大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标及其lamp引物组合物和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，公开了大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标及其特异性LAMP引物组合物和应用。大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，该靶标序列特异性的LAMP引物组合物，正向内引物FIP如SEQ?ID?NO.2所示，反向内引物BIP如SEQ?ID?NO.3所示，正向外引物F3如SEQ?ID?NO.4所示，反向外引物B3如SEQ?ID?NO.5所示。本发明的检测体系在LAMP扩增条件下，能快速、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆北方茎溃疡病菌，能较好满足目前对大豆北方茎溃疡病菌的检测的迫切需要，用于田间检疫、进出口检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。
【专利说明】大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标及其LAMP引物组合物和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标及其LAMP引物组合物和应用。
【背景技术】
[0002]大豆北方莖溃瘍病菌(Diaporthephaseolorum var.caulivora)是北美大豆上最重要的毁灭性的病害之一。该病菌侵染植株后迅速发展形成茎杆环状损伤，并可导致正在生长的植株死亡。发病严重的田块有80%的植株受到侵染。由此造成的产量损失高达50%[1_4]。近年来该病害发展迅速，除美国外，阿根廷、巴西、加拿大、巴拉圭和意大利、前南斯拉夫、克罗地亚等欧洲部分国家及地区都有发生为害的报道[5_8]。
[0003]因其近年来在国外发生普遍、经济影响大、传入风险高且在我国尚未有发生的报道，我国将其列为重点关注的大豆上13种检疫性病原菌之一 [9]。为了阻止大豆拟茎点种腐病菌传播范围的不断扩大，使大豆南方茎溃疡得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。[0004]环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP),是日本的荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发的一种新型的核酸扩增方法M，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换DNA酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60~65°C恒温扩增，15~60min即可观察结果，效率可达IO9~101°个数量级，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，反应产物可通过是否形成白色沉淀(浑浊)或SYBR GREEN I染色后的颜色变化来判断是否反应。随着技术的不断完善和发展，会在食品检测临床疾病诊断等领域有着广泛的应用前景[11，12]。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef。
[0006]本发明的另一目的是提供该大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef的其特异性LAMP引物组合物。
[0007]本发明的又一目的是提供该大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef及其特异性LAMP引物组合物的应用。
[0008]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0009]大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]所述的大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef在检测或鉴定大豆北方茎溃疡病菌中的应用。
[0011]针对所述的大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef设计的特异性LAMP引物组合物，包括正向内引物FIP如SEQ ID N0.2所示，反向内引物BIP如SEQ ID N0.3所示，正向外引物F3如SEQ ID N0.4所示，反向外引物B3如SEQ ID N0.5所示。
