专利名称：蓝萼甲素在制备抗凝血药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蓝萼甲素的应用，特别涉及蓝萼甲素在制备抗凝血药物中的应用。
背景技术：
血栓可发生于循环系统的各个部位，如静脉、动脉、心腔和微循环，其是由纤维蛋白和血细胞组成的。在血栓形成过程中，血小板活化与凝血系统激活具有重要作用，两者在体内紧密联系，凝血系统激活后产生的凝血酶，是一个强有力的血小板活化因子，血小板活化后又将促进凝血过程。抗栓治疗主要针对凝血系统和血小板两个环节，分别称为抗凝治疗和抗血小板治疗。目前临床上最常使用的抗凝药物主要包括肝素类、香豆素类等，这些药物的临床价值已得到许多大型临床试验的证实而广泛应用于临床实践。蓝萼甲素(glaucocalyxin A)是从唇科香茶菜属植物香茶菜〔Isodonjaponica (Burrm F) Hara var glaucocalyx (Maxim) Hara〕中提取分离出的一个二職化合物。现代药理研究表明，蓝萼甲素可以通过抗血小板作用起到保护心肌作用，如可抑制卡西霉素刺激的兔血小板生成血小板活化因子，能抑制花生四烯酸诱导的兔血小板血栓素A2生成，并同时升高前列腺素E2，能显著抑制ADP、AA和PAF等诱导的兔血小板聚集，显著升高血小板内cAMP水平，能增加机体对86Rb的吸收，而且有改善微循环作用。但蓝萼甲素是否具有抗凝血作用，未见报道，本发明发现该药具有抗凝血活性。
发明内容
发明目的本发明提供蓝萼甲素的新的应用，即蓝萼甲素在制备抗凝血药物中的应用技术方案蓝萼甲素在制备抗凝血药物中的应用有益效果I、人体内凝血系统和抗凝系统处于一个动态平衡的状态，过度凝血会导致心肌梗死、脑血栓等严重疾病。血液凝固需要有内源性和外源性两条凝血途径同时参与。APTT和PT是临床凝血功能检测中最常用的两个参数。其中APTT主要用于检测机体的内源性凝血系统，其延长或缩短分别反映凝血因子II、V、VIII、X、XI和VII的血浆活性降低或增加。PT则检测机体的外源性凝血系统，其延长或缩短分别反映凝血因子I、II、V、VII和X的血浆活性降低或增加。本发明的研究结果显示，蓝萼甲素能显著延长小鼠毛细管凝血时间和尾尖出血时间，并显著延长小鼠TT、PT、APTT和PRT。蓝萼甲素在体外显著延长家兔TT、APTT和PRT。体内给药抗凝血实验结果表明，蓝萼甲素能显著延长小鼠APTT和PRT，提示其能通过干扰内源性凝血因子活性，使纤维蛋白的生成受到抑制，TT的显著延长，显示纤维蛋白原向纤维蛋白的转变受到了抑制。体内给药抗凝血实验结果还显示，蓝萼甲素也能显著延长PT时间，说明其对外源性凝血途径也有一定的抑制作用。蓝萼甲素的家兔体外抗凝血作用结果显示，蓝萼甲素能延长APTT、TT和PRT，但对PT无显著作用，表明蓝萼甲素在体外主要是通过抑制内源性凝血途径产生抗凝血作用的。
具体实施例方式I材料与仪器I. I药品与试剂蓝萼甲素(质量分数彡98%,HPLC)苏州利元医药科技有限公司提供，动物给药用
0.5% CMC-Na配制，体外实验用DMSO助溶，反应体系中DMSO终浓度为0. I %。阿司匹林肠溶片(批号H32026500)，南京白敬宇制药有限责任公司，动物给药用0.5% CMC-Na配制。肝素(150U/mg，批号091123)，南京图赛生物科技有限公司，用蒸馏水配制。凝血酶原时间(PT)试剂盒(编号YZB/沪0556-40-2009)、活化部分凝血激酶时间(APTT)试剂盒(编号YZB/沪0555-40-2009)和凝血酶时间(TT)试剂盒(编号YZB/沪0558-40-2009)，上海太 阳生物制品有限公司。I. 2 动物家兔，体重2. 5kg，南京市江宁区青龙山动物繁殖中心提供，实验动物生产许可证SCXK (苏)2007-0008 ； ICR小鼠，体重18 22g，扬州大学动物繁殖中心提供，实验动物生产许可证SCXK (苏)2007-0001。2 方法2. I对小鼠凝血时间(CT)的影响取雄性ICR小鼠，选基础生理凝血时间在40 160s者用于实验，根据基础凝血时间随机分为5组，每组10只，正常对照组按0. lml/10g灌胃生理盐水，其余各组均按等体积灌胃相应的药液，分别给蓝萼甲素低剂量4mg/kg、中剂量8mg/kg、高剂量16mg/kg和阿司匹林50mg/kg,每天给药I次,连续给药7d。小鼠于末次给药前禁食不禁水12h,于末次给药后Ih按毛细管法测小鼠凝血时间(末次给药后Ih,用长10cm、内径Imm的玻璃毛细管插入小鼠眼内眦后静脉丛中，深约4 5mm，轻轻转动，自血液注满开始计时，取出毛细管平放于桌上，每隔约15s折断一端约0. 5cm，并缓慢向左右拉开，观察折断处出现凝血丝所需时间)。2. 2对小鼠尾出血时间的影响雄性ICR小鼠50只，随机分为5组，每组10只，给药方法和剂量同2. I。各组动物禁食12h，然后分别给药I次。于灌胃后57 59min，将小鼠置于固定器中，使其尾部垂直，至灌胃后第60min，在尾尖处剪断鼠尾，每隔30s用滤纸轻吸尾尖血液，直至吸不出血液，记录断尾至出血停止时间间隔，即为出血时间。