专利名称：：一种短小芽孢杆菌及其在防治杨树溃疡病中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于植物保护领域，尤其涉及一种短小芽孢杆菌及其在防治杨树溃疡病中的应用。
背景技术：
：杨树是重要的速生用材树种，具有颇高的经济价值和生态效益。然而，杨树在生长过程中不断受到病虫害的威胁。杨树溃疡病是一类危害严重的杨树枝干病害，病原种类繁多，症状多种多样，很难防治。目前，杨树溃疡病的防治主要以化学防治和培育抗性品种为主。采用抗病育种的方法虽然取得一定的效果，但却存在抗性退化、抗性较低等问题；而化学农药的大量使用又易造成环境污染和生态平衡破坏等。大量研究表明，生物防治在植物病害综合控制中有着不可替代的作用。近年来，拮抗细菌以其生长繁殖旺盛、易人工培养等优点受到人们的普遍关注，己成为生物防治应用的主力军。拮抗细菌是否发挥其生防作用，主要取决于是否能在植物体上有效定殖。因此，从杨树生态系统中分离筛选对杨树溃疡病原真菌具有拮抗作用的生防细菌，并进一步利用开展对杨树溃疡病的生物防治，是一种较为理想的控制杨树溃疡病的方法。芽孢杆菌(Sac///^^;;.)在自然界分布非常广泛，生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态优势种群之一。它们可以产生丰富的具有潜在植物病害防治和医学应用价值的抗菌物质，是植物病害生防微生物的重要组成部分(Tamenhiro，2002;蒙显英，2004)。而且芽孢杆菌内生芽孢，繁殖能力强，有利于工业生产，是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人无害，不污染环境。Mari等(1996)研究发现短小芽孢杆菌(及/ww7m)对某些真菌及病菌具有拮抗作用，是一种有开发前途的生防菌。目前国外主要将短小芽孢杆菌应用于防治蔬菜的根际病害，Akhtar等(2008)报道短小芽孢杆菌用于防治鹰嘴豆根腐病有很好的效果；近年来，我国也有用短小芽孢杆菌防治番茄灰霉病、黄瓜菌核病菌等植物病害的报道(李桂霞等，2009;于婷等，2009)。但短小芽孢杆菌防治杨树溃疡病国内外未见报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种高效防治杨树溃疡病的短小芽孢杆菌。本发明还要解决的一个技术问题是提供上述短小芽孢杆菌的用途。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下高效防治杨树溃疡病的短小芽孢杆菌(^d//iwj^m7^)JK-SXOOl，是一种从杨树干部筛选获得的对杨树溃疡病菌具有拮抗作用且具有内生性的生防细菌菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号M209026。短小芽孢杆菌(5ad/topwm7w)JK-SX001在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落较大，淡黄色，直径一般5~6mm，圆形，边缘整齐，中间有褶皱，光滑湿润，菌体直杆状，大小为lx(l2)pm，周生鞭毛。革兰氏染色表现为阳性；淀粉水解阴性；兼性好氧；氧化酶反应为阴性；过氧化氢酶反应阳性。测得16SrDNA大部分序列1448bp，具体如SEQIDNo:1所示。16SrDNA基因序列已提交GenBank，登记号GQ169785。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，能在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与JK-SX001菌株相似性最高的是5ad//^戶m/to，同源性达到99%。构建进化树发现，JK-SX001与Bfld〃wspmm7ws同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近。Biolog公司根据细菌代谢的氧化-还原过程，于1989年推出了用于细菌鉴定的Biolog自动鉴定系统。该系统利用细菌对95种碳源的代谢情况来鉴定菌种，即每种细菌形成各自特有的代谢指纹图谱，选用四唑紫作为细菌能否利用供试碳源的指示剂。与传统方法相比，Biolog系统具有自动化和标准化程度高、结果快速准确和操作简便等优点。Biolog细菌鉴定系统己广泛应用于细菌快速鉴定。通过Biolog系统对JK-SX001进行鉴定，该菌株在鉴定板培养1624h时的读数相似值(SIM值)为0.802，大于0.50，符合Biolog系统关于理想结果的要求，而且鉴定结果的相似性(PROB)都为99%，因此该菌株利用Bi0l0g系统，准确鉴定到了种，为短小芽孢杆菌(^￡77/^/7,//船)。上述短小芽孢杆菌(&cZ/to戸m/^)JK-SX001及其代谢产物对杨树溃疡病原金黄壳囊孢菌(Cyosporac/20^o^ew7fl)、拟茎点霉(P/wj"o;w"sp.)和七叶树壳梭孢菌(50^70^toen'G^AWea)都具有一定的抑菌作用，因此能够高效防治杨树溃疡病。并且上述短小芽孢杆菌(Sad/^pmrn'/^)JK-SX001对杨树还具有促生长的作用。上述短小芽孢杆菌(^^7/^;"附//^)JK-SX001产生抑菌物质最多的最佳发酵条件如下培养基每1000mL蒸馏水，含牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，pH8。工艺条件为pH8，通气量l:1，28°C，摇床转速200转/分，发酵48小时。通过上述发酵工艺得到的发酵液即为一种微生物杀菌剂。该发酵液直接施加到土壤中对植物进行灌根处理即可发挥其杀菌作用。有益效果(1)短小芽孢杆菌(Ba"7/wpww7w)JK-SX001为植物内生菌，对杨树溃疡病菌抑制作用强，具有拮抗细菌在植物病害生物防治中所起到的非常重要的作用'例如数量众多，在植物体内外大量存在；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；在植物体内外定殖力强；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；促进植物的生长等优点，尤其是对杨树溃疡病的防治具有重要意义。