[0012]所述的特异性的LAMP引物组合物优选还包含正向环引物LF如SEQ ID N0.6所示，反向环引物LB如SEQ ID N0.7所示。
[0013]所述的针对所述的大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef设计的特异性LAMP引物组合物在检测或鉴定大豆北方茎溃疡病菌中的应用。
[0014]一种用于检测大豆北方茎溃疡病菌的LAMP检测试剂盒，包含所述的特异性的LAMP引物组合物。
[0015]所述的用于检测大豆北方茎溃疡病菌的LAMP检测试剂盒，包含:由20mM正向内引物FIP、20mM反向内引物BIP，10mM正向外引物F3、10mM反向外引物B3，10mM正向环引物LF、IOmM反向环引物LR,9.26%10xThermoPol Reaction Buffer>50mM MgS04、lOmMdNTPMixture、5M甜菜碱、8000U/mL Bst DNA Polymerase Large fragment及超纯水组成的检测溶液。
[0016]一种检测大豆北方茎溃疡病菌的方法，提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP反应；扩增产物加入SYBR GREEN I染料，在常光和/或紫外光下检测结果，如果反应产物在常光下变显黄色、在紫外光下产生强烈荧光，则表示存在大豆北方茎溃疡病菌，在常光下显橙色、紫外光下无荧光产生则表示不含该病菌。
[0017]所述的检测大豆北方茎溃疡病菌的方法优选提取待检微生物的DNA，取3μ IDNA溶液，加入21.5 μ I所述的检测溶液和2.5 μ I灭菌去离子水进行LAMP反应，LAMP反应程序为:64°C 70min。
[0018]有益效果:`
[0019]本发明提供了一个新的大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef，并分析该靶标序列Tef和其他近似种病菌在序列上的差异，设计了 6条特异性的LAMP引物，在此基础上建立了检测大豆北方茎溃疡病菌的LAMP反应体系。本发明的检测体系在LAMP扩增条件下，能快速、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆北方茎溃疡病菌，具有优异的种间特异性、种内通用性以及灵敏度，能很好满足目前对大豆北方茎溃疡病菌的现场检测的迫切需要，用于田间检疫、进出口检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1实施例2大豆北方茎溃疡病菌种间特异性试验常光照射图
[0021]其中，I号、2号为大豆北方茎溃疡病菌不同菌株,3号、4号为大豆南方茎溃疡病菌不同菌株，5~7号为拟茎点种腐病菌不同菌株，8号为阴性对照。
[0022]图2实施例2大豆北方茎溃疡病菌种间特异性试验紫外光照射图
[0023]其中，I号、2号为大豆北方茎溃疡病菌不同菌株,3号、4号为大豆南方茎溃疡病菌不同菌株，5~7号为拟茎点种腐病菌不同菌株，8号为阴性对照。
[0024]图3实施例3大豆北方茎溃疡病菌属间特异性试验常光光照射图
[0025]其中，I号、2号为大豆北方茎溃疡病菌不同菌株，3号为大豆锈菌，4号为胶胞炭疽菌，5号为平头炭疽菌，6号为稻瘟菌，7号为链格孢菌，8号为球黑孢菌，9号为大豆疫霉菌，10号为菜豆壳球孢菌，11号为米曲霉菌，12号为菊池尾孢菌，13号为油瓶霉菌，14号为丁香疫霉菌，15号为苎麻疫霉，16号为阴性对照。
[0026]图4实施例3大豆北方茎溃疡病菌属间特异性试验紫外光照射图
[0027]其中，I号、2号为大豆北方茎溃疡病菌不同菌株，3号为大豆锈菌，4号为胶胞炭疽菌，5号为平头炭疽菌，6号为稻瘟菌，7号为链格孢菌，8号为球黑孢菌，9号为大豆疫霉菌，10号为菜豆壳球孢菌，11号为米曲霉菌，12号为菊池尾孢菌，13号为油瓶霉菌，14号为丁香疫霉菌，15号为苎麻疫霉，16号为阴性对照。
[0028]图5实施例4大豆北方茎溃疡病菌灵敏度试验常光照射图
[0029]LAMP扩增不同浓度大豆北方茎溃疡病菌基因组DNA ;从左到右分别为25 μ L的反应体系中分别含有lOOng、10ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、100fg、IOfg大豆拟莖点种腐病菌DNA的LAMP扩增结果。LAMP扩增反应能特异性地识别大豆北方茎溃疡病菌，图片表示灵敏度能够达到IOpg/μ L0
