专利名称：抑制mpg表达的产品在使细胞停留在g1期中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制MPG表达的产品在使细胞停留在Gl期中的应用。
背景技术：
生命是从一代向下一代传递的连续过程，因此是一个不断更新、不断从头开始的 过程。细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂，结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。通常将通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程称为细胞周期。在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。细胞周期(cell cycle)是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。(一)间期间期又分为三期、即DNA合成前期(Gl期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。1.G1 期(first gap)从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体积显著增大。这一期的主要意义在于为下阶段S期的DNA复制作好物质和能量的准备2. S 期(synthesis)DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。DNA复制所需要的酶都在这一时期合成。3. G2 期(second gap)DNA合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括微管蛋白和促成熟因子等。(二)分裂期(M期)细胞分裂期前期，中期，后期，末期。细胞的有丝分裂(mitosis)需经前、中、后，末期，是一个连续变化过程，由一个母细胞分裂成为两个子细胞。I.前期(prophase)染色质丝高度螺旋化,逐渐形成染色体(chromosome)。染色体短而粗，强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始合成微管，形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。2.中期(metaphase)细胞变为球形，核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状，均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。
3.后期(anaphase)由于纺锤体微管的活动，着丝点纵裂，每一染色体的两个染色单体分开，并向相反方向移动，接近各自的中心体，染色单体遂分为两组。与此同时，细胞波拉长，并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动，该部缩窄，细胞遂呈哑铃形。4.末期(telophase)染色单体逐渐解螺旋，重新出现染色质丝与核仁；内质网囊泡组合为核被膜；组胞赤道部缩窄加深，最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。另外，还存在一个GO期暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，去执行一定生物学功能的细胞所处的时期。乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤。2011年美国CA:A Cancer JournalforClinicians杂志(2010年影响因子94. 262)公布的最新统计数据显示，美国2011年预计将有230480例女性罹患乳腺癌，占女性新发恶性肿瘤的30%，排名女性恶性肿瘤发病率第一位。在我国北京、上海、天津等大城市的统计显示乳腺癌同样是我国女性最常见的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势。
发明内容
本发明的目的是提供抑制MPG表达的产品在使细胞停留在Gl期中的应用。本发明提供了抑制MPG蛋白编码基因表达的物质在制备产品中的应用；所述产品具有如下功能中的至少一种(I)抑制癌细胞增殖；(2)治疗癌症；(3)使细胞停留在细胞周期的Gl期。所述应用中，所述(I)中，所述癌细胞可为乳腺癌细胞，具体可为MCF7细胞。所述应用中，所述(2 )中，所述癌症可为乳腺癌，具体可为由MCF7细胞引起的乳腺癌。所述应用中，所述(3)中，所述细胞具体可为MCF7细胞。本发明还保护一种产品，它的活性成分为抑制MPG蛋白编码基因表达的物质；所述产品具有如下功能中的至少一种(I)抑制癌细胞增殖；(2)治疗癌症；(3)使细胞停留在细胞周期的Gl期。所述产品中，所述(I)中，所述癌细胞可为乳腺癌细胞，具体可为MCF7细胞。