专利名称：丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及ー种疾病病原体基因检测技木，尤其涉及一种丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒及方法，用于检测国内发生的丙型肝炎病毒的型别la，lb, 2a，2b，3a，6a感染的辅助诊断。
背景技术：
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV),丙型肝炎呈世界性分布,人群普遍易感，是严重危害人类健康、流行范围广泛的传染病。其 病原体为丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus，HCV)。目前，其感染率为0. 1%-10%，平均为3%。全球有超过I. 7亿人感染HCV，其中每年有超过10万例HCV患者发展为肝癌，进而出现消化道出血及腹水。根据WH02002年年报，在2001年，慢性肝病引起1400万例死亡，包括79. 6万例由肝硬化引起、61. 6万例由原发性肝癌引起。HCV是正性单链RNA黄病毒，包括9400左右个核苷酸。HCV基因组具有一个单独的开放阅读框，基因结构由5’ -NCR-C-EI-E2-NSI-NS2-NS3-NS4-NS5-N-CR-3’组成，编码ー具有3010个氨基酸的多聚蛋白体，翻译后被分为病毒复制和病毒粒形成所必须的结构和非结构蛋白。HCV具有高度的变异性(其变异率高达I. 4-1. 9 X 10-3/核苷酸/年)和本身具有负选择作用的特征，高突变是由于复制酶无校正功能；易误性RDRP(error-prone RDRP,EP-RDRP)的存在以及正选择作用等原因。而其本身具有负选择作用又表现为病毒基因组中各种基因结构及功能不同，有些区域高度保守。根据全世界不同地区分离的HCV不同株的全部或部分基因组的系统进化分析，HCV分为6种主要的基因型(以1-6表示)，各型又分亚型(以a、b、c等表示)。HCV亚型已经超过100个，其中最常见的是la，lb，2a，2b，3a，6a，各型核酸序列之间相差31 — 34%，氨基酸序列相差大约30%，而亚型序列之间相差约20 — 23%。有几种HCV病毒株主要从东南亚被分离出，被命名为HCV7，8，9，10，11型，除了HCVlOa型(目前被列入HCV3型)，由于其系统进化上的相似性，其余各型被列入HCV6型。研究表明，HCV不同型别之间对干扰素治疗的敏感度不一，特别是I型较其它型别敏感度尤为差。不同型别HCV感染性肝炎，其急性、慢性的中度及重度、肝炎后肝硬化及原发性肝癌发生率都有不同，HCV基因型与丙型肝炎患者临床病情及其严重程度密切相关。鉴于不同HCV基因型感染者的临床表现、肝病严重程度及慢性化病程进展均有差异，抗病毒治疗的效果也不同。因此检测HCV基因型有助于判断治疗的难易程度、制定个体化抗病毒治疗方案。目前对HCV基因分型方法主要有限制性长度多态性分析法(RFLP)，基因型特异性引物PCR法，基因型特异性探针核酸杂交分析法，直接测序法等方法，但是这些方法大多存在操作繁琐，对设备要求高，检测时间长，通量低，还存在灵敏度低，特异性不高等缺点。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，制造具有高通量、高准确性的丙型肝炎病毒基因分型的基因芯片和试剂盒及方法，可以一次性对多个样本中HCV进行准确分型检测，节省检测时间。本发明技术方案为提供一种丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，主要包括PCR反应液和DNA杂交膜条，所述DNA杂交膜条包括尼龙膜，所述尼龙膜上固定有探针，所述探针为可分别与丙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸杂交的核苷酸，所述探针序列如下所示针对HBVla 型设计探针 Yl :5’ -AAITGCCAGGACGACCGG-3’ ；针对HBVlb 型设计探针 Y2 :5’ -AAITGCCAGGATGACCGGG-3’ ；针对HBVlb 型设计探针 Y3 :5’ -CCCGGAAITGCCAGGAC-3’ ；
