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，每升培养基含有马铃薯200g，蔗糖20g和琼脂17g)繁殖后收集菌丝，液氮研磨后取0.Ig菌丝粉，用植物基因组提取试剂盒(TIANGENBIOTECH公司，DP305-02)提取DNA。1.4样品和分离物DNA提取进境加拿大油菜籽样品(样品编号3，进境时间为2009年)混勻后取Ikg用作试验样品，用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛，取筛上物和筛下物各l_2g，液氮研磨后各取样0.1-0.2g，分别按1.3方法提取DNA。油菜籽样品中分离物3_6和3_21(本实验室(上海出入境检验检疫局)从加拿大进境油菜籽中分离的疑似菌株，进境时间为2009年)的菌丝液氮研磨后各取样0.1-0.2g按1.3方法提取DNA。1.5实时荧光PCR检测PCR试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)。反应体系为25μL，包12.5μL2XPremixExTaq、上下游引物(5μM)和探针(5μΜ)各1μL、1μL模板DNA、0.5μL50XROXReferenceDyeII、力口无菌7_K补至25μL。实时荧光PCR检测使用仪器为AppliedBiosystems(美国应用生物系统公司)的7500FastReal-timePCRSystem(7500快速实时荧光PCR系统)，反应程序为95°C预变性10s，然后以95°C15s，60°CImin进行40个循环。2结果2.1特异性检测22个供试L.maculans菌株的菌丝DNA经实时荧光PCR检测，探针Probe-M对供试的22个L.maculans菌株都有荧光信号的增加，表现为阳性扩增(见图1)。图1中，1_21包括以下编号的22个L.maculan菌株(8129-5，8129-17，8129-25，6382-1，6382-2，6382-3，8080-1，333-13，333-15，420-3，434-1，895-1，3-4，3-9，3-20，15-2,15-3,15-5,17-2,17-3,J-4，J-1)；22表示编号6382-53的油菜黑胫病菌L.biglobosa菌株；23表示无DNA模板。供试的30个L.biglobosa菌株、5株Alternariaspp.菌株、1株Phomasp.菌株和空白对照都没有检测到荧光信号的增加，表现为阴性(见图2)。图2中，1-36表示以下编号的30个L.biglobosa菌株、5株Alternariaspp.菌株禾口1株Phomasp.菌株(6382—53，6382-54，7873-1，7873-2，6555-1，6555-2，1602-1，1602-2，333-10，333-14，337-2，337-3，420-1，17-1，17-4，17-11，15-4,15-16，3-2，3-12，895-3，895-4，9268-39，9268-46，726-2，Gs5-5,Gj2-2,Ah9-4,Ah12-2,Ahl9_3，8129-84，3-3，333-3，333-11，333-18，8129-92)；37表示编号为8129-5的L.maculan菌株；38表示无DNA模板。试验结果表明，引物Lmb3/R2和探针Probe-Μ可以特异性检测L.maculans。2.2灵敏度检测L.macu1ans菌株8129-5的菌丝DNA测定DNA浓度后系列稀释为不同浓度，分别取4ng、400pg、40pg、4pg、400fg和40fg的菌丝DNA用于实时荧光PCR检测，PCR扩增后4ng、400pg、40pg和4pg的菌丝DNA都检测到荧光信号的增加，表现为阳性扩增，400fg和40fg的菌丝DNA无扩增(见图3)，图3中，16分别表示编号8129-5的L.maculans菌株的4ng，400pg，40pg，4pg，400fg，40fg的菌丝DNA。试验结果表明引物Lmb3/R2和探针Probe-M的检测灵敏度为4pg的菌丝DNA。2.3样品和分离物DNA的检测进境油菜样品3的筛上物和筛下物DNA以及样品中分离物3_6和3_21的DNA分别进行实时荧光PCR检测，筛上物DNA、筛下物DNA、分离物3_21的DNA和阳性对照都出现荧光信号的增加，分离物3-6的DNA、阴性对照和空白对照表现为阴性扩增(见图4)，图4中，1表示进境油菜样品3的筛上物DNA(采用孔径d=2.5mm的网筛过筛)；2表示进境油菜样品3的筛下物DNA(采用孔径d=1.5mm的网筛过筛)；3表示分离物3_21的DNA；4表示分离物3-6的DNA；5表示编号为8129-5的L.maculans菌株；6表示编号为6382-53的L.biglobosa菌株；7表示无DNA模板。试验结果表明，引物Lmb3/R2和探针Probe-M可以特异性检测油菜样品中的L.maculans,也可用于病菌分离物的鉴定。3讨论目前认为油菜茎基溃疡病菌L.maculans种下包括两个亚种或组，包括L.maculanssubsp.brassicae禾口L.maculanssubsp.Iepidii,前者寄主为栽培芸薹属Brassicaspp.,后者寄主为独行菜属L印idiumspp.。试验所用Lmaculans菌株均从加拿大、乌克兰和澳大利亚等国进境油菜籽样品中分离，经形态特征和序列分析，其ITS序列和L.maculanssubsp.brassicae的序列相似性大于或等于99.8%。因此，供试L.maculans菌株均为L.maculanssubsp.brassicae。