骨保护素衍生的组合物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明大体上涉及生物制药领域以及在与骨吸收关联的情况中--例如在肿瘤 学中一的生物制药的用途。更具体地，本发明涉及结合核因子kB受体活化因子配体 (RANKL)的骨保护素衍生的组合物。
【背景技术】
[0002] 在本节中描述的方法可被实行，并且不一定是先前已经构思或实行的方法。因此， 除非另有说明，不应假设在本节中描述的任何方法，仅仅因为它们包含在本节中而将其作 为现有技木。
[0003] 人类的骨保护素（0PG;基因库：U94332. 1)是401个氨基酸的蛋白质，其包含21个 氨基酸的信号肽，其在谷氨酸22产生380个氨基酸的成熟的可溶性蛋白质之前被分开。OPG 是肿瘤坏死因子受体（TNFR)家族的ー员，在其N-末端部分中包含四个富含半胱氨酸TNFR 样结构域。OPG已经显示出在骨发展中发挥作用，并且缺少OPG基因的小鼠具有骨质疏松的 表型和肉眼可见的骨骼异常。
[0004]OPG--其由成骨细胞和骨髓基质细胞产生--充当没有明显的直接信号功能的 分泌诱饵受体。OPG通过结合其自然的配体--骨保护素配体（OPGL)起作用，其也被称为 RANKL(核因子kB受体活化因子配体）。OPG和RANKL之间的结合阻止了RANKL激活其同源 受体RANK，RANK是对于破骨细胞分化、活化和存活至关重要的破骨细胞受体。
[0005] 重组体OPG以分别大约55kDa和IlOkDa的表观分子量的单体和二聚体的形式存 在。N-末端结构域至半胱氨酸残基185的截断可能通过破坏TNFR样结构域的二硫键导致 OPG失活，而蛋白质的C-末端部分至残基194的截断不改变生物活性。
[0006] 在转基因小鼠中的OPG的超表达导致以小鼠中的破骨细胞几乎完全缺乏为特征 的严重的骨硬化病。相反地，OPG基因的消融导致在小鼠中严重的骨质疏松，这显示了OPG 在调节骨吸收中的重要的生理作用。来自于成骨细胞和基质细胞的OPG和RANKL的分泌 物由多个激素和细胞因子进行调节。OPG和RANKL产量的相对水平被认为是用于控制骨吸 收的程度：RANKL的表达增加骨吸收，而过量的OPG具有相反的效果。重组体OPG阻碍体外 和体内的刺激破骨细胞的绝大部分因素的影响。OPG也抑制多种动物疾病模型--包括卵 巢切除术、诱发型骨质疏松、恶性体液性高钙血症以及实验性骨转移--中的骨吸收。因 此，OPG可代表针对与过度的破骨细胞活动关联的疾病的有效的治疗选择（KostenuikPJ， ShalhoubV?，发表在当今制药（CurrPharmDes. )2001 年 5 月版；7 (8) :613-35)。
[0007] 狄诺塞麦（Denosumab)是高亲和力的完全人单克隆抗体，其结合了人的RANKL并 抑制其与RANK相互作用，因此具有类似于OPG的作用方式。针对绝经后妇女骨质疏松的 预防和治疗，美国食品和药物管理局（FDA)批准了商品名为普罗利亚（Prolia)的狄诺塞 麦。针对具有来自于实体瘤的骨转移的患者的骨骼相关事件的预防，美国食品和药物管理 局（FDA)批准了商品名为Xgeva的狄诺塞麦。针对其它骨重塑的相关情况的狄诺塞麦的进 一步的临床试验目前正在进行，即，针对来自于癌症的其它形式的骨转移。
[0008] 因此，人们希望有ー种治疗组合物，其能够与RANKL结合并基于自然出现的OPG分 子，当具有可接受的药理学特性时，其具有更广泛的治疗潜力。
【发明内容】
[0009] 提供本
【发明内容】
用于以简化形式介绍以下在【具体实施方式】中进ー步说明的所选 构思。本内容不g在确定所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不g在被用作确定 所要求保护的主题的范围的辅助。