[0030]图6实施例4大豆北方茎溃疡病菌灵敏度试验紫外光照射图
[0031]LAMP扩增不同浓度大豆北方茎溃疡病菌基因组DNA ;从左到右分别为25 μ L的反应体系中分别含有100ng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、IOfg大豆北方莖溃瘍病菌DNA的LAMP扩增结果。LAMP扩增反应能特异性地识别大豆北方茎溃疡病菌，图片表示灵敏度能够达到IOpg/μ L0
[0032]图7感病大豆植株LAMP检测试验常光
[0033]其中I为大豆北方茎溃疡病菌标准菌株基因组，2-7为接种大豆北方茎溃疡病菌菌株6天后的大豆菌株基因组，8为接种空白PDA培养基6天后的大豆菌株基因组，9为健康大豆植株基因组，10为阴性对照。
[0034]图8感病大豆植株LAMP检测试验紫外光照射图
[0035]其中I为大豆北方茎溃疡病菌标准菌株基因组，2-7为接种大豆北方茎溃疡病菌菌株6天后的大豆植株基因组，8为接种空白PDA培养基6天后的大豆植株基因组，9为健康大豆植株基因组，10为阴性对照。
【具体实施方式】
[0036]实施例1
[0037]一种用于检测大豆北方茎溃疡病菌的LAMP检测试剂盒，包含:20mM正向内引物FIP、20mM反向内引物BIP，IOmM正向外引物F3、IOmM反向外引物B3，IOmM正向环引物 LF、IOmM 反向环引物 LR,9.26%10xThermoPol Reaction Buffer>50mM MgSO4、IOmMdNTPMixture、51V^f菜喊、8000U/mL Bst DNA Polymerase Large fragment,加入超纯水制备成检测溶液。各成分浓度均指在检测溶液中的终浓度。
[0038]实施例2大豆北方茎溃疡病菌种间特异性试验
[0039]为了验证LAMP方法的特异性，选择大豆北方茎溃疡病菌标准菌株(CBS177.55)与大豆北方茎溃疡病菌同种的大豆南方茎溃疡病菌以及同属不同种的大豆拟茎点种腐病菌的DNA作为模板，取3 μ IDNA溶液，加入21.5 μ I实施例1所述的检测溶液和2.5 μ I灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为:64°C 70min ;扩增产物加入SYBR GREEN I染料，在常光紫外光下检测。结果如图1和图2所示，显示特异性引物特异性地识别大豆北方茎溃疡病菌，含有大豆北方茎溃疡病菌的样品(I号管和2号管)会在常光下变成黄色，紫外光下产生强烈荧光；而其他种(3~7号管)在常光下变成橙色，紫外光下也不产生荧光，阴性对照(8号管)在常光下变成橙色，紫外光下也不产生荧光，这表明本发明建立的LAMP检测方法具有很高的种间特异性。
[0040]实施例3大豆北方茎溃疡病菌属间特异性试验
[0041]为了验证LAMP方法的特异性，选择大豆北方茎溃疡病菌标准菌株(CBS177.55)与大豆北方茎溃疡病菌不同属的菌(大豆锈菌；胶胞炭疽菌；平头炭疽菌；稻瘟菌；链格孢菌；球黑孢菌；大豆疫霉菌；菜豆壳球孢菌；米曲霉菌；菊池尾孢菌)的DNA作为模板，取3 μ IDNA溶液，加入21.5 μ I实施例1所述的检测溶液和2.5 μ I灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为:64°C 70min ;扩增产物加入SYBR GREEN I染料，在常光紫外光下检测。结果如图3和图4所示，显示特异性引物特异性地识别大豆北方茎溃疡病菌，含有大豆北方茎溃疡病菌的样品(I号管和2号管)会在常光下变成黄色，紫外光下产生强烈荧光；而其他种(3~15号管)在常光下变成橙色,紫外光下也不产生突光，阴性对照(16号管)在常光下变成橙色，紫外光下也不产生荧光，这表明本发明建立的LAMP检测方法具有很高的属间特异性。
[0042]实施例4大豆北方茎溃疡病菌灵敏度试验
[0043]为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的标准北方茎溃疡病菌菌株(CBS177.55)DNA用分光光度计测定浓度(lyg/μ I)后用DEPC水进行10倍比稀释，_70°C保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液3 μ I作为模板，加入21.5 μ I实施例1所述的检测溶液和2.5 μ I灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为:64°C 70min ；扩增产物加入SYBR GREEN I染料，在常光和紫外光下检测，结果如图5、图6所示。由图5可见在常光下检测大豆北方茎溃疡病菌灵敏度为IOpg/μ L，而在紫外光下检测大豆北方茎溃疡病菌灵敏度为IOpg/μ L。
