专利名称：多肽类蓝萼甲素衍生物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蓝萼甲素(GLA)衍生物，特别涉及具有多肽取代基的蓝萼甲素衍生 物。本发明还涉及所述多肽类蓝萼甲素衍生物的制备方法及其在治疗癌症中的应用。
背景技术：
唇形科香茶菜属植物。在亚洲东部和非洲西部广为分布，全世界约有150种，我国 约有90种25个变种。其中约有30种民间作为药用，作为清热解毒、抗癌消炎、健脾、活血、 杭菌药来使用。人们对该属植物的-菇类成分作了研究，已从中提取了百余种药类成分。经 药理筛选发现许多二萜化合物具有细胞毒、抗肿瘤、杭炎活性作用。蓝萼香茶菜是唇形科香茶菜属植物，分布在我国的东北、华北，朝鲜.日本，原苏 联远东地区，吉林省资源尤其丰富。蓝萼香茶菜具有健胃、清热解毒、活血、抗菌消炎和抗癌 活性，用于胃炎、肝炎初起、感冒发热、乳腺炎、关节痛等疾病。现代研究发现全草对心血管 有一定的作用，而其中的有效成分对血小板聚集及癌症有一定的影响。1981年许云龙等人从蓝萼香茶菜中提取出蓝萼甲素(glaucocalyxinA)和蓝萼乙 素(glaucocalyxinB)，从光谱中推断蓝萼甲素具有香茶菜属二萜典型的巧一氧_16 —贝壳 杉烯(ent-15-OXO-16-kaurene)骨架，而蓝萼乙素是蓝萼甲素的14 一乙酰化物，把两者分 别乙酰化，得到相同的乙酰化物，从而证实了两者的相互关系。随后赵全成也从吉林产蓝萼 香茶菜中分得这两种二萜。1988年刘晨江等从北京地区产蓝萼香茶菜中分得甲素和乙素外，还分得蓝萼丙素 (glaucocalyxinC)，结构为对映 _7p，14a, 15a-三羟基-16-贝壳杉-3-酮。Dongsa kimls, 除了从中分出蓝萼甲素、蓝萼乙素和蓝萼丙素，还分出了两种新二萜glaucocalyxinD和 glaucocalyxinE并列出了这五种化合物的结构红外紫外吸收值、最主要的IH—核磁共振、 13C 一核磁共振化学位移值及质谱数据值。金永日等从蓝萼香茶菜根中分得了蓝萼甲素，另外王先荣等从安徽产王枣子〔 Isodonamethystoides(Benth)CyffuetHsuan)中也分得蓝萼甲素。王慧芬等人用反相高效 液相色谱法外标法对不同部位及不同采集期的蓝萼香茶菜中蓝萼甲素的含量进行了测定， 结果表明叶中蓝萼甲素远高于根、茎。不同采集期以7-8月份含量高，9月末含量下降。张 元桐等也采用反相HPLC测定蓝萼甲素含量，测得蓝萼甲素含量为1.03%，平均回收率为 99. 2%。从蓝萼甲素体内外实验结果来看，其具有较强的抗肿瘤作用，且抗瘤谱较广，能抑 制Lewis肺癌、5180实体型以及HCA实体型等实体瘤的生长，明显增加荷腹水型5180腹水 型和荷HCA腹水型小鼠的生命延长率，其抗肿瘤作用的强弱呈剂量依赖性。科研人员用MTT法对从毛叶香茶菜叶中分离鉴定的14个已知对映-贝壳杉烯类 二萜化合物进行了人早幼粒白血病细胞、人卵巢癌细胞和人肺癌细胞的抗癌活性研究，其 中具有α _亚甲基环戊酮结构的化合物对上述3种肿瘤细胞株均表现出不同程度的抑制 活性。从蓝萼香茶菜叶分离的化合物如蓝尊香茶菜甲素(GLA)和乙素(GLB)结构中具有α -亚甲基环戊酮，因而显示出较强的生物活性。对若干天然及化学修饰后的贝克杉烯类化合物进行了系统的体外抗肿瘤活性筛 选及构效关系研究表明，应用化学手段破坏分子中α-亚甲基环戊酮结构单元，会显著降 低贝克杉烯类化合物的抗肿瘤活性。由于蓝萼甲素为对映-贝壳杉烯类二萜化合物，其化合物极性小，易溶于氯仿等 非极性溶剂，在水中不溶，因此不适合直接作为药物进行给药；蓝萼甲素体外具有明显的抗 癌作用，但在体内需大剂量长时间用药才能产生药效。药物在体内消除很快，半衰期短，尚 不能直接作为药物使用。
发明内容