[0010] 在某些方面，本发明提供一种结合了人的RANKL的多肽。该多肽包含第一氨基酸 序列，该第一氨基酸序列包含人骨保护素的氨基酸1至215 (基因库：U94332. 1)。该多肽 进ー步包含第二氨基酸序列，该第二氨基酸序列包含人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至 329(基因库：几0228.1)。该多肽在具有在100叩/1111的浓度时约501^/1111或不超过10%的 半数有效浓度（EC50)的体外基于细胞的測定中能够抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。该 多肽可包含SEQIDNO. 1的氨基酸序列。
[0011] 在某些方面，本发明提供ー种治疗组合物。该组合物包含结合人的RANKL的多肽。 该多肽包含人骨保护素的生物活性部分和人免疫球蛋白Y-I的Fc部分。该多肽被实质上 纯化为在溶解状态中的同型二聚体形式。该多肽在皮下给药5mg/kg的剂量之后至少80小 时的小鼠的体循环中可显示半衰期。在所述组合物的不超过lmg/kg的剂量、每周三次、至 少6周的皮下给药的过程中，在鼠科动物的溶骨性模型（bonelyticmodel)中，该多肽能 够实质上抑制由人乳腺癌诱导的骨溶解。
[0012] 在某些方面，本发明提供ー种治疗组合物。该组合物包含第一氨基酸序列，该第一 氨基酸序列包含人骨保护素的氨基酸1至215。该多肽进ー步包含第二氨基酸序列，该第二 氨基酸序列包含人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至329。该多肽可以被实质上纯化至在 溶解状态中的同型二聚体形式。该多肽在皮下给药5mg/kg的剂量之后至少80小时的小鼠 的体循环中可显示半衰期。在所述组合物的不超过lmg/kg的剂量、每周三次、至少6周的 皮下给药的过程中，在鼠科动物的溶骨性模型中，该多肽能够实质上抑制由人乳腺癌诱导 的骨溶解。该多肽可包含SEQIDNO. 1的氨基酸序列。
[0013] 在某些方面，本发明提供ー种编码结合人的RANKL的多肽的分离的核酸。该多肽 包含第一氨基酸序列，该第一氨基酸序列包含人骨保护素的氨基酸1至215。该多肽进ー步 包含第二氨基酸序列，该第二氨基酸序列包含人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至329。 多肽中的第一氨基酸序列可先于第二氨基酸序列。该多肽可包含SEQIDNO. 1的氨基酸序 列。核酸可针对哺乳动物细胞中的多肽的高效表达使其密码子使用优化。核酸可包含SEQ IDN0.2的序列。核酸可包含表达载体。
[0014] 在某些方面，本发明提供一种异源表达系统。该表达系统隐含包含编码结合人的 RANKL的多肽的核酸序列的表达载体。该多肽包含第一氨基酸序列，该第一氨基酸序列包含 人骨保护素的氨基酸1至215。该多肽进ー步包含第二氨基酸序列，该第二氨基酸序列包含 人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至329。多肽中的第一氨基酸序列可先于第二氨基酸序 列。该多肽可包含SEQIDNO. 1的氨基酸序列。表达系统的表达载体可隐含于哺乳动物细 胞中。哺乳动物细胞可以是中国仓鼠卵巣（CHO)细胞。表达系统中的多肽的表达水平可以 是细胞培养的至少125毫克每公升。
[0015] 在某些方面，本发明提供一种物质的用途，该物质用于制造针对与骨吸收或重塑 关联的疾病的治疗或预防的药物。该物质包含结合人的RANKL的多肽。该多肽包含第一氨 基酸序列，该第一氨基酸序列包含人骨保护素的氨基酸1至215。该多肽进ー步包含第二氨 基酸序列，该第二氨基酸序列包含人免疫球蛋白Y-IFc的氨基酸103至329。多肽中的第 一氨基酸序列可先于第二氨基酸序列。该多肽可包含SEQIDN0.1的氨基酸序列。与骨吸 收或重塑关联的疾病可以是癌、乳腺癌、前列腺癌、多发性骨髄瘤、由于实体瘤的骨转移、骨 质疏松、类风湿性关节炎或牛皮癣关节炎。