(2)短小芽孢杆菌JK-SX001培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。短小芽孢杆菌(^ad〃^;w/m7^)JK-SX001，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号M209026，保藏日2009年2月18日。图1短小芽孢杆菌JK-SX001对杨树的促生长作用照片。图2~图4短小芽孢杆菌JK-SX001对杨树溃疡病温室防治照片。具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例l:短小芽孢杆菌JK-SX001对杨树溃疡病原金黄壳囊孢菌(Q;toy/7orac^7sos;grwa)、拟茎;"^、霉(尸/wmo/wz.51sp.)、七叶树壳梭孢菌(尸ws/coccwmaescw//)平板抑菌作用。将用NA斜面活化的短小芽孢杆菌JK-SX001菌株划线接种于PDA平板两侧，再将杨树溃疡病病原菌PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，点接于平板中间。28'C培养4天观察抑菌带的有无，并记录其宽度(表l)。试验结果表明，JK-SX001对三种病原菌均有强拮抗作用。表1JK-SX001对3种杨树溃疡病病原菌的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例2:短小芽孢杆菌JK-SX001的代谢产物对3种杨树溃疡病原菌(包括拟茎点霉(尸/wj"o/w^sp.)、金黄壳囊孢菌(Cytos/orac/o^aspe/7wa)、七叶树壳梭孢菌(fmw.coccwmae;yc"//))的平板抑菌作用。在PDA平板上铺上无菌玻璃纸，涂布接种短小芽孢杆菌JK-SX001，3(TC培养48小时，揭去玻璃纸，再分别在平板中央接种病原菌，28'C培养。以不接生防菌对照，待对照菌丝长满平板后，观察拮抗活性，并统计抑菌率(表2)。试验结果表明，JK-SX001代谢产物对三种病原菌均有强拮抗作用。表2JK-SX001的代谢产物对3种病原菌的抑制处理金黄壳囊孢菌(mm)拟茎点霉(mm)七叶树壳梭孢菌(mm)JK-SX0015.006.567.12对照CK79.0278.4578.66抑菌率(％)10097.8897.12实施例3:短小芽孢杆菌JK-SX001对美洲黑杨实生苗150天的促生长情况。将短小芽孢杆菌JK-SX001接种于NB培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH7.27.4，蒸馏水lL)发酵48小时，用发酵液浸泡美洲黑杨种子3小时，无菌水冲净后，进行播种。以无菌水浸泡种子为对照。苗高15cm定苗，每盆4株，150天后测量苗高、地径。与对照相比，接种JK-SXOOl发酵液能够显著的促进实生苗的生长(表3)。与对照(CK)相比，接种JK-SX001的处理在地茎和苗高上差异显著，促生效果明显，见图l。表3JK-SX001对杨树实生苗生长的影响菌株地径(cm)苗高(cm)JK-SX0014.77a35.34a对照CK2.56b24.75b注P<0.05短小芽孢杆菌JK-SXOOl内生性试验。将用利福平(300微克/毫升)标记过的短小芽孢杆菌JK-SX001接种于NB培养基发酵48小时，用该菌株48小时发酵液浸泡美洲黑杨种子3小时，无菌水冲净后，进行播种。以无菌水浸泡种子为对照。苗高15cm定苗，每盆4株，30天后分别采集杨树苗的叶子和干部0.5克，将其表面消毒后，力卩2mL无菌水研磨，分别涂布于利福平(300微克/毫升)的NA平板。3(TC培养4天，观察平板是否有短小芽孢杆菌JK-SX001菌落长出。结果表明，叶子和干部均能回收到短小芽孢杆菌JK-SXOOl。这说明JK-SX001能在杨树体内较长时期存在，其具有内生性。实施例5:短小芽孢杆菌JK-SX001对温室盆栽苗杨树溃疡病的防治情况。用打孔器分别在金黄壳囊孢菌(Cyas/orac/w^o^wma)、拟茎点霉(P/wmo/w^平)、七叶树壳梭孢菌(Aw'coco/w"eww//)菌落边缘处均匀打孔，获得大小、生长速度一致的菌丝块。接种的杨树苗用单面的手术刀片分别在苗干离地面1米处和离地面1.52米处做烫伤处理，然后在烫伤处斜切一小伤口，用镊子分别将3种病原菌菌丝块轻轻放在切好的伤口部位，用封口膜将菌丝块固定在树皮下的伤口内，并放上一小块带有无菌水的棉球保湿。病原菌接种后用JK-SX001液体杀菌剂(109cfij/mL)进行杨树苗土壤灌根处理，每株50mL。共设3个处理(Tl:接种金黄壳囊孢菌及JK-SX001、T2:接种拟茎点霉及JK-SX001、T3:接种七叶树壳梭孢菌及JK-SX001)，每处理30个重复，以无菌水灌根为对照(CK1:接种金黄壳囊孢菌、CK2:接种拟茎点霉、CK3:接种七叶树壳梭孢菌)，另外设一个不接病原菌，以无菌水土壤灌根对照(CK)，以校正发病率，每对照同样30个重复。上述JK-SX001液体杀菌剂按如下方法制得培养基每1000mL蒸馏水，含牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，pH8。工艺条件为pH8，通气量l:1，2S。C，摇床转速200转/分，48小时。1个月后调查发病情况，结果如表4所示。大部分用JK-SX001液体杀菌剂处理过的苗木接种口愈合，对照病原菌大部分接种口及周围产生黑色子实体及金黄色分生孢子角，个别严重者整株死亡。说明接种短小芽孢杆菌JK-SX001能很好的防治杨树溃疡病的发生。对金黄色壳囊孢菌引起的杨树溃疡病的防治效果见图2(A、示对照的发病情况B、示接种JK-SXOOl后没发病的健康组织)。对拟茎点菌引起的杨树溃疡病的防治效果见图3(A、示对照的发病情况B、示接种JK-SX001后没发病的健康组织)。