所述产品中，所述(2)中，所述癌症可为乳腺癌，具体可为由MCF7细胞引起的乳腺癌。所述产品中，所述(3)中，所述细胞具体可为MCF7细胞。本发明还保护抑制MPG蛋白编码基因表达的物质在使细胞停留在细胞周期的Gl期中的应用。所述细胞具体可为MCF7细胞。本发明还保护抑制MPG蛋白编码基因表达的物质在抑制癌细胞增殖中的应用。所述癌细胞可为乳腺癌细胞，具体可为MCF7细胞。以上任一所述MPG蛋白可为如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质。以上任一所述MPG蛋白编码基因可为如下(I)或(2)或(3)所述的DNA分子(I)序列表中序列2所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(3)与(I)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在0. I X SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。以上任一所述抑制MPG蛋白编码基因表达的物质具体可为如下(C)或(d)(c)序列表的序列3自5’末端第I至21位核苷酸所示的双链RNA分子(siRNA)；(d)序列表的序列3所示的单链核酸分子和序列表的序列4所示的单链核酸分子组成的双链核酸分子。本发明还保护一种核酸分子，为如下(C)或(d)(c)序列表的序列3自5’末端第I至21位核苷酸所示的双链RNA分子(siRNA)；(d)序列表的序列3所示的单链核酸分子和序列表的序列4所示的单链核酸分子 组成的双链核酸分子。本发明的发明人发现，MPG蛋白参与细胞周期的调控，通过抑制MPG蛋白编码基因的表达可以使细胞停留在细胞周期的Gl期，从而抑制细胞的增殖。本发明对于细胞周期的研究，抑制细胞增殖的研究具有重大的理论价值，对于抑制癌细胞和治疗癌症具有重大的应用价值。
图I为实施例2中的流式细胞仪图谱。图2为实施例2中流式细胞仪输出的各时相细胞的百分率。图3为实施例3中各组处理的相对吸光值。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。MCF7细胞(人乳腺癌细胞):美国模式培养物集存库(简称ATCC ；http://www. atcc.0找/)，编号为肌8-22。MPG蛋白如序列表的序列I所不，其编码基因(MPG基因)如序列表的序列2所不。实施例I、siRNA的设计根据对MPG基因进行分析和筛选，设计用于抑制MPG基因表达的siRNA( siRNA甲)如下5’-AAGAAGCAGCGACCAGCUAGAIT-3’(序列表的序列 3)；3， -TTUUCUUCGUCGCUGGUCGAUCU-5，。设计作为阴性对照的siRNA (siRNA乙)如下5， -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，；3， -TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5，。实施例2、抑制MPG表达的产品在使细胞发生Gl期阻滞中的应用MCF7细胞(人乳腺癌细胞)培养于含10%体积的胎牛血清、100u/ml青霉素和IOOu/ml双链霉素)的DMEM培养基中，37°C、5%的CO2的条件下培养。本实施例中所用的PBS缓冲液均为pH7. 2,0. OlM的PBS缓冲液。I、将MCF7细胞铺于12孔板(6. OX IO4个细胞/孔)，然后培养至细胞密度达到60%-80%，细胞状态良好情况下转染，然后分组进行如下处理(借助购自Invitrogen的转染试剂lipofectamine2000并按说明书进行siRNA的转染)第一组每孔转染40pmol siRNA甲；第二组每孔转染40pmol siRNA 乙。2、转染48小时后，胰酶消化细胞至单个细胞悬浮，用70%乙醇水溶液固定24小时(细胞死亡)。3、用PBS缓冲液洗涤细胞，然后加入用PBS缓冲液配置的含50mg/ml荧光染料PI(碘化丙啶)和lmg/mlRNA酶的溶液，孵育30分钟。4、采用流失细胞仪分析DNA含量。PI，即碘化丙锭，可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA酶将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，正常细胞的G0/G1期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G0/G1期，S期和G2/M期，并可通过流式细胞仪直接输出各时相细胞的百分率。结果见图I (直方图)和图2。第一组中，处于G0/G1期的细胞比率显著高于第二组。结果表明，在MCF7细胞中，通过抑制MPG基因表达能够使细胞发生Gl期阻滞。实施例3、抑制MPG表达的产品在抑制癌细胞增殖中的应用MCF7细胞(人乳腺癌细胞)培养于含10%体积的胎牛血清、100u/ml青霉素和IOOu/ml双链霉素)的DMEM培养基中，370C >5%的CO2的条件下培养。