[0016] 在某些方面，本发明提供一种治疗或预防与骨吸收或重塑关联的疾病的方法。该 方法包含给予需要治疗或预防与骨吸收或重塑关联的疾病的患者在治疗上有效量的药物 组合物，该药物组合物包含结合人的RANKL的多肽。该多肽包含第一氨基酸序列，该第一氨 基酸序列包含人骨保护素的氨基酸1至215。该多肽进ー步包含第二氨基酸序列，该第二氨 基酸序列包含人免疫球蛋白Y -IFc的氨基酸103至329。多肽中的第一氨基酸序列可先于 第二氨基酸序列。该多肽可包含SEQIDN0.1的氨基酸序列。与骨吸收或重塑关联的疾病 可以是癌、乳腺癌、前列腺癌、多发性骨髄瘤、骨肉瘤、由于实体瘤的骨转移、骨质疏松、类风 湿性关节炎或牛皮癣关节炎。
[0017] 在此描述的本发明的这些和其它方面和优势在结合下述附图和【具体实施方式】后 将变得显而易见。
【附图说明】
[0018] 提供以下附图和说明书用于帮助理解本发明：
[0019] 图1示意性地示出了用在本发明的多肽的克隆中的PCDNA4-FC质粒和带注释的序 列的图谱；
[0020] 图2示意性地示出了用在本发明的多肽的克隆中的PKN002质粒和带注释的序列 的图谱；
[0021] 图3示出了在生成用于表达本发明的多肽的稳定的细胞系的过程中获得的代表 性的转染生长曲线；
[0022] 图4示出了在阴离子交換层析纯化步骤之后的包含SEQIDNO. 1的多肽的样品的 尺寸排阻高效液相色谱法（HPLC)分析色谱图；
[0023] 图5示出了在阴离子交換层析纯化步骤之后的包含SEQIDNO. 1的多肽的样品的 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)分析（在还原条件下）；
[0024] 图6示出了描绘显示包含SEQIDN0.1的多肽的样品的优良的分辨率 (resolution)的羟基磷灰石层析洗脱的轮廓；
[0025] 图7示出了来自于羟基磷灰石层析的包含SEQ ID NO. 1的多肽的洗出液的主峰的 样品的尺寸排阻HPLC分析色谱图；
[0026] 图8示出了用于骨溶解的评估的接种后八周时来自组1(制剂缓冲液的皮下注射 给药）的代表性小鼠的胫骨的X射线图像（分配的分数在每个图像下面示出）；
[0027] 图9示出了用于骨溶解的评估的接种后八周时来自组2 (lmg/kg的SEQIDNO. 1 的多肽的皮下注射给药）的代表性小鼠的胫骨的X射线图像（分配的分数在每个图像下面 示出）；
[0028] 图10示出了在组1、2和5的每个中的一只代表性小鼠的二维微型CT扫描图像； 以及
[0029] 图11示出了在组1、2和5的每个中的一只代表性小鼠的三维微型CT扫描图像。
【具体实施方式】
[0030] 在此公开的教导是部分地基于包含融合到人IgG的Fc部分的OPG的生物活性 N-末端部分的蛋白质分子的工程。为了提供这样的OPG衍生的蛋白质分子的重组生产，DNA 表达载体已经被构建用于在异源蛋白表达系统中过度生产蛋白质分子，并且哺乳动物细胞 已经准备稳定地表达蛋白质分子至高表达水平。出乎意料地，来自于重组体来源的蛋白质 分子形成溶解状态中的同型二聚体和同型四聚体。已经想出允许获得生理学有关的实质上 纯的蛋白质分子的同型二聚体制剂的蛋白质纯化程序。因此，在相关的体外基于细胞的测 定中，纯化的蛋白质分子显示出高度抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。出乎意料地，根据皮 下动物给药，蛋白质分子显示出可接受的药物动力学特性（pharmacokineticsprofi