专利名称：适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒。
背景技术：
华法林是临床最常用和应用最广泛的有效ロ服抗凝药物，但是由于治疗窗ロ窄， 治疗剂量个体间差异显著，不同个体的有效治疗药物剂量间可存在十倍以上的差异，剂量过高有严重出血副作用发生的可能，而剂量不足又会导致抗凝不足血栓栓塞发生的危险， 因此华法林抗凝治疗的个体化问题一直是临床工作中的重点和难点。近年来，越来越多的证据表明，除了临床环境因素(如年齢，体重，饮食中维生素K的摄取，抗凝适应症，合并用药等)以外，基因组的遗传变异很大程度上影响了华法林的抗凝效果。对华法林的药物基因组学研究发现，其代谢相关基因(CYP2C9)和作用靶基因(VKORCl)在华法林的疗效和毒副作用方面起着关键性的作用，其中的基因变异型 CYP2C9*3(p. I359L)及VK0RC1*2 (tagSNP :_1639G>A)已经在多个种族中(包括中国人群) 被证实与华法林剂量个体间的差异密切相关，依据这两个基因变异型，并结合临床和环境因素，能使约50%的华法林剂量个体间差异得到合理的解释。据此，2007年8月，美国食品与卫生管理局(FDA)在华法林使用说明中，増加了对于携帯CYP2C9*3和VKORCl (-1639G > A)变异型的患者需要较低的华法林起始治疗剂量的预警；并于2010年提出了对于携帯 CYP2C9和VKORCl变异型的患者所需起始治疗剂量的建议案。由于VKORCl和CYP2C9的遗传多态性能在很大程度上解释华法林剂量的个体间差异，因此，通过结合药物基因组学信息和临床环境相关因素(如年齢、性別、体重、身高、 合并治疗的药物和治疗的效果)建立的华法林剂量运算预测模型，能够用来更准确的估计华法林的剂量，降低治疗引导阶段华法林过量的风险，并缩短华法林达到稳定治疗的时间。随着华法林药物基因组学研究的不断深入，越来越多的整合了临床和药物基因组学相关因素的多元回归预测模型被建立，并用于评估和预测患者的华法林抗凝治疗剂量，同时在国际上还开展了大规模的回顾性和前瞻性的临床研究用于对上述模型临床应用的实用价值的检验。在众多问世的预测模型中，2009年发表的国际华法林药物基因组学协会 (International Warfarin Pharmacogenetics Consortium, IWPC)塞于世界各中心小同禾中族(包括来自台湾的中国人群)的4，043例华法林抗凝治疗患者的临床和遗传因素而建立的药物基因组学预测模型最具有代表性。该研究发现，药物基因组学模型(整合了临床和基因型相关因素)的预测治疗剂量，比固定治疗剂量(5mg/day)或者基于临床模型(仅仅包含临床相关因素)预测获得的剂量更接近患者的实际华法林治疗剂量，上述优势主要体现在华法林所需剂量偏高(> 49mg/week)或偏低(く 21mg/week)的患者，这些患者占所有受试人群的46. 2%。尽管如此，目前已发表的华法林药物基因组学剂量预测模型大部分是基于多种族人群或者是西方人群建立的，尽管种族差异所致的剂量差异能够通过预测模型中的基因变异型体现出来，例如与华法林低剂量相关的基因变异型VKORCl (-1639A)在亚洲人群中的发生频率(约为87%)远高于西方人群(约为36%)，但是在模型中需要整合的临床环境因素在不同种族人群中则各不相同，另外利用已发表的基于多种族或者西方人群的药物基因组学模型计算所得的预测剂量往往高于中国人群的实际所需剂量。鉴于此，有必要整合与中国人群华法林剂量个体差异相关的主要临床环境因素和基因变异型，建立基于中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒，检测与华法林抗凝敏感性密切相关的基因变异型，并利用本发明建立的华法林药物基因组学剂量预测模型，计算患者的华法林抗凝治疗剂量。进而为中国人群的华法林个体化抗凝治疗提供药物基因组学參考指标。本发明所述的适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒主要包含CYP2C9、VKORCl和CYP4F2相关基因型的扩增引物，CYP2C9、VKORCl和CYP4F2相关基因型的测序引物，PCR反应试剂，测序试剂。本发明所述的试剂盒还包含用以说明适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的说明书或/和记录有中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的计算机可读存储介质。根据本发明所述的试剂盒，所述适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型为每日华法林稳定治疗剂量(毫克/日)=2. 757-0. 013Xage-O. 515Xtarget INR-1. 175 X Ln (INR on day 4)+0. 996XBSA-2. 382XCYP2C9*3/*3_0. 679XCYP2C9*l/*3+ 0. 536 X VKORCl-1639AG+2. 080XVK0RC1-1639GG+0. 658 X CYP4F2rs2108622TT模型中的參数赋值说明为Age 年龄Target INR 目标国际标准化比值，如果INR的目标范围是1. 6-2. 5，则为1 ；如果 INR的目标范围是2-3，则为0INR on day 4 开始服用华法林第4日的INR值BSA:体表面积CYP2C9*3/*3 如果是该变异型携帯者，则为1 ；否则为0 ；CYP2C9*l/*3 如果是该变异型携帯者，则为1 ；否则为0 ；VK0RC1-1639AG 如果是该变异型携帯者，则为1 ；否则为0 ；VK0RC1-1639GG 如果是该变异型携帯者，则为1 ；否则为0 ；CYP4F2rs2108622TT 如果是该变异型携带者，则为1 ；否则为0。