用于治疗mds的cd95信号传导途径的抑制剂的制作方法
【专利说明】用于治疗MDS的CD95信号传导途径的抑制剂
[0001] 描述
[0002] 本发明涉及用于在骨髄增生异常综合征（MDS)的治疗中使用的CD95信号传导途 径的抑制剂，其中所述MDS选自IPSS低风险MDS亚组和/或IPSS中等-l(int-l)风险MDS 亚组；以及用于诊断MDS的方法。
[0003] 骨髄增生异常综合征（MDS)是克隆性造血干细胞病症，其以无效造血为特征，所 述无效造血导致血液血细胞減少症，尤其是贫血，并且常常演变为急性髓性白血病（AML)。 特别地，MDS可以以有缺陷的红细胞系祖先生长为特征。因此，通常基于在血液和骨髄中的 形态学和母细胞百分比来对MDS进行分类（法国-美国-英国（FrenchAmericanBritish， FAB)，和WHO分类）（Bennett等人，1982;Vardiman等人，2009)。
[0004] 红细胞生成由牵涉在骨髓幼红细胞岛中细胞-细胞相互作用和可溶性因子的正 信号和负信号之间的平衡来控制。在图1中显示了关于红细胞生成的概览。⑶34+造血干 细胞（HSC)向红细胞谱系的定型处于重要的转录因子例如GATA-I和细胞因子例如c-Kit 配体、干细胞因子（SCF)的控制之下。红细胞系区室的大小由刺激CFU-E和前成红细胞成 熟并阻止其凋亡的促红细胞生成素来上调。红细胞系细胞获得膜CD71(转铁蛋白受体）表 达，随后是在更成熟的细胞上的血型糖蛋白A(GPA)(图1)。
[0005] 红细胞生成的负调节依赖于Fas/FasL，其通过与在成熟红细胞系前体上表达的 FasL的相互作用（DeMaria等人，1999)和还通过处于相同分化阶段的成红细胞的自身 调节（Socolovski等人，2008)来促成表达Fas的未成熟成红细胞的凋亡。正常红细胞系 前体的成熟需要胱天蛋白酶-3的激活，尽管没有证明胱天蛋白酶-8活性（DeMaria等 人，1999 ;Zermati等人，2001)。胱天蛋白酶-3底物的切割是受限制的。例如，在促红细 胞生成素剥夺的条件下，GATA-I是胱天蛋白酶-3的底物，虽然在Epo存在下，GATA-I通过 与从胞质转位至细胞核的Hsp70相互作用而被保护从而免于切割（Ribeil等人，2007)。
[0006] MDS红细胞生成异常与Fas下游的胱天蛋白酶-8的异位激活相关。申请人的小 组和其他人以前已证明，Fas在CD34+未成熟祖先的表面上和在红细胞系定型祖先中过表 达。Fas表达随着红细胞系分化而增加，开始于在GPA-阳性红细胞系前体中的Fas配体表 达，导致在红细胞谱系中胱天蛋白酶-8的异位激活。这在新鲜的骨髓细胞中（Bouscary等 人，1997)以及在以2-步液体培养衍生的红细胞系细胞中（Claessens等人，2002)观察 到。衔接子FADD的经慢病毒表达的显性失活突变体的异位表达对Fas信号传导的抑制减 少了胱天蛋白酶-8激活，和抑制了在MDS红细胞系前体中的凋亡（Claessens等人，2005)。 Fas/FasL可以有助于阻止正常的红细胞系分化和诱导在MDS红细胞系细胞中的凋亡。
[0007] 最近的数据表明，在低度MDS中红细胞系细胞成熟严重受损。通过由Socolovski 等人（2007)所描述的CD71/GPA标记来对红细胞系细胞前体进行定量。观察到，在7天后， 相比于正常培养物而言，在MDS细胞培养物中⑶7Is /GPAte细胞的份额增加而⑶71/GPA S的份额降低。第14天的红细胞系前体的转录组学研究表明，编码血型糖蛋白A(GPA)的 GYPA的表达降低了 2倍。另外，几个其他红细胞系基因被下调。
[0008]MDS是罕见的疾病（发病率3-5/100000人/年）并且在老年人（平均年龄65至 70岁）中占优势。
[0009] 通常，MDS通过施用传统的红细胞生成刺激试剂（ESA)来进行治疗。
[0010] 然而，在本发明之前，对于ESA具有抗性的MDS患者是难以治疗的。
[0011] 因此，本发明的目标是提供用于MDS的新的治疗选项，特别是用于治疗对于ESA具 有抗性的MDS患者。
[0012] 本发明的第一个方面涉及用于在骨髄增生异常综合征（MDS)的治疗中使用的 CD95信号传导途径的抑制剂，所述骨髓增生异常综合征选自IPSS低风险MDS亚组和/或 IPSS中等-1 (int-1)风险MDS亚组。
[0013]根据本发明，术语⑶95、⑶95R和⑶95-受体可以互换使用。另外的同义词为Apo-I 或Fas，其可以在本文中互换使用。此外，术语⑶95L、⑶95-配体和相应的同义词FasL、 Ap〇-lL、CD178或TNF-SF6可以互换使用。
[0014] 按照本发明，"⑶95信号传导途径的抑制剂"可以是至少部分地干扰或阻断 CD95信号传导途径的任何化合物。根据ー个优选的实施方案，"CD95信号传导途径的 抑制剂"阻断CD95信号传导途径。用于测定和/或评估CD95信号途径活性的方法 是本领域技术人员已知的，并且例如由Lavrik等人(CellDeathDiffer. 2012年I 月，19(1) :36-41,RegulationofCD95/FassignalingattheDISC)作了描述。
[0015] 根据本发明的抑制剂可以在蛋白质水平和/或核酸水平上起作用。在蛋白质水平 上起作用的抑制剂可以选自抗体、蛋白质和/或小分子。在核酸水平上起作用的抑制剂为 例如反义分子、RNAi分子和/或核酶。
