急性髓系白血病相关miRNA标志物组及其特异引物与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种急性髓系白血病相关的miRNA标志物组及其特异引物与应用，该标志物组由miR－23b－3p标志物和miR－26a－5p标志物构成，miR－23b－3p标志物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，miR－26a－5p标志物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明还涉及该miRNA标志物组的特异引物与应用。本发明提供的微小核糖核酸（microRNAs）标志物组筛选出的两个标志物互补性强，从而使检测定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。
【专利说明】急性髓系白血病相关m i RNA标志物组及其特异弓丨物与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种急性髓系白血病相关miRNA标志物组及其特异引物与应用，属于医学分子生物学【技术领域】。
【背景技术】[0002]急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)是一种异质性髓细胞肿瘤，也称急性非淋巴细胞性白血病，常进展迅速。其特点是造血干细胞正常分化受阻，恶性肿瘤细胞克隆性增生取代正常造血，从而造成贫血、出血、感染及脏器浸润等一系列症状。在恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病在儿童及35岁以下成人中居第一位。在我国，白血病中以急性髓系白血病的年发病率最高，约占所有病例的58.7%。
[0003]急性髓系白血病不仅需要早期及时诊断，而且在化疗达到完全缓解后也依然需要不断监测病情并观察进展，及时采取相应的手段积极干预治疗。目前，急性髓系白血病患者的诊断和治疗方案主要依据细胞遗传学因素。虽然已有某些专利研究利用基因或蛋白标志物对患者进行分类，如中国专利文献(200910214195.9H)⑶7基因在早期判断急性髓系白血病预后中的应用)；(200910214196.3CGI 一 135基因在早期判断急性髓系白血病预后中的应用)；(201010213640.2 —种用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合、引物、探针和用途)；(201210496651.6白血病细胞蛋白质谱特征分子的检测方法)。但是这种分类仅依据mRNA和蛋白表达的差异，具有一定的局限性，忽略了同样具有重要功能作用的非编码RNA分子(主要是微RNA，miRNA)。因此，结合miRNA芯片所显示的表达情况，会进一步丰富基因表达谱，为急性髓系白血病提供更明确的诊断和预后手段。
[0004]MicroRNA (微RNA，miRNA)是细胞内一类在进化上高度保守，长度约为22个核苷酸的非编码RNA的基因产物。MiRNA由一段具有发卡结构的单链RNA前体经Drosha酶和Dicer酶的剪切后生成。MicroRNA通过与目标mRNA分子的3’端非编码区域(3’一 UTR)互补配对，使目标mRNA分子的翻译受到抑制或引起特异性的对mRNA分子的切割，从而在转录后水平对靶基因的表达进行调控。研究表明miRNA参与包括细胞增殖、凋亡、细胞分化、发育和逆境应答等多种生物学过程，因此人体的众多生命活动和疾病的发生发展都与miRNA的变化密不可分。近期研究发现miRNA异常表达和一系列白血病有着密不可分的关系。已有研究证实miRNA在造血过程粒细胞形成中起到重要的作用。比如在对人类早幼粒细胞株HL-60的研究中发现，miR-21, miR 一 196b的失调可抑制G-CSF诱导的粒细胞生产。比如在正常人髓系细胞中富集的miR — 223参与了粒细胞的发生过程。在miRNA与血液系统恶性疾病的关系中研究最为深入的是miR — 15a和miR — 16 — I与人慢性淋巴白血病(CLL)的相关性。miR — 15a和miR — 16 -1定位于CLL中最普遍的基因组织异常一 13ql4.3区域的杂合缺失和转座位置，该缺失直接导致它们的表达减低。miR - 15a和miR -16-1通过靶向抗凋亡基因BCL2，以类似于抑癌基因的作用抑制B淋巴细胞的过度增殖，而它们的缺失则导致B细胞增殖能力显著增强，从而脱离正常的增殖凋亡平衡走向恶性转化的途径。由于miRNA的变化早于基因和蛋白的改变，也早于疾病症状的出现，由此检测miRNA的动态变化，有可能为急性髓系白血病的发生发展提供线索，进而可以指导临床进行早期诊断，有效控制疾病的发展。
[0005]然而，到目前为止，miRNA用于急性髓系白血病早期诊断中的应用报道非常少。如中国专利文献200880003736.7，名称:用于急性髓细胞白血病(AML)的诊断、预后和治疗的基于微RNA的方法和组合物。该发明公开了用于白血病相关疾病，特别是急性髓性白血病的诊断、预后和/或治疗的利用miRNA特征的方法和组合物。