针对HBV2a 型设计探针 Y4 :5 ’ -CAATGCCTGGAGATTTGGGCG-3 ’ ；针对HBV2a 型设计探针 Y5 :5 ’ -CAATGCCTGGAGATTTGGGC-3 ’ ；针对HBV2b 型设计探针 Y6 :5’ -CTCAATGCCTGGAGAITTGG-3’ ；针对HBV2b 型设计探针 Y7 :5’ -GCTCAATGCCTGGAGAITTGG-3’ ；针对HBV3a 型设计探针 Y8 :5 ’ -CAATGCCTGGAGATTTGGG-3 ’ ；针对HBV3a 型设计探针 Y9 :5 ’ -CGAGGTAGACGTCAGCC-3 ’ ；针对HBV3a 型设计探针 YlO :5’ -ACCTCGAGGTAGACGTCAGCC-3’ ；针对HBV6a 型设计探针 Yl I :5’ -AACCTCGAGGTAGACGTCAGCC-3’ ；针对HBV6a 型设计探针 Y12 :5’ -GCAACCTCGAGGTAGACGT-3’ ；针对HBV6a 型设计探针 Y13 :5’ -TAGACGTCAGCCTATCCCCAA-3’ ；针对HBV1-6型设计通用探针(即阳性探针HP)Y14:5’ -TAGACGCCAGCCTATTCCCA-3’ ；阴性探针HN: 5 ’ -GGTCCTGTTTAACTGGCG-3 ’ ；所述各探针5’端进行氨基标记以与尼龙膜偶联。优选的，上述丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒中，所述尼龙膜上还设置有显色控制探针CC，所述显色控制探针CC序列如下所示5’-GCGCAGGGCCACAATAATGG-3’，所述cc探针5’端进行氨基标记，3’端进行生物素标记。优选的，上述丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒中，所述PCR反应液包括扩增丙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸的引物，所述引物序列如下所示逆转录引物RT :5’ -CGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’ ；上游引物F : 5 ’ -GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3，；下游引物R : 5，-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3，。所述上游引物F的5 ’端进行生物素标记。优选的，上述丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒中，所述PCR反应液还包括内參系统，所述内參照系统为拟南芥内參照系统，包括内參引物Fl :5’-TCATCGTCGCTGGAGCTGGIT-3，;内參引物Rl :5，-CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3，；内參探针PC :5’ -TGCCGATATAGGTCACAGCATGGGC-3’ ；所述内參引物Fl的5’端进行生物素标记。优选的，上述丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒中，所述探针浓度为5-20 u M0本发明的另ー技术方案为提供一种丙型肝炎病毒基因分型的方法，该方法包括下述具体步骤a、设计分型引物与探针，所述探针如权利要求I探针Y1-Y14所示，所述引物包括逆转录引物 RT :5’ -CGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’ ；上游引物F : 5，-GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3，；下游引物R : 5，-CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3，；b、用活性氨基标记步骤a所述探针的5’端，并将其依次固定在尼龙膜上，制成检测膜条，对所述下游引物R的5’端进行生物素标记；C、利用步骤a中所述引物进行HBV DNA 扩增，将扩增产物与检测膜条杂交，以过氧化物酶与四甲基联苯胺显色；d、采用扫描仪，扫描杂交信号，判断基因分型結果。优选的，上述的丙型肝炎病毒基因分型的方法，所述尼龙膜上还设置有显色控制探针CC，所述显色控制探针CC序列如下所示5’-GCGCAGGGCCACAATAATGG-3’，，所述显色控制探针CC的5’端进行氨基标记，3’端进行生物素标记。优选的，上述的丙型肝炎病毒基因分型的方法，所述步骤a中的引物还包括内參引物Fl :5’ -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3’ ；内參引物Rl :5，-CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3，；所述步骤a中的探针还包括内參探针PC :5，-TGCCGATATAGGTCACAGCATGGGC-3，；所述内參引物Fl的5’端进行生物素标记。本发明的丙型肝炎病毒基因分型的基因芯片和试剂盒及方法具有快速、灵敏、准确、高通量的特点，一次杂交反应可以检测多种靶序列，取材方便，无需特殊设备，仪器投入低，具有快速简便、敏感度高和特异性强的特点。