鉴于蓝萼甲素(GLA)特别是其α -亚甲基环戊酮结构对肿瘤细胞株活性具有良好 的抑制作用，然而由于其极性小、半衰期短等特点，其不适于直接作为药物进行给药，故现 在需要以蓝萼甲素(GLA)为先导化合物，通过对先导化合物的结构改造，来获得蓝萼甲素 的衍生物，从而使其按照已知的代谢途径失活或不代谢，而由原形排出体外，从而提高药物 的安全性，增加药效。本发明的目的之一在于提供具有对肿瘤细胞株良好的抑制作用的、结构改良的多 肽类蓝萼甲素(GLA)衍生物，从而解决GLA极性小、不易溶于水、半衰期短、在体内消除过快 等缺陷，从而作为治疗癌症的药物使用。本发明的目的之二在于提供所述多肽类蓝萼甲素衍生物的制备方法，避免单纯的 采用有机合成所带来的毒副作用较大的缺陷，并且避免单纯的采用原料提纯多带来的药效 较低、无法针对性治疗某一特定癌症的缺陷。本发明所公开的多肽类蓝萼甲素衍生物是一种贝壳杉烷型四环二萜类物质，具有 贝壳杉烷型结构、羰基、羟基和多肽结构，其分子结构的通式如下
权利要求
一种多肽类蓝萼甲素衍生物，其特征在于，是一种贝壳杉烷型四环二萜类物质，具有贝壳杉烷型结构、羰基、羟基和多肽结构，其分子结构的通式如下其中，R1、R2为 OH或其中，R3为直链多肽取代基。F2009100564624C00011.tif,F2009100564624C00012.tif
2.如权利要求1所述的多肽类蓝萼甲素衍生物，其特征在于，所述Rl和R2中有一个 为-0H。
3.如权利要求1所述的多肽类蓝萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3为三肽取代基或 四肽取代基。
4.如权利要求1所述的多肽类蓝萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3为三肽 Arg-Gly-Asp-OH的取代基Arg-Gly-Asp-，所述三肽的分子式为C12H22N606 ；或者，所述R3为四肽Arg-Gly-Asp-Val-OH的取代基Arg-Gly-Asp-Val-，所述四肽的分 子式为 C17H31N707 ；或者所述R3为四肽Arg-Gly-Asp-Ser-OH的取代基Arg-Gly-Asp-Ser-，所述四肽的分 子式为 C15H27N708。
5.如权利要求1所述的多肽类蓝萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3为三肽取代基 Arg-Gly-Asp-,所述Rl为
6.如权利要求1所述的多肽类蓝萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3为三肽取代基 Arg-Gly-Asp-,所述R2为
7.如权利要求1所述的多肽类蓝萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3为四肽取代基
8.如权利要求1所述的多肽类蓝萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3为四肽取代基
9.如权利要求1所述的多肽类蓝萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3为四肽取代基
10.如权利要求1所述的多肽类蓝萼甲素衍生物，其特征在于，所述R3为四肽取代Arg-Gly-Asp-Ser-，所述R2为
11. 一种如权利要求1所述的多肽类蓝萼甲素衍生物的制备方法，其特征在于，包含以 下步骤步骤1 提取步骤1. 1 取香茶菜药材(地上部分)粉碎至20目 50目；步骤1. 2 将所得的粉碎物与95%乙醇(A. R.)按照体积比1 5 1 15混合，加 热，在80°C 90°C温度条件下回流1 2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物；步骤1. 3 将步骤1. 2所得的剩余物与95%乙醇(A. R.)按照体积比1 5 1 15 混合，加热，在80°C 90°C温度条件下回流1 2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物， 重复该步骤1 3次；步骤1. 4 合并步骤1. 2和1. 3所得的提取液； 步骤2 溶剂处理步骤2. 1 将步骤1所得的提取液加热，在55°C 65°C温度条件下加热减压浓缩，回收 乙醇并得到粘稠的初级浓缩物；步骤2.2 将步骤2. 