对七叶树壳梭孢菌引起的杨树溃疡病的防治效果见图4(A、示对照的发病情况B、示接种JK-SX001后没发病的健康组织)。表4室内杨树溃疡病防治效果处理发病率(％)感病指数防治效果(％)Tl158.7670.06CK16536.42/T2127.0275.76CK25728.98/T31610.7465.16CK36030.83/SEQUENCELISTING〈110〉南京林业大学<120〉一种短小芽孢杆菌及其在防治杨树溃疡病中的应用〈130〉njfufp090322<腸1<170〉Patentlnversion3.3<210>1<211〉1448〈212〉DNA〈213〉短小芽孢杆菌(^adZ/^/^w/Zw^)<400>1CCTTGTCACTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAA60CTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCT120GATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAAC180TGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTAAACCTTGCGGTCTCGCAGCCCTTTGTTCTGTCCA240TTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCT300TCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGA360TCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAA420GGGAAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAG480GATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGC540TTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGG600AGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCA660TCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCC720TCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTAC780GCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTT840CCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCG900AGCCCTTTACGCCCAATAATTCCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGC960TGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCAAGCAGTTACTCT1020TGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCG1080GCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGG1140AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATC1200GTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAG1260TGACAGCCGAAACCGTCTTTCATCCTTGAACCATGCGGTTCAAGGAACTATCCGGTATTA1320GCTCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCC1380GTCCGCCGCTAACATCCGGGAGCAAGCTCCCTTCTGTCCGCTCGACTGCATGTATAGCAC1440GCGCCCGT1448权利要求1、一种短小芽孢杆菌JK-SX001，其分类命名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号是M209026，保藏日期2009年2月18日。2、权利要求1所述的短小芽孢杆菌在防治杨树溃疡病中的应用。3、权利要求1所述的短小芽孢杆菌在促进杨树生长中的应用。4、一种防治杨树溃疡病杀菌剂，其特征在于该杀菌剂按如下方法制备将短小芽孢杆菌JK-SX001接种于培养基中，pH8，通气量l:1，28°C，摇床转速200转/分，48小时，得到的发酵液即为防治杨树溃疡病杀菌剂。5、根据权利要求4所述的防治杨树溃疡病杀菌剂，其特征在于所述培养基中，各物质含量如下每1000mL蒸馏水，含牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，pH8。全文摘要本发明公开了一株短小芽孢杆菌JK-SX001，其分类命名为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号是M209026，保藏日期2009年2月18日。本发明还公开了上述短小芽孢杆菌在防治杨树溃疡病中的应用和在促进杨树生长中的应用。本发明还提供了一种防治杨树溃疡病杀菌剂，即将JK-SX001接种于培养基中发酵培养所得。本发明的JK-SX001为植物内生菌，对杨树溃疡病菌抑制作用强，且培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。文档编号C12N1/20GK101643711SQ200910027349公开日2010年2月10日申请日期2009年5月31日优先权日2009年5月31日发明者任嘉红,叶建仁,吴小芹,王艳芳申请人:南京林业大学