[0016] 根据ー个尤其优选的实施方案，所述抑制剂与CD95受体（CD95)和/或CD95配体 (CD95L)结合。在另ー个实施方案中，CD95/CD95L相互作用可以被抑制。
[0017] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的抑制剂为抗体或其功能片段。为抗体的 抑制剂可以与CD95结合，但当然也可以与CD95L结合。结合CD95L的抗体的ー个例子为 Nok-I〇
[0018] 所述抗体可以为例如单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、人抗体、嵌 合抗体、多特异性抗体或其抗体片段（例如，Fab片段、Fab'片段、F(ab'）2片段、Fv片段、 双抗体或单链抗体分子）。所述抗体可以是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4类型的。
[0019] 所述抗体可以以具有或没有修饰的形式进行使用，并且可以共价地或非共价地进 行标记，用例如报道基团或效应基团。
[0020] 根据本发明的"抗体片段"呈现与相应的抗体基本上相同的表位结合位点，和/或 具有与相应的抗体实质上相同的CD95和/或CD95L抑制活性。
[0021] 用于产生本发明的抗体的方法是本领域技术人员已知的。
[0022] 本发明所包括的ー种抑制剂种类可以为CD95-配体抑制剂。例如，CD95-配体抑制 剂可以选自：(a)抑制性抗-CD95配体抗体或其片段，如上面所概述的；(b)可溶性CD95受 体分子或其CD95配体结合部分；和（c)选自FLINT、DcR3或其片段的CD95-配体抑制剂。
[0023] 可溶性CD95受体分子，例如没有跨膜结构域的可溶性CD95受体分子，描述在 EP-A-0595659和EP-A-0965637中，或者描述在WO99/65935中的CD95受体肽。
[0024]Fas配体抑制剂FLINT或DcR3或者其片段（例如，可溶性片段），例如可选地与异 源多肽（特别是Fc免疫球蛋白分子）相融合的细胞外结构域，描述在WO99/14330或WO 99/50413中。FLINT和DcR3是能够结合CD95配体的蛋白质。
[0025] 在另ー个实施方案中，所述抑制剂为融合蛋白，特别是与CD95L结合的融合蛋白。
[0026] 在一个实施方案中，CD95L抑制剂包含CD95R分子的细胞外结构域，例如根据美 国专利号5, 891，434的成熟⑶95序列的氨基酸1至172(MLG. . .SRS)。可以将⑶95R分子 的该细胞外结构域与异源多肽结构域（特别是包括铰链区的Fc免疫球蛋白分子，例如来 自人IgGl分子的）相融合。包含细胞外CD95结构域和人Fc结构域的融合蛋白描述在WO 95/27735 中。
[0027] 因此，根据ー个优选的实施方案，与⑶95L结合的试剂为包含细胞外⑶95结构域 和Fc结构域（特别是人Fc结构域）的融合蛋白。
[0028] 根据ー个尤其优选的实施方案，与⑶95L结合的试剂为APGlOl或者其功能片段、 同种型和/或衍生物。APGlOl包含结构域CD95R(SEQIDNO: 1的氨基酸26-172 ;ECD细胞 外结构域）和结构域IgGl-Fc(SEQIDN0:1的氨基酸172-400)。APGlOl及其衍生物公开 在TO95/27735 和TO2004/085478 中。
[0029] 在本发明的另外ー个实施方案中，所述抑制剂为核酸效应分子。所述核酸效应分 子可以为DNA、RNA、PNA或DNA-RNA-杂合体。它可以是单链的或双链的。可以使用衍生自 逆转录病毒、腺病毒、疱瘆病毒或痘苗病毒或者衍生自各种细菌质粒的表达载体来将核苷 酸序列递送至所靶向的器官、组织或细胞群。可以使用这样的构建体来将不可翻译的有义 或反义序列引入到细胞中。甚至在不存在整合到DNA中的情况下，此类载体也可以继续转 录RNA分子直至它们由于内源核酸酶而丧失能力。用非复制型载体，瞬时表达可以持续一 个月或更久，和甚至更长，如果合适的复制元件是该载体系统的一部分。
[0030] 所述核酸效应分子可以特别地选自优先地能够抑制⑶95R和/或⑶95L基因的表 达的反义分子、RNAi分子和核酶。
[0031] 如上面所概述的，本发明特别地涉及骨髄增生异常综合征（MDS)的治疗，所述骨 髓增生异常综合征选自国际预后评分系统（InternationalPrognosticScoringSystem， IPSS)低风险MDS亚组和/或IPSS中等-1 (int-1)风险MDS亚组。
[0032]IPSS是本领域技术人员熟知的。关于进展至AML以及存活的MDS的主要预后因素 包括细胞減少症的数目和重大性，骨髄母细胞的百分比，和骨髓细胞遗传异常。每个指示物 根据其严重性来进行评级，并且将等级组合为"得分"，IPSS。
[0033] IPSS区分出4个亚组，其具有显著不同的进展至AML和存活的风险：低风险、中 等-1 (int-1)风险、中等-2 (int-2)风险和高风险。低风险和中等-1风险亚组经常被 归并为"有利的"或低风险的MDS，而中等-2风险和高风险亚组为"不利的"或高风险的 MDS(Greenberg等人，1997)。
[0034] 低风险的MDS(具有低或int-lIPSS)以增加的骨髓祖先的凋亡为特征，所述骨髓 祖先的凋