专利名称：葡萄溃疡病菌快速检测引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一对葡萄溃瘍病菌Neofusicoccum parvum菌种快速分子检测引物及
其应用。
背景技术：
葡萄溃瘍病(Grape Botryosphaeriaceae Canker)是由葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)真菌侵染引起的一种病害，近年来在世界范围内危害日益加重， 在埃及、美国、匈牙利、意大利、葡萄牙、西班牙、南非和中国等14个国家均有发生并造成了严重的损失。目前，已知葡萄座腔菌科中的15个种能够引起该病害(Auger J, EsterioM,Ricke G，et al. Black dead arm and basal canker of Vitis vinifera cv. Red Globecaused by Botryosphaeria obtusa in Chile [J]. Plant Disease. 2004, 88(11):1286.Niekerk J M，Fourie P H，Hallenn F，et al. Botryosphaeria spp.as grapevinetrunk disease pathogens [J]. Phytopathologia Mediterranea. 2006，45(4):43-54.U Rbez-Torres J R，Peduto F，Striegler R K，et al.Characterization of fungalpathogens associated with grapevine trunk diseases in Arkansas and Missouri[J].Fungal Diversity. 2012:1-21. U Rbez-Torres J R，Gubler W D.Pathogenicity ofBotryosphaeriaceae species isolated from grapevine cankers in California[J].Plant Disease. 2009，93 (6) : 584-592.)，在我国已发现并报道的葡萄溃疡病病原菌有 Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae 和 Diplodia seriata 三个种(Li X H，Yan JY, Kong F F，et al. Botryosphaeria dothidea causing canker ofgrapevine newly reported in China [J]. Plant Pathology.2010, 59 (6):1170. YanJ Y，Peng Y L，XieY，et al. First Report of Grapevine Trunk Disease Caused byBotryosphaeria obtusa in China[J]. Plant Disease. 2011, 95 (5):616. Yan J Y，Li XH，Kong F F，et al. Occurrence of Grapevine Trunk Disease Caused by Botryosphaeriarhodina in China[J] Plant Disease. 2011，95 (2):219.Yan JY, XieY, Yao S W, etal.Characterization of Botryosphaeria dothidea, the causal agent of grapevinecanker in China[J]. Australasian Plant Pathology. 2012，41:351-357.)。现阶段对于病原菌真菌的鉴定，以常规的形态学鉴定为主，但由于葡萄溃疡病菌种类繁多且种间形态差异较小，使得传统鉴定方法耗时耗力，迫切需要现代分子技术手段解决该问题。近年来，以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术为平台的病原生物分子检测技术，已被广泛应用于动植物病害的诊断及病原菌的鉴定。但在葡萄溃疡病菌检测方面，国内至今还未有分子检测技术的系统研究。葡萄溃疡病菌的快速检测技术，有助于了解我国葡萄溃疡病菌的种群分布，对葡萄溃疡病的有效防治及葡萄抗病品种的选育等方面有指导作用
发明内容