图I :本发明的HCV探针在尼龙膜上的排列示意图；图2 :1型HCV病毒样本检测结果扫描图；图3 :2型HCV病毒样本检测结果扫描图；图4 :3型HCV病毒样本检测结果扫描图；图5 :6型HCV病毒样本检测结果扫描图。
具体实施例方式为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。本发明的目的是制备一种丙型肝炎病毒(HCV)基因分型DNA杂交膜条，以满足大量血液样品进行HCV快速准确分型的需要。为此，本发明采用以下技术方案采用反向点杂交技术(Reverse Dot Blot,RDB),用尼龙膜作为固相载体，针对HCV不同基因型设计的特异性寡核苷酸探针，将HCV各特异性探针以圆点的方式固定在膜条上，制备成DNA杂交膜条，以生物素标记引物，扩增待检样本的目的核酸片断，获得带有生物素标记的扩增产物；再与固定各种寡核甘酸探针的膜条杂交，通过酶联反应和显色，扫描后以专业的斑点分析软件对图像进行识别、去除背景、进行客观的信号值分析，从而判断扩增产物中是否有针对各种寡核甘酸探针的基因序列，在结果判断中減少了人为识别的主观性因素，更适用于临床检测应用。本发明针对HCV不同型别的基因序列，设计ー套特异性寡核苷酸探针(如表I所示为寡核苷酸探针序列以及所检测的型别)，采用自动点样仪，将探针印制在一张尼龙膜的特定区域，根据显色位点的不同来判断HCV的型别。在上述的DNA杂交膜条的基础上再配以其它必要的组份，如PCR引物(如表2所示为本发明所用的引物序列)，即组成完整的产品。在实际检测时，取提取的HCV核酸样本溶液，采用生物素标记引物和不对称PCR方法，扩增出可能存在的HCV基因组生物素标记靶标片段。取DNA杂交膜条ー张，加入PCR产物4 5 ii L进行杂交，杂交温度设定为45°C，杂交时间60分钟，经过杂交-洗涤-显色。取出膜条晾干，放入扫描仪进行扫描，使用分析软件对扫描图像信号进行图像数据转换处理，并分析产生样本HCV型别結果。根据本发明的另ー个优选实施方案，在用于样本扩增的PCR体系中引入了内參引物，以及内參模板，并在膜条制备时引入了可与内參模板进行杂交的探针，可以对PCR过程进行有效质量控制。根据本发明的另ー个优选的实施方案，在制备膜条时引入了显色控制探针(CC.)，即在探针的一端标记-NH2，以与尼龙膜偶联，另一端引入生物素标记，可直接进行显色。CC的引入可以对显色过程进行有效质量控制。根据本发明另ー个优选的实施方案，DNA杂交膜条的片基载体可以是玻片、尼龙膜或其它可以附着探针的载体。表I
权利要求
1.丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，主要包括PCR反应液和DNA杂交膜条，其特征在于，所述DNA杂交膜条包括尼龙膜，所述尼龙膜上固定有探针，所述探针为可分别与丙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸杂交的核苷酸，所述探针序列如下所示 针对 HBVla 型设计探针 Yl :5’ -AATTGCCAGGACGACCGG-3’ ； 针对 HBVlb 型设计探针 Y2 :5’ -AATTGCCAGGATGACCGGG-3’ ； 针对 HBVlb 型设计探针 Y3 :5’ -CCCGGAATTGCCAGGAC-3’ ； 针对 HBV2a 型设计探针 Y4 :5’ -CAATGCCTGGAGAITTGGGCG-3’ ； 针对 HBV2a 型设计探针 Y5 :5’ -CAATGCCTGGAGATTTGGGC-3’ ； 针对 HBV2b 型设计探针 Y6 :5’ -CTCAATGCCTGGAGATTTGG-3’ ； 针对 HBV2b 型设计探针 Y7 :5’ -GCTCAATGCCTGGAGATTTGG-3’ ； 针对 HBV3a 型设计探针 Y8 :5’ -CAATGCCTGGAGAITTGGG-3’ ； 针对 HBV3a 型设计探针 Y9 :5’ -CGAGGTAGACGTCAGCC-3’ ； 针对 HBV3a 型设计探针 YlO :5’ -ACCTCGAGGTAGACGTCAGCC-3’ ； 针对 HBV6a 型设计探针 Yll :5’ -AACCTCGAGGTAGACGTCAGCC-3’ ； 针对 HBV6a 型设计探针 Y12 :5’ -GCAACCTCGAGGTAGACGT-3’ ； 针对 HBV6a 型设计探针 Y13 :5’ -TAGACGTCAGCCTATCCCCAA-3’ ； 针对HBV1-6型设计通用探针(即阳性探针HP) Y14 :5’ -TAGACGCCAGCCTATTCCCA-3’ ； 阴性探针 HN: 5’ -GGTCCTGTTTAACTGGCG-3’ ； 所述各探针5’端进行氨基标记以与尼龙膜偶联。