[0006]中国专利文献200910083737.3，名称:三个microRNA在人急性髓系白血病诊断和治疗中的应用。该发明公开了三个miRNA (miR —451，miR—29a和miR — 142 — 3p)在急性髓系白血病诊断和治疗中的应用。涉及在人急性髓系白血病人外周血单个核细胞中表达明显减少的miR — 451，miR — 29a和miR — 142 — 3p的功能及其在AML诊断、预后和治
疗中的应用。
[0007]综上所述，miRNA是细胞内一类重要的调节因子，调控许多基因的表达，与急性髓系白血病发生发展关系密切。通过检测miRNA表达进行早期诊断比传统的蛋白或基因表达分析具有更高的准确度。然而现有AML早期诊断标记物不涉及基于粒细胞miRNA表达谱变化引出的miR - 23b - 3p和miR — 26a 一 5p组合作为AML早期诊断分子标记物的应用。结合AML中异常表达的粒细胞miR - 23b 一 3p和miR — 26a 一 5p组合，并研制相对应的AML辅助诊断试剂盒，对我国急性髓系白血病的诊断现状一定有良好的促进作用。
【发明内容】
[0008]本发明针对现有技术的不足，提供一种急性髓系白血病相关miRNA标志物组及其特异引物与应用。
[0009]本发明技术方案如下:
[0010]一种与急性髓系白血病相关miRNA标志物组，该标志物组由核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示的miR - 23b-3p标志物与核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的miR — 26a 一 5p标志物构成。
[0011]上述与急性髓系白血病相关的miRNA标志物组的特异引物，miR — 23b_3p标志物的特异引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示；miR — 26a 一 5p标志物的特异引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示。
[0012]上述与急性髓系白血病相关miRNA标志物组在制备急性髓系白血病辅助早期诊断试剂盒中的应用。
[0013]上述与急性髓系白血病相关miRNA标志物的特异引物在制备急性髓系白血病辅助早期诊断试剂盒中的应用。
[0014]上述急性髓系白血病辅助早期诊断试剂盒，包括:
[0015]核苷酸序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的miR — 23b — 3p标志物的特异引物；核苷酸序列如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的miR — 26a 一 5p标志物的特异引物；
[0016] 逆转录酶、缓冲液，dNTPs, MgCl2, DEPC水和Taq酶，以及人U6miRNA。
[0017]人U6miRNA做为标准品使用。人U6miRNA购自广州复能基因有限公司。
[0018]上述逆转录酶、缓冲液，dNTPs, MgCl2, DEPC水和Taq酶均为本领域常用试剂，本领域技术人员可以根据需要自行选取。
[0019]上述试剂盒的使用过程如下:(DmiRNA差异表达谱分析:选择急性髓系白血病病例和与其匹配的健康对照，检测其外周血粒细胞miRNA表达谱及含量，分析病例和健康对照间miRNA的共性和特性，筛选特异表达的miRNAs。(2)筛选疾病相关miRNAs:对已筛选的粒细胞miRNAs进行更优化的定量分析，确定急性髓系白血病相关miRNAs。(3)miRNAs筛查和诊断试剂盒的研制:根据急性髓系白血病相关miRNAs开发的miRNAs辅助诊断试剂盒，实现急性髓系白血病早期诊断的目的。
[0020]有益效果
[0021 ] 1、本发明提供的微小核糖核酸(mi croRNAs )标志物组作为急性髓系白血病辅助早期诊断的标志物的优越性在于:miRNA本身仅有18 - 25个核苷酸，其成熟体稳定存在于细胞质中，因此在急性髓系白血病中miRNA极有可能早于结构蛋白类物质表现出异常，检测其水平可作为急性髓系白血病辅助早期诊断的生物标记物。
[0022]2、本发明提供的微小核糖核酸(microRNAs)标志物组筛选出的两个标志物互补性强，从而使检测定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为急性髓系白血病患者组和正常健康对照组外周血粒细胞miRNAs表达差
巳
升；
[0024]其中:深色代表高表达，浅色代表低表达，图中标注的引物为miR - 23b 一 3p和miR —26a — 5p ；
[0025]图2为筛选的miRNAs Real — time PCR芯片验证结果；
[0026]图3为hsa — miR 一 23b 一 3p和hsa — miR 一 26a 一 5p在较大样本病例组和健康组的Real — time PCR检测结果。