I、将MCF7细胞铺于96孔板(3X IO3个细胞/孔)，然后培养至细胞密度达到40%-50%，细胞状态良好情况下转染，然后分组进行如下处理(每组细胞设置三个复孔；借助购自Invitrogen的转染试剂lipofectamine2000并按说明书进行siRNA的转染)第一组每孔转染5pmol siRNA甲；第二组每孔转染5pmol siRNA乙。2、转染24小时后，每孔更换IOOiU培养基，每孔再加入20 ill CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent(购于 Promega 公司，CellTiter AQueous OneSolutionCell Proliferation Assay),孵育 2 小时。3、利用酶标仪，读取490nm的吸光度值(吸光值越大说明细胞量越多)。进行三次重复实验，结果取平均值。第一组细胞的吸光度值为I. 167。以第一组细胞的吸光度值为1，两组细胞的相对吸光值见图3。结果表明，在MCF7细胞中，通过抑制MPG基因表达能够使抑制细胞增殖。
权利要求
1.抑制MPG蛋白编码基因表达的物质在制备产品中的应用； 所述MPG蛋白为如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质； 所述产品具有如下功能中的至少一种 (1)抑制癌细胞增殖； (2)治疗癌症; (3)使细胞停留在细胞周期的Gl期。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述(I)中，所述癌细胞为乳腺癌细胞；所述(2)中，所述癌症为乳腺癌。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述(I)中，所述乳腺癌细胞为MCF7细胞；所述(2)中，所述乳腺癌是由MCF7细胞引起的；所述(3)中，所述细胞为MCF7细胞。
4.一种产品，它的活性成分为抑制MPG蛋白编码基因表达的物质； 所述MPG蛋白为如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质； 所述产品具有如下功能中的至少一种 (1)抑制癌细胞增殖； (2)治疗癌症; (3)使细胞停留在细胞周期的Gl期。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于所述(I)中，所述癌细胞为乳腺癌细胞；所述(2)中，所述癌症为乳腺癌。
6.如权利要求5所述的产品，其特征在于所述(I)中，所述乳腺癌细胞为MCF7细胞；所述(2)中，所述乳腺癌是由MCF7细胞引起的；所述(3)中，所述细胞为MCF7细胞。
7.抑制MPG蛋白编码基因表达的产品在使细胞停留在细胞周期的Gl期中的应用； 所述MPG蛋白为如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质。
8.抑制MPG蛋白编码基因表达的产品在抑制癌细胞增殖中的应用； 所述MPG蛋白为如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列I所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白质。
9.如权利要求I至3中任一所述的应用，或如权利要求4至6中任一所述的产品，或如权利要求7所述的应用，或如权利要求8所述的应用，其特征在于所述抑制MPG蛋白编码基因表达的物质具体可为如下(c)或(d)(c)序列表的序列3自5’末端第I至21位核苷酸所示的双链RNA分子； Cd)序列表的序列3所示的单链核酸分子和序列表的序列4所示的单链核酸分子组成的双链核酸分子。
10.核酸，为如下(c)或(d) (c)序列表的序列3自5’末端第I至21位核苷酸所示的双链RNA分子； Cd)序列表的序列3所示的单链核酸分子和序列表的序列4所示的单链核酸分子组成的双链核酸分子。
全文摘要
本发明公开了抑制MPG表达的产品在使细胞停留在G1期中的应用。本发明提供了抑制MPG蛋白编码基因表达的物质在制备产品中的应用；所述产品具有如下功能中的至少一种(1)抑制癌细胞增殖；(2)治疗癌症；(3)使细胞停留在细胞周期的G1期。本发明的发明人发现，MPG蛋白参与细胞周期的调控，通过抑制MPG蛋白编码基因的表达可以使细胞停留在细胞周期的G1期，从而抑制细胞的增殖。本发明对于细胞周期的研究，抑制细胞增殖的研究具有重大的理论价值，对于抑制癌细胞和治疗癌症具有重大的应用价值。
文档编号C12N15/113GK102772805SQ20121022916
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月3日 优先权日2012年7月3日
发明者宋珊珊, 张令强, 贺福初, 邢桂春 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所