1所得的初级浓缩物与水按照体积比1 8 1 10混合，在室 温条件下以60 120转/分的速度搅拌10分钟，随后静置6 12小时，弃去上清液得到 下层固体；步骤2. 3:将步骤2. 2所得的固体与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1 4 1 6混合， 在25°C 35°C温度条件下以60 120转/分的速度搅拌溶解，静置1 3小时，过滤得到 滤液和不溶物；步骤2. 4 将步骤2. 3所得的不溶物与乙酸乙酯(A. R.)按照体积比1 4 1 6混 合，在25°C 35°C温度条件下以60 120转/分的速度搅拌溶解，静置1 3小时，过滤得到滤液和不溶物，重复该步骤1 3次；步骤2. 5 合并步骤2. 3和2. 4所得的滤液；步骤2. 6 将步骤2. 5所得的滤液加热，在35°C 45°C温度条件下加热减压浓缩，回收 乙酸乙酯(A. R.)，得到固体浓缩物； 步骤3 树脂处理步骤3. 1 将步骤2所得的固体浓缩物与95%乙醇(A. R.)按照体积比1 4 1 6 混合溶解，得到溶液；步骤3. 2 将步骤3. 1所得的溶液缓慢加到7号树脂柱中，起观察树脂的颜色，在树脂 柱有2/3变色时，停止加样，并采用200ml 400ml的95%乙醇(A. R.)冲洗该树脂柱，收集 所有流出液，所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至PH值中性；步骤3. 3 将步骤3. 2所得流出液加热，并在55°C 65°C温度条件下加热减压回流，直 至溶剂干，得到固体残留物； 步骤4:重结晶步骤4. 1 将上述残留物与30°C 40°C的极性溶剂按照体积比1 4 1 6混合， 得到初级溶液，加热，在30°C的 40°C温度条件下减压浓缩，在_23°C -13°C温度条件下 静置析晶，过滤得到浅黄色针状结晶；所述极性溶剂为按照体积比1 1 1 2混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合 溶液；步骤4.2:将步骤4.1所得的结晶与极性溶剂按照体积比1 4 1 6混合， 在_23°C -13°C温度条件下反复重结晶2 4次，每次12 24小时，得到中间产物蓝萼 甲素；所述极性溶剂为按照体积比1 1 1 4混合的氯仿(A. R.)和丙酮(A. R.)的混合 溶液；步骤5 衍生化在室温下，将步骤4所得将蓝萼甲素溶于四氢呋喃(THF)中，随后加入丁二酸和4-二 甲氨基吡啶(DMAP)，搅拌反应，随后减压蒸去四氢呋喃，萃取得蓝萼甲素的丁二酸酯，随后 将其在二氯乙烷(EDC)条件下与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应得到作为中间产物的蓝萼 甲素的丁二酸酯与NHS的衍生物，在将该中间产物的THF溶液与多肽的磷酸盐缓冲液(PBS 缓冲液)混合，室温搅拌10 20分钟，随后减压蒸馏，过滤并合并滤液，将所得滤液冷冻干 燥，得到产物多肽类蓝萼甲素衍生物。
12.如权利要求11所述的多肽类蓝萼甲素衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤5 进一步包含以下步骤步骤5. 1 在室温下，将9. 06 11. 06g步骤4所得将蓝萼甲素溶于25 35ml四氢呋 喃(THF)中，随后加入0. 857 1. 057g 丁二酸和0. 067 0. 087g4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)， 在室温条件下搅拌反应2 3小时；步骤5. 2 将步骤5. 1的反应溶液加热30°C 40°C减压浓缩，除去THF，随后加入25 35ml水稀释，并采用25 35ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无 水硫酸钠干燥，随后将所得溶液加热至30°C 40°C减压浓缩至干，得到蓝萼甲素的丁二酸 酯的粗产品；步骤5.3 将蓝萼甲素的丁二酸酯的粗产品溶于洗脱液中，并采用硅胶柱层析分离，将 所得馏分加热至30°C 40°C减压浓缩，除去溶剂，得到蓝萼甲素的丁二酸酯的无色晶体；步骤5. 