2.如权利要求I所述的丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，其特征在于，所述尼龙膜上还设置有显色控制探针CC，所述显色控制探针CC序列如下所示5’ -GCGCAGGGCCACAATAATGG-3’，所述显色控制探针CC的5’端进行氨基标记，3’端进行生物素标记。
3.如权利要求I所述的丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括扩增丙型肝炎病毒各种亚型病毒的核酸的引物，所述引物序列如下所示 逆转录引物 RT :5’ -CGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’ 上游引物 F :5’ -GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’ 下游引物 R :5’ -CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’。
所述下游引物R的5’端进行生物素标记。
4.如权利要求I所述的丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括内参系统，所述内参照系统为拟南芥内参照系统，包括 内参引物 Fl :5’ -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3，; 内参引物 Rl :5’ -CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3’ ； 内参探针 PC :5’ -TGCCGATATAGGTCACAGCATGGGC-3’ ； 所述内参引物Fl的5’端进行生物素标记。
5.如权利要求I所述的丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒，其特征在于，所述探针浓度为 5-20 μ Mo
6.丙型肝炎病毒基因分型的方法，其特征在于，该方法包括下述具体步骤 a、设计分型引物与探针，所述探针如权利要求I探针Y1-Y14所示，所述引物包括逆转录引物 RT :5’ -CGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’ ； 上游引物 F :5’ -GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT-3’ ； 下游引物 R:5’ -CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3’ ； b、用活性氨基标记步骤a所述探针的5’端，并将其依次固定在尼龙膜上，制成检测膜条，对所述下游引物R的5’端进行生物素标记； C、利用步骤a中所述引物进行HBV DNA扩增，将扩增产物与检测膜条杂交，以过氧化物酶与四甲基联苯胺显色； d、采用扫描仪，扫描杂交信号，判断基因分型结果。
7.如权利要求6所述的丙型肝炎病毒基因分型的方法，其特征在于，所述尼龙膜上还设置有显色控制探针CC，所述显色控制探针CC序列如下所示5’ -GCGCAGGGCCACAATAATGG-3’，所述CC探针5’端进行氨基标记，3’端进行生物素标记。
8.如权利要求6所述的丙型肝炎病毒基因分型的方法，其特征在于，所述步骤a中的引物还包括 内参引物 Fl :5，-TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3，; 内参引物 Rl :5’ -CGGCGGITTGTCAAGCTGAT-3’ ； 所述步骤a中的探针还包括 内参探针 PC :5’ -TGCCGATATAGGTCACAGCATGGGC-3’ ； 所述内参引物Fl的5’端进行生物素标记。
全文摘要
本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒及方法，可用于检测国内发生的丙型肝炎病毒的型别1a，1b，2a，2b，3a，6a感染的辅助诊断。本发明采用尼龙膜载体，针对HCV不同基因型设计寡核苷酸探针，制备成基因芯片，再配以PCR引物以及其他组分，可以快速准确对血液样品中丙型肝炎病毒进行分型。本发明的丙型肝炎病毒基因分型的基因芯片和试剂盒及方法具有快速、灵敏、准确、高通量的特点，一次杂交反应可以检测多种靶序列，取材方便，无需特殊设备，仪器投入低，具有快速简便、敏感度高和特异性强的特点。
文档编号C12Q1/70GK102766701SQ20121022923
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月4日 优先权日2012年7月4日
发明者周晓强, 姚铭锋, 彭春梅, 胡守旺, 谢佐福 申请人:福州泰普生物科学有限公司