试验所用弓I物禾口探针是针对L.maculanssubsp.brassicae的序列设计，理论上仅对L.maculanssubsp.brassicae菌株表现为阳性扩增，试验中缺少L.maculanssubsp.1印idii菌株进行验证。试验中所用L.biglobosa菌株包含L.biglobosasubsp.brassicae、L.biglobosasubsp.canadensis禾口L.biglobosasubsp.australiensis等二个亚禾中。试验中没有收集至丨JL.biglobosasubsp.thlaspii、L.biglobosasubsp.erysimii禾口L.biglobosasubsp.occiaustralensis等三个亚禾中菌株进行验证。试验中实时荧光PCR的检测灵敏度达到了4pg菌丝DNA，比常规PCR的检测灵敏度提高了10-100倍。在检测灵敏度提高的同时，检测时间缩短至1.5小时。从样品前处理、DNA提取到实时荧光PCR扩增，整个检测时间控制在4小时以内。油菜籽中油菜茎基溃疡病菌的感染率很少高于1_2%，籽粒的带菌量处于比较低的水平，而用于DNA提取的油菜籽样品仅为0.1-0.2g，约为50-100粒，PCR直接检测油菜籽种子样品的阳性率很低，试验中常规PCR检测30余个加拿大进境油菜籽样品，阳性率仅为10%左右。试验中通过样品的前处理，对油菜籽样品进行过筛处理，检测样品筛上物和筛下物，阳性率超过60%，因此通过样品前处理大大提高了阳性检出率，达到了快速检测以满足口岸快验放行的目的。同时，实时荧光PCR检测还可以进行定量分析，在今后的油菜茎基溃疡病菌监测和防控中具有十分广泛的应用前景。权利要求一种油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)设计引物和探针；该引物的序列为Lmb35’-caccaattggatccccta-3’(SEQIDNO.1)或其互补链；R25’-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3’(SEQIDNO.2)或其互补链；该探针的序列为Probe-M5’-FAM-cacttgggactcgccttg-MGB-3’(SEQIDNO.3)或其互补链；(2)对油菜籽样品进行过筛处理，然后收集菌丝并提取DNA；(3)采用步骤(1)设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。2.如权利要求1所述的油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述对油菜籽样品进行过筛处理具体为用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛，取筛上物和筛下物，液氮研磨后取样。3.如权利要求1或2所述的油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述收集菌丝并提取DNA具体为菌株用PDA培养基繁殖后收集菌丝，液氮研磨后取菌丝粉，用植物基因组提取试剂盒提取DNA。4.如权利要求1所述的油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25μL，包括12.5μL2XPremixExTaq、5yM步骤(1)设计的引物和探针各1“1^、1“14莫板0嫩、0.5口1^50XROXReferenceDyeII、加无菌水补至25μL。5.如权利要求1或4所述的油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为95°C预变性10s，然后以95°C15s,60°CImin进行40个循环。6.一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物，其特征在于，其序列为Lmb3:5，-caccaattggatccccta-3，(SEQIDNO.1)或其互补链；R25'-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3‘(SEQIDNO.2)或其互补链。7.一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的探针，其特征在于，其序列为=Probe-M:5’-FAM-cacttgggactcgccttg-MGB-3，(SEQIDNO.3)或其互补链。全文摘要本发明公开了一种油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针，根据油菜茎基溃疡病菌L.maculans与其近似种ITS序列的差异，设计了检测L.maculans的引物Lmb3(5’-caccaattggatccccta-3’)/R2(5’-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3’)和探针Probe-M(5’-FAM-cacttgggactcgccttg-MGB-3’)，建立了L.maculans的实时荧光PCR检测方法。该检测方法的灵敏度达到4pg菌丝DNA，整个检测过程控制在4小时内，其快速、特异和灵敏的特点可以满足进境油菜籽样品的快速初检以及病菌分离物的快速鉴定。文档编号C12Q1/68GK101805794SQ201010142449公开日2010年8月18日申请日期2010年4月8日优先权日2010年4月8日发明者周国梁,尚琳琳,易建平申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局