4 将所得蓝萼甲素的丁二酸酯溶于15 20ml四氢呋喃(THF)中，在室温下，加 入0. 5 0. 6g 二氯乙烷(EDC)和0. 2 0. 3gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌8 10 小时；步骤5. 5 将所得反应溶液在30°C 40°C条件下减压蒸馏，除去THF，随后采用15 20ml 二氯甲烷洗涤3次，再用饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤并将所得滤液 在30°C 40°C条件下减压蒸馏，除去溶剂，在室温条件下干燥，得蓝萼甲素的丁二酸酯与 NHS的衍生物的无色晶体；步骤5. 6 将196. 5 216. 5mg所得的蓝萼甲素的丁二酸酯与NHS的衍生物溶于2 4mlTHF 中，将 90. 6 110. 6mg 三肽 Arg-Gly-Asp-OH 溶于 4 6mlPBS 缓冲液； 所述三肽Arg-Gly-Asp-OH的分子式为C12H22N606 ；步骤5. 7 室温条件下，将所得的蓝萼甲素的丁二酸酯与NHS的衍生物的THF溶液滴加 到三肽的PBS溶液中，并在室温条件下搅拌反应10 20分钟，随后在30°C 40°C条件下 减压蒸馏除去THF，过滤得到滤液；步骤5. 8 将所得滤液采用1 3ml水洗涤2 4次，合并滤液并在_45°C _35°C条 件下冷冻干燥20 28小时，得到具有三肽取代基Arg-Gly-Asp-的蓝萼甲素衍生物。
13.如权利要求11所述的多肽类蓝萼甲素衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤5 进一步包含以下步骤步骤5. 1 在室温下，将9. 06 11. 06g步骤4所得将蓝萼甲素溶于25 35ml四氢呋 喃(THF)中，随后加入0. 857 1. 057g 丁二酸和0. 067 0. 087g4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)， 在室温条件下搅拌反应2 3小时；步骤5. 2 将步骤5. 1的反应溶液加热30°C 40°C减压浓缩，除去THF，随后加入25 35ml水稀释，并采用25 35ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无 水硫酸钠干燥，随后将所得溶液加热至30°C 40°C减压浓缩至干，得到蓝萼甲素的丁二酸 酯的粗产品；步骤5. 3:将蓝萼甲素的丁二酸酯的粗产品溶于洗脱液中，并采用硅胶柱层析分离，将 所得馏分加热至30°C 40°C减压浓缩，除去溶剂，得到蓝萼甲素的丁二酸酯的无色晶体；步骤5. 4 将所得蓝萼甲素的丁二酸酯溶于15 20ml四氢呋喃(THF)中，在室温下，加 入0. 5 0. 6g 二氯乙烷(EDC)和0. 2 0. 3gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌8 10 小时；步骤5. 5 将所得反应溶液在30°C 40°C条件下减压蒸馏，除去THF，随后采用15 20ml 二氯甲烷洗涤3次，再用饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤并将所得滤液 在30°C 40°C条件下减压蒸馏，除去溶剂，在室温条件下干燥，得蓝萼甲素的丁二酸酯与 NHS的衍生物的无色晶体；步骤5. 6 将196. 5 216. 5mg所得的蓝萼甲素的丁二酸酯与NHS的衍生物溶于0. 5 1. 5mlTHF 中，将 100. 1 120. Img 四肽 Arg-Gly-Asp-Val-OH 溶于 4 6mlPBS 缓冲液； 所述四肽 Arg-Gly-Asp-Val-OH 的分子式为 C17H31N707 ；步骤5. 7 室温条件下，将所得的蓝萼甲素的丁二酸酯与NHS的衍生物的THF溶液滴加到四肽的PBS溶液中，并在室温条件下搅拌反应10 20分钟，随后在30°C 40°C条件下 减压蒸馏除去THF，过滤得到滤液；步骤5. 8 将所得滤液采用1 3ml水洗涤2 4次，合并滤液并在_45°C _35°C条 件下冷冻干燥20 28小时，得到具有四肽取代基Arg-Gly-Asp-Val-的蓝萼甲素衍生物。
