专利名称：用于检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的核酸引物组、测定试剂盒及检测乙型肝炎病毒的 ...的制作方法
技术领域：
本发 明涉及用于检测编码对于抗药性乙型肝炎病毒是特异性的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸引物组、测定试剂盒及检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的方法。背景领域作为治疗HBV患者的方法，存在施用抑制HBV增殖的化学药物例如逆转录酶抑制剂的方法。这样的化学药物通过结合dCTP在DNA复制过程中通常结合的位点(从而展示竞争性抑制逆转录酶在整合dCTP中的功能(work)的作用)和通过在复制过程中被整合入DNA㈠链(从而展示阻止DNA链延伸的作用)来抑制HBV增殖。然而，已知当长时间施用例如拉米夫定时，可出现在某些氨基酸区域(例如，YMDD区域)具有突变的突变病毒，并且该突变病毒抗拉米夫定，从而引起病毒的量的再增加(“Kanzo”(Liver)，第47卷，No. 11，499-502 (2006))。因此，当通过监测显示抗药性株系出现时，需要采取紧急对策例如改变药物等。通过使用PCR扩增乙型肝炎病毒(在下文中称为HBV)的DNA，然后通过序列分析阅读编码上述氨基酸突变的核苷酸序列来进行抗药性株系的检测(Int. J. Med. Sci. 20052(1))。然而，期望有以更容易的方式检测抗药性株系的方法。本发明的公开内容鉴于上述问题，本发明的目的是提供能够在短时间内容易且便宜地检测HBV的抗药性株系的核酸引物组、测定试剂盒及检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的方法。为了实现该目的，本发明提供了检测乙型肝炎病毒的抗药性株系或非抗药性(drug-nonresistant)株系的方法,包括使用引物组通过LAMP扩增样品溶液中的乙型肝炎病毒的核酸以产生扩增产物，和将扩增产物与含有来源于乙型肝炎病毒的抗药性株系的多核苷酸的探针和/或含有来源于乙型肝炎病毒的非抗药性株系的多核苷酸的探针杂交，以检测乙型肝炎病毒的抗药性或非抗药性株系，其中所述引物组包括FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物，并且至少一个组选自引物组1，其中FIP引物由SEQ ID NO 3表示，BIP引物由SEQ ID NO :4表示，F3引物由SEQ ID NO :27表示，以及B3引物由SEQ ID NO 28表示，和引物组2，其中FIP引物由SEQ ID NO :5表示，BIP引物由SEQ ID NO :6表示，F3引物由SEQ ID NO 29表示，以及B3引物由SEQ ID NO 30表示，所述引物组用于扩增含有编码乙型肝炎病毒的聚合酶区域中的位点181和204上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列区域；引物组3，其中FIP引物由SEQ ID NO :7表示，BIP引物由SEQ ID NO :8表示，F3引物由SEQ ID NO 31表示，以及B3引物由SEQ ID NO 32表示，
引物组4，其中FIP引物由SEQ ID NO :9表示，BIP引物由SEQ ID N0:10表示，F3引物由SEQ ID NO 31表示，以及B3引物由SEQ ID NO 32表示，弓丨物组11，其中FIP引物是由SEQID NO 7表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO :121表示，F3引物由SEQ ID NO 31表示，以及B3引物由SEQ ID NO :123表示，和弓丨物组12，其中FIP引物是由SEQID NO 9表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO :122表示，F3引物由SEQ ID NO 31表示，以及B3引物由SEQ ID NO :124表示，所述引物组用于扩增含有编码乙型肝炎病毒的聚合酶区域中的位点204和236上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列区域；引物组5，其中FIP引物是由SEQ ID NO :15表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO :16表示，F3引物由SEQ ID NO 33表示，以及B3引物由SEQ ID NO :34表示， 引物组6，其中FIP引物是由SEQ ID NO :17表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO :18表示，F3引物由SEQ ID NO 35表示，以及B3引物由SEQ ID NO :36表示，引物组7，其中FIP引物是由SEQ ID NO :19表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO :20表示，F3引物由SEQ ID NO 37表示，以及B3引物由SEQ ID NO :38表示，和引物组8，其中FIP引物是由SEQ ID NO 21表示的多核苷酸，BIP弓丨物由SEQ IDNO 22表示，F3引物由SEQ ID NO 39表示，以及B3引物由SEQ ID NO 40表示，所述引物组用于扩增含有编码乙型肝炎病毒的聚合酶区域中的位点236上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列区域；和引物组9，其中FIP引物是由SEQ ID NO :23表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO :24表示，F3引物由SEQ ID NO 41表示，以及B3引物由SEQ ID NO :42表示，和弓丨物组10，其中FIP引物是由SEQID NO :25表示的多核苷酸，BIP引物由SEQ IDNO 26表示，F3引物由SEQ ID NO 43表示，以及B3引物由SEQ ID NO 44表示，所述引物组用于扩增含有编码乙型肝炎病毒的聚合酶区域中的位点181上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列区域。根据本发明，可在短时间内容易地、便宜地并且准确地检测到HBV的抗药性株系或非抗药性株系。附图概述图I是LAMP法的示意图。图2是显示LAMP法的中间产物和内部引物(inner primer) (FIP, BIP)的退火位