[0044]实施例5感病大豆植株LAMP检测试验
[0045]用NaOH碱裂解法提取6株接种标准大豆北方茎溃疡病菌(CBS177.55)6天后的大豆植株的DNA，将其作为模板用于LAMP扩增，将大豆北方茎溃疡病菌标准菌株DNA作为阳性对照，健康植株DNA和灭菌水取代DNA扩增作为阴性对照。取3uLDNA溶液，加入21.5 μ I实施例1所述的检测溶液和2.5 μ I灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为:64°C 70min。扩增产物加入SYBR GREEN I染料，在常光和紫外光下检测。结果如图7~8所示，显示本方法能够从接种大豆北方茎溃疡的大豆植株(2~7号管)特异性地检测出大豆北方茎溃疡病菌，效果和直接检测大豆北方茎溃疡病菌(I号管)DNA没有差别，而接种空白PDA培养基6天后的大豆植株(8号管)与健康植株(9号管)和阴性对照灭菌水(10号管)则在常光下变成橙色，紫外光下也不产生荧光，可见本方法可以用于田间检测。
[0046]参考文献
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【权利要求】
1.大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef，其特征在于核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
2.SEQ ID N0.1所示的大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef在检测或鉴定大豆北方茎溃疡病菌中的应用。
3.针对权利要求1所述的大豆北方茎溃疡病菌的检测靶标序列Tef设计的特异性的LAMP引物组合物，其特征在于正向内引物FIP如SEQ ID N0.2所示，反向内引物BIP如SEQID N0.3所示，正向外引物F3如SEQ ID N0.4所示，反向外引物B3如SEQ ID N0.5所示。
4.根据权利要求3所述的特异性的LAMP引物组合物，其特征在于还包含正向环引物LF如SEQ ID N0.6所示，反向环引物LB如SEQ ID N0.7所示。
5.权利要求3或4所述的针对权利要求1所述的LAMP引物组合物在制备检测或鉴定大豆北方茎溃疡病菌的试剂中的应用。
6.一种用于检测大豆北方茎溃疡病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于包含权利要求3或4所述的特异性的LAMP引物组合物。
7.根据权利要求5所述的用于检测大豆北方茎溃疡病菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含:由20mM正向内引物FIP、20mM反向内引物BIP，IOmM正向外引物F3、10mM反向外引物B3, IOmM正向环引物LFUOmM反向环引物LR,9.26%10xThermoPolReaction Buffer,50mM MgSO4UOmM dNTP Mixture,5M 甜菜碱、8000U/mL Bst DNAPolymerase Large fragment及超纯水组成的检测溶液。
8.—种检测大豆北方茎溃疡病菌的方法，其特征在于提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用权利要求3或4所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP扩增反应；扩增产物加入SYBR GREEN I`染料，在常光和/或紫外光下检测，如果反应产物在常光下变显黄色、在紫外光下产生强烈荧光，则表示存在大豆北方茎溃疡病菌；如果反应产物在常光下显橙色、紫外光下无荧光产生则表示不含该病菌。
9.根据权利要求8所述的检测大豆北方茎溃疡病菌的方法，其特征在于提取待检微生物的DNA，取3 μ I DNA溶液，加入21.5 μ I权利要求7所述的检测溶液和2.5 μ I灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为:64°C70min ;增产物加入SYBR GREEN I染料，在紫外光下检测结果，如果反应产物产生强烈荧光，则表示存在大豆北方茎溃疡病菌，无荧光产生则表示不含该病菌。
【文档编号】C12N15/11GK103695542SQ201310683495
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】郑小波, 沈浩, 戴婷婷, 王源超, 张海峰 申请人:南京农业大学