14.如权利要求11所述的多肽类蓝萼甲素衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤5 进一步包含以下步骤步骤5. 1 在室温下，将9. 06 11. 06g步骤4所得将蓝萼甲素溶于25 35ml四氢呋 喃(THF)中，随后加入0. 857 1. 057g 丁二酸和0. 067 0. 087g4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)， 在室温条件下搅拌反应2 3小时；步骤5. 2 将步骤5. 1的反应溶液加热30°C 40°C减压浓缩，除去THF，随后加入25 35ml水稀释，并采用25 35ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无 水硫酸钠干燥，随后将所得溶液加热至30°C 40°C减压浓缩至干，得到蓝萼甲素的丁二酸 酯的粗产品；步骤5. 3:将蓝萼甲素的丁二酸酯的粗产品溶于洗脱液中，并采用硅胶柱层析分离，将 所得馏分加热至30°C 40°C减压浓缩，除去溶剂，得到蓝萼甲素的丁二酸酯的无色晶体；步骤5. 4 将所得蓝萼甲素的丁二酸酯溶于15 20ml四氢呋喃(THF)中，在室温下，加 入0. 5 0. 6g 二氯乙烷(EDC)和0. 2 0. 3gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌8 10 小时；步骤5. 5 将所得反应溶液在30°C 40°C条件下减压蒸馏，除去THF，随后采用15 20ml 二氯甲烷洗涤3次，再用饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，过滤并将所得滤液 在30°C 40°C条件下减压蒸馏，除去溶剂，在室温条件下干燥，得蓝萼甲素的丁二酸酯与 NHS的衍生物的无色晶体；步骤5. 6 将196. 5 216. 5mg所得的蓝萼甲素的丁二酸酯与NHS的衍生物溶于0. 5 1. 5mlTHF 中，将 99. 7 119. 7mg 四肽 Arg-Gly-Asp-Ser-OH 溶于 4 6mlPBS 缓冲液； 所述四肽 Arg-Gly-Asp-Ser-OH 的分子式为 C15H27N708 ；步骤5. 7 室温条件下，将所得的蓝萼甲素的丁二酸酯与NHS的衍生物的THF溶液滴加 到四肽的PBS溶液中，并在室温条件下搅拌反应10 20分钟，随后在30°C 40°C条件下 减压蒸馏除去THF，过滤得到滤液；步骤5. 6 将步骤5. 5的滤液采用1 3ml水洗涤2 4次，合并滤液并 在-45°C -35°C条件下冷冻干燥20 28小时，得到具有四肽取代基Arg-Gly-Asp-Ser-的 蓝萼甲素衍生物。
15.如权利要求1 10所述的多肽类蓝萼甲素衍生物在治疗癌症中的应用，特别是在 治疗肝癌、胰腺胆管癌、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肺癌、肾癌、宫颈癌和结肠癌 中的应用。
全文摘要
本发明公开了多肽类蓝萼甲素衍生物的结构、制备方法及其在治疗癌症中的应用。所述多肽类蓝萼甲素衍生物的分子结构的通式如下其中，R1、R2为-OH或而R3为直链多肽取代基。本发明所公开的制备方法是在四氢呋喃和4-二甲氨基吡啶存在的条件下，将经提取处理后的蓝萼甲素与丁二酸反应，随后在四氢呋喃和二氯乙烷存在的条件下将得到的蓝萼甲素的丁二酸酯与N-羟基琥珀酰亚胺反应得到中间产物，最后在四氢呋喃和磷酸盐缓冲液存在的条件下，将所得中间产物与直链多肽进行衍生化反应，从而制备得到本发明所公开的多肽类蓝萼甲素衍生物。
文档编号C07K5/09GK101993473SQ20091005646
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月14日 优先权日2009年8月14日
发明者李云森, 程萍, 陈子珺, 雷启福 申请人:上海金昊药业开发有限公司