【具体实施方式】:
[0027]下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
[0028]实施例中的人U6miRNA购自广州复能基因有限公司。
[0029]实施例1
[0030]1.接受急性髓系白血病12例和体检正常健康对照20例，使用抗凝管抽取5ml外周血，分离获取粒细胞。
[0031]2.粒细胞总RNA抽提:采用TRI Reagent BD试剂从粒细胞中抽提RNA。
[0032](I)裂解:0.75mlTRI Reagent BD,制得裂解液；
[0033](2)两相分离:裂解液+0.1ml溴氯丙烷或者0.2ml氯仿；
[0034](3) RNA沉淀:水相层+0.5ml异丙醇；
[0035](4)清洗 RNA:Iml75% 乙醇；
[0036](5)RNA溶解:用FORMAzol、水或者用枪头吹打混匀配制而成的0.5wt%SDS溶液溶解 RNA。
[0037]3.miRNA 芯片杂交:采用 Exiqon miRCURY LNAtmIL 0 芯片，包括 miBase 数据库人、小鼠、大鼠三物种的全部miRNA，芯片上捕获探针均为专利的LNA探针，实现了 Tm均一化。
[0038]以急性髓系白血病患者为实验组，以正常健康人为对照组，分别提取RNA。采用miRCURY?Array Power标记试剂盒，用标记酶将Hy3?或者Hy5?荧光基团标记miRNA，然后进行芯片杂交。杂交液为IOOii L含25wt%甲醛的6XSSPE缓冲液(0.90M NaCl,60mMNa2HPO4,6mM EDTA，pH6.8)。杂交后的芯片用Axon GenePix4000B进行图像扫描，采用GenepixPro6.0软件进行数据分析，P〈0.05, fold change>l.5为有显著性差异。相关芯片结果如图1和图2所示。
[0039]4.Real — time PCR 检测
[0040]使用美国应用生物公司的miRNA检测试剂盒(包括反转录试剂盒、特异性miRNA引物及探针、荧光定量检测试剂盒等)检测粒细胞中5种miRNA以及参照物miRNA (U6)的水平，以三次结果(Ct值)的平均值作为特定miRNA的Ct值,具体过程可参见www.mirna.appliedbiosystems.com有关产品使用说明。
[0041]5.数据的标准化处理:根据测得的样品中miRNA和参照miRNA (U6)的Ct值。以U6为参照，求得特定miRNA在粒细胞中的相对含量，以PCR检测中的经典的2 — ACt的方式表示粒细胞中特定miRNA的水平(A Ct为目标miRNA与参照U6的Ct值之差)，具体过程可参见 www.mirna.appliedbiosystems.com 有关产品使用说明。
[0042]6.结果:发现5个miRNA在4例急性髓细胞白血病患者和4例正常对照人中表达有显著差异，如表1、表2和图3所不。
[0043]表1.相关miRNAs的序列信息
[0044]
【权利要求】
1.一种与急性髓系白血病相关miRNA标志物组，该标志物组由核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示的miR - 23b-3p标志物与核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的miR — 26a 一 5p标志物构成。
2.权利要求1所述与急性髓系白血病相关miRNA标志物组在制备急性髓系白血病辅助早期诊断试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述与急性髓系白血病相关的miRNA标志物组的特异引物，miR-23b-3p标志物的特异引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示；miR — 26a —5p标志物的特异引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示。
4.权利要求3所述与急性髓系白血病相关miRNA标志物的特异引物在制备急性髓系白血病辅助早期诊断试剂盒中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述急性髓系白血病辅助早期诊断试剂盒，包括:
核苷酸序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的miR — 23b 一 3p标志物的特异引物；核苷酸序列如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的miR — 26a — 5p标志物的特异引物； 逆转录酶、缓冲液，dNTPs, MgCl2, DEPC水和Taq酶，以及人U6miRNA。
【文档编号】C12Q1/68GK103642928SQ201310683231
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】李曦 申请人:山东大学