本发明的目的是提供一对葡萄溃瘍病菌Neofusicoccum parvum菌种特异性分子检测引物以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的葡萄溃疡病菌的快速分子检测方法。本发明所提供的快速检测葡萄溃瘍病菌Neofusicoccum parvum菌种的引物,名称为B. p-F/B. p-R，它们的核苷酸序列分别为序列表中序列I和序列表中序列2。本发明还提供一种快速检测葡萄溃瘍病菌Neofusicoccum parvum菌种的试剂盒，包括上述引物。所述试剂盒还可以包括PCR反应试剂盒。PCR反应试剂盒可以从商业途径获得，也可以自己配置。
本发明还提供利用上述检测引物B. p-F/B. p-R检测葡萄溃瘍病菌Neofusicoccumparvum菌种的方法,包括以下步骤I)提取待测样品DNA，以该DNA为模板，用权利要求I所述的引物进行PCR扩增；2)鉴定步骤I)所述的PCR扩增产物的大小，将扩增产物中含有一个370bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有Neofusicoccum parvum菌种的样品。PCR反应体系为25ii L，包括待测样品DNA (约5ng)，上游正向引物和下游反向引物(10iimol/L)各0. L(即终浓度为 0. 2iimol/L)，dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的终浓度均为 2. 5mmol/L, 2. 5 u L10父？0 缓冲液(100_01/1 Tris-HCl pH8. 3, 500mmol/LKCl, 15mmol/L MgCl2)和 0. 25 y LTaq DNA聚合酶(5U/iiL，添加终浓度为0.05U/iil)，其余部分用ddH20补足；PCR 条件为94°C预变性 4min ；30 个循环的 94°C 45s，61。。30s 和 72°C 30s ；72°C延伸IOmin0步骤2)中所述鉴定步骤1)PCR扩增产物的大小的方法是取5 ii L PCR产物用质量百分浓度为I. 2%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据有无扩增产物判定结果。扩增产物中含有一个370bp的DNA片段的待测葡萄溃瘍病菌(Botrysphoraeriaspp.)菌株为属于Neofusicoccum parvum菌种的菌株。所述待测样品DNA采用NaOH法提取，DNA提取步骤如下I)将待测样品称重后，每mg样品加入30 ii L 0. 5mol/LNa0H溶液，充分研磨；2)将步骤I)研磨后的样品离心取上清液，每IOii L上清液加入490 ii L 0. ImmoI/LpH8. 0的Tris-HCl，混匀后得到待测样品DNA，直接用于PCR反应。上述引物可应用于筛选引起葡萄溃疡病的病原菌,特别是筛选葡萄座腔菌属菌种Neofusicoccum parvum,而且可以在Neofusicoccum parvum菌量较少的情况下检测到Neofusicoccum parvum的存在,实验证明，当待测样品浓度达IOpg时即可检出，表明上述方法具有较高的灵敏性。同时，本发明的引物可以缩短对葡萄溃瘍病菌Neofusicoccumparvum菌种进行鉴定的时间，从而较快地鉴定出Neofusicoccum parvum菌种,达到克服传统鉴定方法步骤繁琐、鉴定周期长等问题的目的。
图I为本发明的引物B.p-F/B. p-R特异性检测的结果，图中，泳道M为分子量MarkerCDL2000pIus DNA Marker),泳道1-5分别为分离自我国不同地区的Neofusicoccumparvum菌株,6-9 :葡萄溃瘍病菌Lasiodiplodia theobromae ； 10-14 ;葡萄溃瘍病菌Botryosphaeria dothidea ; 15-16 :葡萄溃瘍病菌 Diplodia seriata ； 17 :葡萄穗轴褐枯病菌 Alternaria viticola ； 18 :葡萄枝枯病菌 Pestalotia menezesiana ； 19 :葡萄炭疽病菌Glomerella cingulata ;20 :葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea ；21 :葡萄白腐病菌Conielladiplodiella ；22 :葡萄蔓枯病菌Phomopsis viticola 23是以ddH20为模板的PCR扩增结果。图2为本发明的引物灵敏性检测的结果，泳道M为分子量Marker(DL2000plus DNAMarker)，泳道1-7分别是以浓度分别为10，1，10-1，10_2，10_3，10_4，10_5ng/y L葡萄溃疡病菌N. parvum基因组DNA为模板的PCR扩增产物。