置的示意图。图3是显示环引物(loop primer)的排布的示意图。图4是显示LAMP法的中间产物和环引物(LFc，LBc)的退火位置的示意图。图5是显示扩增产物的检测位置的示意图。图6是固定有探针的基质的一个实施方案的平面示意图。图7是固定有探针的基质的一个实施方案的平面示意图。图8显示数据库中注册的HBV序列的登录号。图9显示数据库中注册的HBV序列的登录号。
图10显示HBV的标准序列。图11显示HBV的标准序列。
图12显示检测祀序列(detection target sequence)的核酸引物序列和相对位点。 用于进行本发明的最佳模式HBV的抗药性株系是一种突变株。抗药性株系与为非抗药性株系的株系(野生型株系)相异在于HBV的聚合酶区域的氨基酸序列中的位点181、204或236上的氨基酸。这样的突变源自HBV基因的突变，并且突变位点是因编码氨基酸序列的核苷酸序列中存在突变而产生的。因此，HBV的抗药性株系可通过鉴定基于所述区域的碱基突变的核苷酸多态性来检测，从而可判断来自受试者例如感染HBV的患者的HBV是抗药性的还是非抗药性的。基于这样的碱基突变(在下文中称为核苷酸多态性)的核苷酸多态性一直以来主要通过PCR(聚合酶链式反应)来检测。然而，在PCR方法中，预处理例如核酸提取是非常 麻烦的。此外，存在必需通过热循环仪等进行复杂的温度控制以及需要2小时或更长的反应时间的不便之处。存在的另外的问题因为PCR法的扩增产物是双链的，因此在检测中互补链充当了探针的竞争者，从而引起检测灵敏度的减弱。由此得出，为了使扩增产物成为单链，使用利用酶或磁珠分解或分离互补链的方法，但在任一种情况下，都存在问题例如非常麻烦的操作和更高的费用。因此，在本发明中，使用LAMP(环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification))代替PGR，将扩增产物与核酸探针杂交，检测杂交，从而检测核苷酸多态性。LAMP法是在等温条件下在60至65°C下扩增核酸的技术。LAMP法优于PCR法在于可在短时间内获得大量的扩增产物。也已报导LAMP法几乎不受样品中的杂质影响。通过使用LAMP法，可容易地扩增靶核酸。例如，方法包括但不限于，可在测量中使用核酸探针来检测扩增产物。核酸探针可以是特异性检测利用根据本发明的LAMP扩增引物扩增的区域的任何探针。核酸探针是分别与野生型(即非抗性株系)的扩增产物和突变型(即，抗性株系)的扩增产物互补并且彼此之间具有更低的交叉反应性的核酸探针，将各自的核酸探针用于与各自扩增产物杂交，然后检测与各自核酸探针结合的扩增产物。可分别检测结合野生型核酸探针的扩增产物和结合突变型核酸探针的扩增产物来判断样品中的HBV病毒是抗药性的还是非抗药性的。〈LAMP法的概述>在下文中，概述了 LAMP法。在本说明书中，接受核苷酸多态性的检测的核酸称为样品核酸。利用根据本发明的LAMP引物扩增的含有编码HBV的聚合酶区域中的位点181、204或236上的氨基酸的区域的核酸称为靶核酸。通过LAMP法获得的产物称为扩增产物。含有作为扩增的受试者的HBV的溶液称为样品溶液。在LAMP法中，使F3、F2和Fl区域从靶核酸的5’ -末端侧按该顺序排列，并且使B3c、B2c和Blc区域从3’-末端侧按该顺序排列。如图I中所示的4种引物用于扩增靶核酸。Flc, F2c、F3c、BI、B2和B3区域分别指FI、F2、F3、Blc、B2c和B3c区域在互补链中的区域。在LAMP法中用于核苷酸扩增的4种类型的引物是⑴在其3’-末端侧具有与F2区域相同的序列并且在其5’ -末端侧具有与Fl区域互补的序列的FIP引物；(2)由与F3区域相同的序列的组成的F3引物；(3)在其3’-末端侧具有与B2c区域互补的序列并且在其5’-末端侧具有与Blc区域相同的序列的BIP引物；和(4)由与B3c区域的互补序列组成的B3引物。通常，FIP引物和BIP引物称为内部引物，F3引物和B3引物称为外部引物。
当4种引物用于LAMP扩增时，形成具有如图2中所示的哑铃结构的中间产物。FIP和BIP引物结合单链环中的F2c和B2c区域，以起始从弓丨物3 ’ -末端和从中间产物的3 ’ -末端开始的延伸反应。关于详细内容，参考日本专利案3313358。在LAMP法中，(5)称为环引物(loop primer)的引物可进一步任意地用于减少扩增时间。在该情况下，如图3中所示，将LF区域置于范围从F2区域至Fl区域的部分中，以及将LBc区域置于范围从B2c区域至Blc区域的部分中。这些部分称作环引物区域。然后，除了上述4种引物外还可使用由与LF区域互补的序列组成的环引物LFc和由与LBc区域相同的序列组成的环引物LBc。关于详细内容，参考W02002/0249028。环引物LFc和LBc可同时使用，或可只使用它们中的一个。该环引物，如图4中所示，在与FIP和BIP引物退火的环不同的环上退火，从而提供了促进扩增的另外的合成起始点。当将要检测核苷酸多态性时，待检测的多态位点位于图5中所示的FP区域 (F-环)或BPc区域(B-环)中。备选地，不同的多态性可分别位于FP和BPc区域。如图5中所述，范围从F2区域至Fl区域的部分是将在扩增产物中产生单链的部分。类似地，范围从B2c区域至Blc区域的部分也是将在扩增产物中产生单链的部分。当待检测的多态位点位于为单链的部分时，其利用核酸探针进行的检测由于与核酸探针高效率的反应而得到促进。此类引物的选择将在后而进行详细描述。〈LAMP扩增产物的检测；核酸探针>设计核酸探针以使其结合含有多态位点的FP或BPc区域。即，核酸探针具有与在FP或BPc区域中含有多态位点的区域的序列互补的序列。分别与FP和BPc区域互补的FPc和BP区域也存在于扩增产物中，因此，这些FPc和BP区域也可用于检测。在本说明书中，含有与野生型的扩增产物互补的序列的核酸探针称为野生型核酸探针或非抗药性探针，而含有与突变型的扩增产物互补的序列的核酸探针称为突变型核酸探针或抗药性探针。核酸探针包括但不限于DNA、RNA、PNA、LNA、具有甲基膦酸主链的核酸和其他人造核酸。为了固定在基质上，可用反应性官能团例如氨基、羧基、羟基、巯基或磺基修饰核酸探针的末端。可在官能团和多核苷酸之间导入间隔子。