2. 3对小鼠凝血功能的影响2. 3. I对小鼠凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血激酶时间(APTT)的影响雄性ICR小鼠50只，随机分为5组，每组10只，给药方法和剂量同2. I。动物每天给药I次，连续给药7d。小鼠末次给药前禁食不禁水12h，于末次给药Ih后摘眼球取血，取血约0. 9ml，加入装有0. ImL 3. 8%枸橼酸钠抗凝剂的试管中，混匀，3000r/m离心15min，得贫血小板血衆(platelet poor plasma, PPP),置冰浴中备用。用凝固比池法测定TT、PT和APTT。2. 3. 2对血浆复钙时间(PRT)的影响
雄性ICR小鼠50只，随机分为5组，每组10只，给药方法、剂量、周期及取血方法同2. 3. I,血液与抗凝剂混勻后1000r/min离心IOmin,得富血小板血衆(platelet richplasma，PRP)，置冰浴中备用。酶标板置37°C水面上，每孔加入混合血浆IOOy L，温育lmin，迅速加入37°C预温0. 025mol/L氯化钙溶液100 y L立即混匀，加氯化钙时开动秒表，每隔IOs以钢丝轻轻向上挑动，至生成固体细丝即纤维蛋白终止计时，重复以上操作2次，自加钙至纤维蛋白形成的时间即为PRT[9]。2. 4蓝萼甲素对家兔体外凝血的影响2. 4. I蓝萼甲素对家兔体外凝血酶时间(TT)影响雄性家兔耳正中动脉取血3. 6mL，迅速加入装有0. 4mL 3. 8%枸橼酸钠的离心管中，混匀，3000r/min离心lOmin，得贫血小板血浆，置冰浴中备用。依试剂盒方法，酶标板置37°C水面上，每孔先加入待测血浆50 y L，再分别加入蓝萼甲素低、中、高浓度溶液(终浓度分别为0. 2、0. 4和0. 8mmol/L,用DMSO助溶)及肝素溶液(终浓度为50U/mL)各50 y L，混匀，温育lmin，迅速加入37°C预温的凝血酶溶液100 y L，立即混匀，加酶时开动秒表，4s后，每隔2s向上挑动，至生成固体细丝终止计时。重复以上操作3次，取平均值，即为凝血酶时间，另以等量终浓度为0. 1% DMSO代替待测样品为对照。2. 4. 2凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血激酶时间(APTT)的测定血浆制备及加药处理同2. 4. 1，依试剂盒说明书的方法，测定凝血酶原时间和活化部分凝血激酶时间。2. 4. 3血浆复钙时间(PRT)的测定取血及加抗凝剂方法同2. 4. I,血液与抗凝剂混勻后1000r/min离心IOmin,得富血小板血浆，置冰浴中备用。酶标板置37°C水面上，每孔加入混合血浆50 u L,分组及加药方法同2. 4. I，加药后混匀，温育lmin，迅速加入37°C预温0. 025mol/L氯化钙溶液100 y L立即混匀，加氯化钙时开动秒表，Imin后每隔IOs以钢丝轻轻向上挑动，至生成固体细丝即纤维蛋白终止计时，重复以上操作2次，自加钙至纤维蛋白形成的时间即为血浆复钙时间。2. 5统计学处理所有数据以均数土标准差(Mean土SD)表示，采用单向方差分析法(ANOVA)对实验数据进行统计分析，P < 0. 05为有统计学意义。3 结果3. I对小鼠凝血时间(CT)的影响结果见表1，与空白组比较，蓝萼甲素剂量依赖性延长小鼠凝血时间，在剂量为4、8和16mg/kg时均有显著性差异。与空白组比较,阿司匹林50mg/kg显著延长小鼠凝血时间。表I蓝萼甲素对小鼠凝血时间(CT)的影响(Mean土SD，n = 10)
权利要求
1.蓝萼甲素在制备抗凝血药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及蓝萼甲素的应用，特别涉及蓝萼甲素在制备抗凝血药物中的应用。蓝萼甲素能显著延长小鼠毛细管凝血时间和尾尖出血时间，并显著延长小鼠凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血激酶时间(APTT)和血浆复钙时间(PRT)。蓝萼甲素在体外显著延长家兔TT、APTT和PRT。体内给药抗凝血实验结果表明，蓝萼甲素能显著延长小鼠APTT和PRT，提示其能通过干扰内源性凝血因子活性，使纤维蛋白的生成受到抑制，TT的显著延长，显示纤维蛋白原向纤维蛋白的转变受到了抑制。体内给药抗凝血实验结果还显示，蓝萼甲素也能显著延长PT时间，说明其对外源性凝血途径也有一定的抑制作用。体外实验结果显示蓝萼甲素能延长APTT、TT和PRT，但对PT无显著作用，表明蓝萼甲素在体外主要是通过抑制内源性凝血途径产生抗凝血作用的。
文档编号A61P7/02GK102641259SQ20111004140
公开日2012年8月22日 申请日期2011年2月21日 优先权日2011年2月21日
发明者傅强, 张陆勇, 李伟光, 王晓虎, 王蕾, 马世平, 马占强 申请人:中国药科大学