图3为本发明的引物检测发病葡萄枝条中Neofusicoccum parvum的结果,泳道M为DL2000plus DNA Marker,泳道I为阳性对照，模板为葡萄溃瘍病菌Neofusicoccumparvum DNA,泳道2为阴性对照，PCR模板为健壮枝条DNA，泳道3为空白对照，以ddH20模板，泳道4、5为以发病葡萄枝条DNA为模板的扩增结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。实施例I、用于快速检测葡萄溃瘍病菌Neofusicoccum parvum的引物及其应用—、用于葡萄溃瘍病菌Neofusicoccum parvum快速检测的引物的获得将本实验室测序得到的5个Neofusicoccum parvum的ITS序列与GeneBank中葡萄座腔菌属中20个不同种的ITS序列(登录号分别为⑶251147;HQ529768;JN088510;⑶292676;FJ904819;EU683673;HQ288230;EF585518;JN088050;HQ625634;FJ888469;JN849098;JN035222;FJ904815;EU331085;DQ458889;HQ629954;AY236954;EU520175;AB454278)进行同源性比较，根据Neofusicoccum parvum与其它种间的差异位点设计Neofusicoccumparvum的特异性引物，所得引物即为本发明的引物B. p-F/B. p-R。引物序列为上游正向引物B. p-F序列5’ -AAAACTCCAGTCAGTGAACTTC-3’(序列表中序列I);下游反向引物B. p-R序列5’ -GGTCAACCTTGAGAAATAAITCAAAG-3’(序列表中序列 2)。二、本发明的用于葡萄溃瘍病菌Neofusicoccum parvum快速检测的引物(B. p-F/B. p-R)的效果验证I、引物合成B. p-F/B. p-R引物上游正向引物B.p_F序列为5’ -AAAACTCCAGTCAGTGAACTTC-3’，下游反向引物 B. p-R 序列为5’ -GGTCAACCTTGAGAAATAATTCAAAG-3’，委托上海生工生物技术有限公司合成。2、B. p-F/B. p-R 引物对的检测 Neofusicoccum parvum 的准确性验证以下研究中所用菌株5株分别分离自我国不同地区的Neofusicoccum parvum菌株,4株葡萄溃瘍病菌Lasiodiplodia theobromae ；5株葡萄溃瘍病菌Botryosphaeriadothidea ;2株葡萄溃瘍病菌Diplodia seriata ;葡萄穗轴褐枯病菌Alternariaviticola ;葡萄枝枯病菌 Pestalotia menezesiana ;葡萄炭疽病菌 Glomerellacingulata ;葡萄灰霉病菌Botrytis cInoiTGci ;儒1 甸白腐病国 Coniellsi diplodiolIci ;儒1 甸蔓枯病菌Phomopsis spp.。上述菌株的鉴定方法如下采用常规组织分离法(方中达.植病研究方法[M].第三版.北京中国农业出版社.1998 :122-137.)，分别从田间采集的葡萄病组织的病健交界处进行分离得到菌株的纯培养，将其斜面培养物置于4°C冰箱中保存备用。 (I)病原真菌形态学鉴定方法
分离纯化的菌株于28°C培养箱中黑暗培养3-7d，肉眼观察菌落形态特征，在光学显微镜下观察培养病菌的分生孢子形态，并测量其大小。将分离纯化的病菌打成菌饼，采用有伤、无伤2种接种方法接种葡萄绿枝条，接种后在25°C下保湿培养，同时接种空白培养基作为对照，定期观察发病情况。根据柯赫氏法贝U，对发病组织进行再分离，显微镜下观察分离得到的病菌是否与原接种菌株相同。(2)真菌rDNA-ITS区的分子鉴定采用CTAB法提取菌株DNA，PCR扩增其rDNA — ITS区段，PCR反应体系为(25 u L)IOX 缓冲液(含 100mmol/L Tris-HCl pH8. 3,500mmol/L KCl, 15mmol / L Mg2+) 2. 5 u L,dNTP(各 2. 5mmoL / L) 2 uL, IOumol / L 引物 ITS1、ITS4 各 0. 5 y L (引物序列为ITS15，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，，ITS45，-TCCTCCGCTATGAATGC-3，)，Taq DNA 聚合酶(5U / u L)0. 25 iiL，模板 Iii L，双蒸水 17. 25u L0 PCR 反应条件94 °C 预变性 3min ;94°C 30s, 59°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环；72°C延伸 lOmin。PCR 产物的检测取 L PCR扩增产物于0. 