例如，可使用由烷烃或乙二醇主链组成的间隔子。核酸探针的长度是最短15个碱基至最长45个碱基。长度更优选为15至40个碱基，更优选18至35个碱基。<固定核酸探针的基质>核酸探针可通过固定在基质上来使用，但核酸探针的用途不限于此。固定核酸探针的基质可以是称为DNA芯片或本身已知的DNA微阵列的装置。在一个实施方案中的固定探针的基质的示意图示于图6中。探针被固定在基质I上的固定区域2中。基质I可以例如由硅基质等制造，但基质的材料不限于此。可通过本领域内已知的方法固定探针。可将一种探针或多种探针固定在一个基质I上，可由本领域技术人员适当地设计探针的排列和数目，以及必要时进行改变。当如后所述通过荧光检测探针时，可以使用例如本实施方案中的固定探针的基质。另一个实施方案中的固定探针的基质的不意图不于图7中。在该实施例中，基质11具有电极12。探针被固定在电极12上。将电极12与衬垫13连接以回收(retrieving)电f目息。基质11可以例如由娃基质等制造，但基质的材料不限于此。电极的制造和探针的固定可使用本领域内已知的方法来进行。电极不受特别限制，但可由单一金属或其合金例如金、金合金、银、钼、汞、镍、钯、硅、锗、镓或钨、碳例如石墨或玻璃碳或其氧化物或化合物制造。图7中固定基质具有10个电极，但排布在一个基质上的电极的数目不限于此，其可任意改变。排布在其上的电极的模式不限于图中所示的模式，其可由本领域技术人员适当地设计和改变。必要时基质I可具有参比电极和反电极(counter electrode)。当如后所述通过电化学检测探针时，可使用例如本实施例中的固定探针的基质。
<核酸探针与扩增产物之间的杂交>在适当的条件下进行核酸探针与扩增产物之间的杂交。适当的条件可视扩增产物的类型和结构、检测序列中含有的碱基的类型以及核酸探针的类型而变化。在例如离子强度在0.01至5的范围内和pH在5至10的范围内的缓冲液中进行杂交。可向反应溶液中加入为杂交促进剂的硫酸葡聚糖、鲑精DNA、小牛胸腺DNA、EDTA和表面活性剂。例如在10至90°C的范围内的温度下进行反应，并且可通过搅拌或振荡来增加反应的效率。关于反应后的清洗，可使用离子强度在0. 01至5的范围内以及pH在5至10的范围内的缓冲液。<检测方法>当将固定在基质上的探针与扩增产物杂交时，形成双链核酸。可通过电化学或荧光检测该双链核酸。(a)电流检测系统描述了通过电化学检测双链核酸的方法。在该方法中，使用特异性识别双链核酸的双链识别物质。双链识别物质的实例包括但不限于Hoechst 33258、吖啶橙、奎纳克林(quinacrine)、柔红霉素(daunomycin)、金属插入剂(metallointercalator)、双插入剂(bisintercalator)例如双卩丫唳、三插入剂(trisintercalator)和多插入剂。此类物质可用电化学活性金属复合物例如二茂铁或紫罗碱进一步修饰。双链识别物质的浓度视其类型而变化，但通常在Ing/mL至lmg/mL的范围内变化。在该情况下，可使用具有0. 001至5的离子强度和pH在5至10的范围内的缓冲液。在杂交反应过程中或之后，向反应溶液中加入双链识别物质。当双链核酸已通过杂交形成时，双链识别物质与其结合。由此得出，通过应用等于或高于引起双链识别物质的电化学反应的电压的电压，可测量来源于双链识别物质的反应电流值。在该情况下，可使用恒定速率电压(constant-rate voltage)、脉冲电压或恒压。在测量中，可使用装置例如恒电位器、数字万用表和函数发生器来调控电流和电压。例如，优选可使用描述于日本专利申请KOKAI公开案10-146183的已知的电化学检测方法。(b)荧光检测法描述了荧光检测双链核酸的方法。之前用荧光活性物质标记引物。备选地，在检测中使用荧光活性物质标记的第二探针。备选地，可使用多个标记。荧光活性物质包括但不限于荧光染料例如FITC、Cy3、Cy5和罗丹明。荧光物质用例如荧光检测器来检测。将经改造适用于标记的类型的适当的检测器用于检测已标记的检测序列或第二探针。<用于选择核酸引物和核酸探针的指导方针>如图5中所示，当所述核苷酸多态位点位于Blc和B2c之间，即位于BPc区域中时，则BIP引物是具有与B2c区域互补的序列和具有与Blc区域相同的序列的引物。因此，可设计不同的引物来产生目的扩增产物，只要B2c区域和Blc区域位于这样的位置，以使所述核苷酸多态位点夹在其间。类似地，当所述核苷酸位点位于F2和Fl之间，即位于FP区域时，则FIP引物是具有与Fl区域互补的序列和具有与F2区域相同的序列的引物。因此，可设计不同的引物来产生目的扩增引物，只要Fl区域和F2区域位于这样的位置，以使所述核苷酸多态性位点夹在其间。然而，本发明者显示，LAMP法中扩增的效率视引物的类型而变化。例如，在后面显示的表1、2和3中举例说明了 4种类型的引物。此类引物(FIP、BIP、F3和B3引物)用于扩增。结果，使用任何引物的扩增在短时间内顺利地完成。因此，此类引用是用于扩增的良好引物。为了进一步使用核酸探针检测扩增产物，应当以高效率产生扩增产物与核酸探针之间的杂交。因此，扩增产物在杂交效率上是否优良，也被考虑用于评估引物。优选在长度为优选450bp或更短，更优选350bp或更短的区域(F2和B2之间的任何地方)中设计无核苷酸多态性夹在其间的另一对内部引物。设计两个内部引物以使单链环的长度优选为IOObp或更短，更优选70bp或更短。对于引物的非特异性扩增是在LAMP法中通常观察到的现象。FIP引物包括Flc和F2区域，从而形成长链核酸。类似地，BIP引物包括Blc和B2区域，从而形成长链核酸。因此，FIP引物或BIP引物彼此之间发生缠绕，或FIP引物与BIP引物发生缠绕，从而增加以引物为模板的扩增的可能性。在LAMP反应中，F3引物、B3引物和任选地LFc引物和LBc引物存在于反应液中，从而与PCR反应相比较，在LAMP反应中增加了非特异性反应的可能性。当产生这样的非特异性反应时，以样品核酸为模板的期望的LAMP产物的量减少。〈核酸引物和核酸探针的设计〉基于上述内容，以下列方式建立用于根据本发明的LAMP扩增的核酸引物的核苷酸序列和用于检测LAMP扩增产物的核酸探针的核苷酸序列。第一，基于数据库建立它们的标准序列。首先，从基因序列信息数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. rov. /Genbank/index, html)获得关于HBV B型和C型的序列信息。用于建立标准序列的序列的登录号示于图8和9。通过HBV B型和C型的比对分析，选择在核苷酸序列的各位点中以最高频率发生的碱基作为标准序列。B型和C型的标准序列分别示于图10和11中。基于该标准序列，分别确定根据本发明的12种类型的引物组(引物组I至12)和核酸探针的核苷酸序列。〈引物的设计〉[FIP引物(I)和BIP引物⑶]首先，确定FIP引物和BIP引物。表I显示了用于检测HBV抗药性株系的12种类型的核酸引物组中的FIP引物和BIP引物。
