专利名称：华法林抗凝血药物疗效检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体华法林 抗凝血药物疗效的试剂盒，通过检测华法林用药靶向位点CYP2C9基因和VKORCl基因多态 性位点来评估个体华法林抗凝血药物疗效。
背景技术：
华法林是目前应用最广泛的口服抗凝剂，在心脏瓣膜病、新房颤动、深静脉血栓等 心血管疾病的治疗中都有着广泛的应用，可减少血栓栓塞事件和降低病死率。但是华法林 有着严格的治疗窗。剂量过大导致出血，严重者将危及生命，剂量不足难以达到预期抗凝疗 效。同时华法林用药的个体差异很大，达到相同作用效果，高低剂量者相差10倍以上。因 此临床上如何合理使用华法林已经成为一个难题。已知有多种因素影响华法林的剂量，如年龄、性别、种族、体表面积、饮食等，但是 这些因素不足以完全解释华法林用药剂量的差异，随着分子生物学的发展，发现影响华法 林代谢和药效的基因的多态性可影响华法林的抗凝效果，从而为指导华法林的临床用药提 供新的依据。在中国人群中，已发现的最主要的变异位点是CYP2C9*3。在大多数CYP2C9底物药 的国人弱代谢者中，都发现了 CYP2C9*3/*3基因型。很多国内研究都证明，携带CYP2C9*3等 位基因的个体CYP2C9代谢活力和相关CYP2C9底物药物剂量需求有显著下降。Takanashi 等在体外观察了 CYP2C9*3突变对七种底物的代谢动力学特征的影响，发现CYP2C9的代谢 活性均显著降低，降低程度因药物而异。对华法林的代谢影响是降低了 S-华法林的代谢 而不是R-华法林的代谢。人体内试验表明CYP2C9*3纯合子个体的药物清除率显著低于 CYP2C9*1纯合子个体。CYP2C9*3(Ile359Leu)导致底物识别位点结构发生改变，从而降低 了酶的催化能力。研究表明，CYP2C9*3其纯合体是野生型活性的4 6%。中国人群中 CYP2C9*3频率较低，在Lee等人对145名中国人、85名马来西亚人和43名印度人的华法 林用药量的研究中，发现的突变，中国人和马来西亚人CYP2C9*3等位基因频率大约分别占 7%和9%，而在Joyce等人对69名香港人华法林代谢的研究中发现CYP2C9*3的突变其基 因频率约为2. 3%，明显低于高加索人中的频率。维生素K环氧化物还原酶(VKORC)是一个多蛋白复合体，参与维生素K循环使凝 血因子持续生成。目前国外学者已成功分离纯化出其中的一种亚基VK0RC1。VKORCl基因 位于16号染色体，含有3个外显子，编码163个氨基酸组成的蛋白。药理学研究结果表明， VKORC由VKORCl激活，VKORCl不但主导维生素K依赖性凝血因子的生成，而且是香豆素类 抗凝药物华法林的作用靶点。Yuan发现VKORCl启动子的多态性(-1639A/G)与华法林维持剂量有关。 VK0RC1-1639位A/G变异导致其启动子活性不同，G等位基因比A等位基因可使启动子增加 44%的活性，从而使VKORCl mRNA表达量不同。11例华法林敏感的中国患者(彡1. 5mg/d) 全为AA基因型，而华法林抵抗的5名中国患者为GA型或GG型。GG和GA基因型与AA基因型相比，GG和GA基因型由于其启动子活性高，VKORCl mRNA表达增加，VKORCl蛋白也相 应增加，引起VKORCl活性增高，从而凝血因子生成较多。由于VKORCl蛋白是华法林作用靶 点，所以所有华法林敏感者全是基因型为AA的纯合子，而华法林抵抗的个体其基因型为GA 或GG。Zhu等的研究中发现VKORCl的-1639位基因型为GG、GA、AA病人华法林的日维持 量(mg)分别为6. 7士3. 3、4. 3士2. 2、2. 7士 1.2。说明携带AA的基因型的患者和携带GA和 GG基因的患者相比，华法林的稳定维持量要低。Yin等的研究中，华法林的个体用药差异VKORCl的多态性所起的作用是CYP2C9的 基因突变效应的3倍。CYP2C9和VKORCl的多态性可以解释约56%的华法林个体用药差异。 而在zhu等的研究中上述两个等位基因再加上年龄、性别和体重解释约61%的华法林个体 用药差异。在Tham等研究中提供了 CYP2C9、VK0RC1(-1639A/G)不同基因型和年龄、体重的 组合，计算的华法林日维持剂量的公式。
发明内容
基于华法林用药靶向位点CYP2C9基因和VKORCl基因多态性可用来评估个体华法 林抗凝血药物疗效的基础上，本发明提供一种检测个体华法林抗凝血药物疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测华法林用药靶向位点CYP2C9基因和VKORCl基因多态性位点的特异性引物对 及特异性荧光探针对；荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离 子水等)。本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对 可用常规的探针合成技术进行合成。本发明试剂盒的组分和含量包括IOX荧光定量PCR反应缓冲液2 μ 1，25mM dNTP 混合液 0. 2 μ 1，25mM MgC12 溶液 1. 2μ 1，5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 05 μ 1，20 μ M特异性引物对每条引物各0. 225 μ 1，10 μ M特异性荧光探针对每条探针各0. 25 μ 1，去离子水 10. 65 μ 1。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例检测试剂盒的使用步骤1:DNA模板的抽取用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
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步骤2 荧光定量PCR反应使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行2次独立的荧光定量PCR反应，每次 反应的体系为总体积10 μ 1，包含浓度为20ng/μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX荧光定量PCR 反应缓冲液、0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mM MgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA聚合酶、20 μ M的有义引物和反义引物各0. 225 μ 1、10 μ M的带VIC荧光探针和带 FAM荧光探针各0. 25 μ 1，去离子水5. 325 μ 1。在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环 的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤4 基因型分析根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示 的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因 型。
权利要求
一种检测个体华法林抗凝血药物疗效的试剂盒，其特征在于包括检测华法林用药靶向位点CYP2C9基因和VKORC1基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括 IOX荧光定量PCR反应缓冲液2 μ 1，25mM dNTP 混合液 0. 2 μ 1，25mM MgCl2 溶液 1. 2 μ 1，5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 05 μ 1，，20 μ M特异性引物对每条引物各0. 225 μ 1，，10 μ M特异性荧光探针对每条探针各0. 25 μ 1，去离子水10. 65 μ I0本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明公开了一种检测个体华法林抗凝血药物疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测华法林用药靶向位点CYP2C9基因和VKORC1基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过检测华法林用药靶向位点CYP2C9基因和VKORC1基因多态性位点来评估个体华法林抗凝血药物疗效。
文档编号G01N21/64GK101928759SQ20091005395
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司