8%的琼脂糖凝胶上电泳检测，电泳缓冲液为1XTAE。电泳后的凝胶浸在0.5g / mL溴化乙锭染色液中染色15-20min，清水冲洗后，置于UV紫外成像系统上观察成像，并拍照。在每次试验中都要设阴性对照(不含模板DNA)。PCR产物送北京三博远志公司做正反双向测序，利用BioEdit软件拼接得完整序列。将测序结果在http:"www. ncbi. nlm. nih. gov/网站上利用BLAST下的nucleotide-nucleotide blastn与GenBank上已经发表的基因进行对比，对菌株进行鉴定。根据病原菌的产孢特征及其在PDA培养基上的形态特征以及柯赫氏法则的验证结果，参照文献(Yan J Y,Li X H，Kong F F，et al. Occurrence of Grapevine Trunk DiseaseCaused by Botryosphaeria rhodina in China [J]. Plant Disease.2011, 95 (2):219.Li X, Yan J, Kong F, et al.Botryosphaeria dothidea causing canker of grapevinenewly reported in China[J]. Plant Pathology. 2010, 59(6):1170. Yan JY, XieY, YaoS ff, et al. Characterization of Botryosphaeria dothidea, the causal agent ofgrapevine canker in China[J] Australasian Plant Pathology. 2012, 41:351-357.Yan JY, Peng Y L, Xie Y, et al. First Report of Grapevine Trunk Disease Caused byBotryosphaeria obtusa in China[J]. Plant Disease. 2011, 95(5):616. U Rbez-TorresJ R, Gubler ff. D. Occurrence of Botryosphaeria obtusa, B. dothidea, and B. parvaAssociated with Grapevine Trunk Diseases in Castilla y Leon Region, Spain[J].Plant Disease. 2006,90(6) :835.赵奎华.葡萄病虫害原色图鉴[M] 北京中国农业出版社 2006 :12-17, 30-41，50-57，74-77.)及 rDNA-ITS 比对结果进行病菌鉴定。
采用CTAB法分别提取上述菌株的基因组DNA，以引物对B. p-F/B. p-R进行PCR扩增实验。以ddH20为模板的PCR扩增结果为对照。PCR反应体系为25 u L，包括待测样品DNA (约5ng)，上游正向引物和下游反向引物(10mmol/L)各 0. 5 u L (即终浓度为 0. 2 u mol/L), 2 u L dNTPs (即 dATP、dCTP、dGTP、dTTP的终浓度各 2. 5mmol/L),2. 5u L 10XPCR 缓冲液(lOOmmol/LTris-HCl pH8. 3,500mmol/LKCl, 15mmol/L MgCl2)和 0. 25 y L Taq DNA 聚合酶(5U/y L，添加终浓度为 0. 05U/y I )，其余部分用ddH20补足。PCR 反应程序为94°C预变性 4min ；30 个循环的 94°C 45s，61°C 30s 和 72°C 30s ；72°C延伸 lOmin。PCR扩增产物用质量百分浓度I. 2%琼脂糖凝胶电泳分析。结果见图I。结合PCR扩增实验结果，分析如下供试的所有菌株中，只有5株Neofusicoccum parvum扩增得到 一条370bp的DNA特异性扩增片段，其余菌株中均扩增不到任何条带。因此，引物B. p-F/B. p-R可以用于Neofusicoccum parvum的快速检测，并具有很高的准确性。3、B. p-F/B. p-R 引物对的检测 Neofusicoccum parvum 的灵敏性验证将菌株Neofusicoccum parvum基因组DNA浓度调整为IOii g/ii L,按10的数量级逐步向下稀释至10_5ug/uL作为模板，进行PCR扩增，PCR体系和反应程序按照步骤2中所述,PCR产物用I. 2%的琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图2,当Neofusicoccum parvum DNA浓度大于或等于IOpg时，利用引物对B. p-F/B. p-R可以特异性的扩增得到370bp的DNA条带，但当浓度小于IOpg后，则扩增不到条带，因此该对引物可以检测到基因组DNA浓度高于IOpg 的 Neofusicoccum parvum。