权利要求
1.用于LAMP扩增以检测乙型肝炎病毒的抗药性株系和非抗药性株系的核酸引物组，其包括FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物， 其中所述引物组选自 引物组2，其中FIP引物由SEQ ID NO :5表示的多核苷酸组成，BIP引物由SEQ ID NO:6表示的多核苷酸组成，F3引物由SEQ ID NO :29表示的多核苷酸组成，以及B3引物由SEQID NO 30表示的多核苷酸组成， 所述引物组用于扩增含有编码乙型肝炎病毒的聚合酶区域中的位点181和204上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列区域。
2.权利要求I的引物组，其还包括，由至少一个来自SEQID NO 45和SEQ ID NO 46中的序列表示的多核苷酸组成的引物，作为环引物。
3.检测乙型肝炎病毒的抗药性或非抗药性株系的方法，其包括 使用引物组，通过LAMP扩增样品溶液中的乙型肝炎病毒核酸以产生扩增产物，和 将所述扩增产物与含有来源于乙型肝炎病毒的抗药性株系的多核苷酸的探针和/或含有来源于乙型肝炎病毒的非抗药性株系的多核苷酸的探针杂交，以检测乙型肝炎病毒的抗药性或非抗药性株系， 其中所述引物组包括FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物，并且包括 引物组2，其中FIP引物由SEQ ID NO :5表示的多核苷酸组成，BIP引物由SEQ ID NO:6表示的多核苷酸组成，F3引物由SEQ ID NO :29表示的多核苷酸组成，以及B3引物由SEQID NO 30表示的多核苷酸组成，且 所述引物组用于扩增含有编码乙型肝炎病毒的聚合酶区域中的位点181和204上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列区域。
4.权利要求3的方法，其中所述探针包含于探针组中，所述探针组含有至少一个由多核苷酸和任选的分别与所述多核苷酸的端部连接的一个至两个核苷酸片段和另外一个至5个核苷酸片段组成的探针，所述多核苷酸选自 由SEQ ID NO 50表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 51表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :52表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :53表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :54表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :55表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :56表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :57表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 84表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 85表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 86表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 87表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :88表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 89表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :90表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO91表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :132表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ IDNO :133表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO : 134表示的多核苷酸或其互补链，由SEQID NO :135表示的多核苷酸或其互补链，和由SEQ ID NO : 136表示的多核苷酸或其互补链。
5.权利要求4的方法，其中所述引物组含有 引物组2，其中FIP引物由SEQ ID NO :5表示的多核苷酸组成，BIP引物由SEQ ID NO:6表示的多核苷酸组成，F3引物由SEQ ID NO :29表示的多核苷酸组成，以及B3引物由SEQID NO 30表示的多核苷酸组成，所述探针包含于探针组中，所述探针组含有至少一个由多核苷酸和任选的分别与所述多核苷酸的端部连接的一个至两个核苷酸片段和另外一个至5个核苷酸片段组成的探针，所述多核苷酸选自 由SEQ ID NO 50表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 51表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :52表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :53表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :54表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :55表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 