4、本发明方法样品DNA提取的优化将Neofusicoccum parvum接种于PDA平板上,28°C培养24h后用5mm打孔器在菌落边缘打取菌饼，刺伤接种于葡萄绿枝条上，25°C培养至出现可见病斑，切取病健交界处组织块，按照 Wang 等(Wang H，Qi M, Cutler A J. A simple method of preparing plantsamples for PCR[J]. Nucleic Acids Research. 1993，21(17):4153-4154)的 NaOH 法(稍作改进)提取发病组织和健壮植株组织的基因组DNA，以引物对B. p-F/B. p-R进行PCR扩增实验。结果表明，B. p-F/B. p-R能够在由Neofusicoccum parvum侵染的葡萄枝条组织DNA中检测到Neofusicoccum parvum的存在,见图3,证明改进后NaOH提取DNA的方法是可行的。NaOH法DNA提取步骤如下I)组织块称重后，每mg组织加入30 ii L 0. 5mol/LNa0H,充分研磨；2) 12，OOOrpm 离心 5min ;取 10 u L 上清液加入 490 u LO. lmmol/L Tris (pH8. 0),混匀后直接用于PCR反应。
权利要求
1.一对引物，它们的核苷酸序列分别为序列表中序列I和序列表中序列2。
2.—种检测葡萄溃瘍病菌Neofusicoccum parvum菌种的试剂盒,包括权利要求I所述的引物。
3.权利要求I所述的引物在辅助鉴定葡萄溃瘍病菌Neofusicoccumparvum菌种中的应用。
4.权利要求2所述的试剂盒在辅助鉴定葡萄溃瘍病菌Neofusicoccumparvum菌种中的应用。
5.一种鉴定葡萄溃瘍病菌Neofusicoccum parvum菌种的方法,包括下述步骤 1)待测样品DNA为模板，用权利要求I所述的引物进行PCR扩增； 2)鉴定步骤I)所述的PCR扩增产物的大小，将扩增产物中含有一个370bp的DNA特异性扩增片段的待测样品鉴定为含有Neofusicoccum parvum菌种的样品。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR扩增的反应体系为PCR反应体系为25ii L，包括待测样品DNA，上游正向引物和下游反向引物的终浓度均为0. 2umol/L ；dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 的终浓度均为 2. 5mmol/L ；2. 5u L IOXPCR 缓冲液；Taq DNA 聚合酶添加终浓度为0. 05U/ii L，其余部分用ddH20补足；所述IOXPCR缓冲液为由lOOmmol/LTris-HCl pH8. 3,500mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2 组成的溶液; PCR 反应程序为94°C预变性 4min ；30 个循环的 94°C 45s，61。。30s 和 72°C 30s ；72°C延伸IOmin0
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述待测样品DNA采用NaOH法提取，DNA提取步骤如下 1)将待测样品称重后，每mg样品加入30ii L 0. 5mol/LNaOH溶液，充分研磨； 2)将步骤I)研磨后的样品离心取上清液，每IOiiL上清液加入490 ii L 0. ImmoI/LpH8. 0的Tris-HCl，混匀后得到待测样品DNA，直接用于PCR反应。
全文摘要
本发明公开了一对用于快速检测葡萄溃疡病菌Neofusicoccum parvum菌种的引物及其应用。该对引物，它们的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2，能够在葡萄溃疡病菌Neofusicoccum parvum特异性的扩增出370bp的产物，对Neofusicoccum parvum菌种基因组DNA的灵敏度可达10pg。这表明该引物对可以用于田间葡萄病样中Neofusicoccum parvum菌种的快速可靠的检测和鉴定，克服传统鉴定方法步骤繁琐、鉴定周期长等问题。
文档编号C12Q1/68GK102747078SQ201210229358
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月3日 优先权日2012年7月3日
发明者严红, 张玮, 李兴红, 燕继晔 申请人:北京市农林科学院