56表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 57表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 84表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 85表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 86表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 87表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :88表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 89表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 90表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 91表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :132表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ IDNO :133表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO : 134表示的多核苷酸或其互补链，由SEQID NO :135表示的多核苷酸或其互补链，和由SEQ ID NO : 136表示的多核苷酸或其互补链。
6.权利要求5的方法，其中所述引物组包含引物组2，其中FIP引物由SEQ ID N0:5表示的多核苷酸组成，BIP引物由SEQ ID NO 6表示的多核苷酸组成，F3引物由SEQ ID NO 29表示的多核苷酸组成，以及B3引物由SEQ ID NO 30表示的多核苷酸组成， 所述探针包含于探针组中，所述探针组含有来源于抗药性株系的多核苷酸和/或包含来源于非抗药性株系的多核苷酸的探针，所述探针组包含至少一个选自如下的探针 由SEQ ID NO 92多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO 93多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :94多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID N0:95多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO 96多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ IDNO 97多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO 98多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO 99多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :100多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :101多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :102多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :103多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQID NO :104多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ IDNO :105多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :106多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :107多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :108多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO:109多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :110多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :111多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :112多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :113多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :114多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :115多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQID NO :116多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :117多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :118多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :119多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :120多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO:178多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :179多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :180多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :181多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :182多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :183多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :184多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQID NO :185多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO : 186多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :187多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :188多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :189多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO:190多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :191多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :192多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :193多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :194多核苷酸或其互补链表示的探针，由SEQ ID NO :195多核苷酸或其互补链表示的探针，和由SEQ ID NO :196多核苷酸或其互补链表示的探针。
7.用于检测乙型肝炎病毒的抗药性或非抗药性株系的测定试剂盒，其包括 权利要求I的引物组，和 含有来源于乙型肝炎病毒的抗药性株系的多核苷酸的探针和/或含有来源于乙型肝炎病毒的非抗药性株系的多核苷酸的探针。
8.权利要求7的用于检测乙型肝炎病毒的抗药性的测定试剂盒，所述探针包含于探针组中，所述探针组含有至少一个由多核苷酸和任选的分别与所述多核苷酸的端部连接的一个至两个核苷酸片段和另外一个至5个核苷酸片段组成的探针，所述多核苷酸选自 由SEQ ID NO 50表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 51表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :52表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :53表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :54表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :55表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 56表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 57表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :84表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :85表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 86表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 87表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :88表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO 89表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :90表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO:91表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO :132表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ IDNO :133表示的多核苷酸或其互补链，由SEQ ID NO : 134表示的多核苷酸或其互补链，由SEQID NO :135表示的多核苷酸或其互补链，和由SEQ ID NO : 136表示的多核苷酸或其互补链。
9.权利要求I的引物组，其中所述引物组用于检测其基因型为C型的乙型肝炎病毒的抗药性。
10.权利要求3的引物组，其中所述引物组用于检测其基因型为C型的乙型肝炎病毒的抗药性。
11.权利要求6的引物组，其中所述引物组用于检测其基因型为C型的乙型肝炎病毒的抗药性。
全文摘要
本发明提供了检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的方法，其包括使用引物组通过LAMP扩增样品溶液中的乙型肝炎病毒核酸以产生扩增产物，然后将扩增产物与含有来源于抗药性株系的多核苷酸的探针和/或含有来源于非抗药性株系的多核苷酸的探针杂交，以检测乙型肝炎病毒的抗药性株系。
文档编号C12Q1/70GK102796828SQ201210228970
公开日2012年11月28日 申请日期2008年10月30日 优先权日2007年10月30日
发明者高桥匡庆, 桥本美智惠, 伊藤桂子, 木津庆子, 三代俊治, 高桥和明, 宫崎和典, 桥本幸二, 源间信弘 申请人:株式会社东芝