优选地，所述CYP2C9相关基因型的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1~2所示。所述VKORCl相关基因型的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :3_4所示。所述CYP4F2 相关基因型的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :5-6所示。优选地，所述CYP2C9相关基因型的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示。所述VKORCl相关基因型测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示。所述CYP4F2相关基因型测序引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。优选地，所述PCR反应试剂采用HotStarTaq Master Mix Kit，所述测序试剂采用 BigDye Terminator v3. ICycle Sequencing Kit。本领域的技术人员根据他所掌握的技术知识，还可以采用任何的其它合适的PCR反应试剂和测序试剂。本发明的适合中国人群华法林药物基因组学检测试剂盒，制备简单、使用方便；采用该试剂盒通过检测华法林药物基因组学指标，整合临床环境因素，利用本发明建立的适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型，能够准确的估计中国患者人群的华法林抗凝治疗剂量。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
图1是CYP2C9的相关基因分型图；图2是VKORCl的相关基因分型图；图3是CYP4F2的相关基因分型图。
具体实施例方式实施例1 中国人群中华法林治疗病例的收集及全血DNA的采集1.华法林稳定治疗病例的收集和分组收集经华法林稳定抗凝治疗至少三个月的中国人群患者，排除年龄小于18岁的患者，以及确诊为癌症，肝肾功能不全，或者充血性心力衰竭的患者。2.收集与华法林治疗和剂量相关的临床资料，包括患者的基本临床信息(年齢， 性別，身高，体重等)，与华法林剂量和副作用相关的病史，华法林治疗指征，目标凝血酶原国际标准化比率(PT-INR)值，以及与华法林发生交互作用的合并用药情况等。当INR达到稳定值至少3个月吋，记录华法林稳定治疗时的毎日平均剂量。具体请详见表1。表1用于建立和验证华法林剂量预测模型的中国患者人群的临床特征CN 102534001 A
模型建立组 (n=207)模型验证组 (η=103)P值华法林稳定治疗剂量(毫克/ 曰)*2.96 士 1.092.87± 1.10<0.01年龄*57.10±16.2756.13 ± 14.96<0.01男性(女性)f112 (54)47 (46)<0.01体表面积(m2)*1.85 ±0.201.85 ±0.23<0.01应用华法林的治疗指征f房颤86 (42)42 (41)<0.01深部静脉血栓和肺栓塞36(17)19 (19)<0.01心脏瓣膜置換92 (44)49 (48)<0.01心肌病4⑵3(3)<0.01其他指征15(2)4(4)<0.01目标INRす1.6-2.5172 (83)82 (80)<0.012.0-3.035 (17)21 (20)<0.01合并应用与华法林交互作用药物的情况す未应用有交互作用的药物134(65)49 (48)<0.01应用使华法林作用降低的药00物§应用使华法林作用增强的药73 (35)54 (52)<0.01物1合并疾病和不良嗜好す吸烟史40 (19)18(17)<0.01饮酒史30(15)14 (14)<0.01卨血压72 (35)36 (35)<0.01缺血性脑卒中/短暂脑缺血发27 (13)10(10)<0.01作2型糖尿病26 (13)13 (13)<0.01基因型分布すVKORCl -1639G/AGG3(1)0<0.01GA30(15)12(12)<0.01AA174(84)90(87)<0.01CYP2C9*!/*!182(88)88(85)<0.0122(11)14(14)<0.01*3/*33(1)1(1)<0.01CYP4F2 rs2108622CC119(58)53(52)<0.01CT78(38)43(42)<0.01TT10(5)7(7)<0.01 *数值表示为平均值士标准差。t数值表示为)。$包括心脏栓塞，心肌梗死， 外周动脉疾病，除房颤外的心律失常。§包括苯妥英，卡马西平，利福平，氟康唑。1包括胺碘酮，氯吡格雷，噻氯匹定，阿司匹林，洛伐他汀等。INR为国际标准化比值。3.采集每例患者外周EDTA抗凝全血3毫升，按照DNA提取试剂盒说明，提取每例基因组DNA约50-150毫克。实施例2 利用Sanger测序法检测基因变异型在待测基因变异型所在位点的核苷酸序列片段两端设计合成引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增该片段，然后应用Sanger测序法对该片段进行测序分析，通过与參考序列对比，寻找待测位点的基因变异型。1.设计合成弓丨物，以扩增变异型CYP2C9*3，VKORCl (-1639G > Α)和 CYP4F2 (rs2108622)所在目标基因片段的位点和周围已知的DNA序列。扩增引物CYP2C9*3 (303bp)上游引物5 ‘ -CCCCTGAATTGCTACAACAAA-3 ‘ (SEQ下游引物5'-GGGACTTCGAAAACATGGAG-3 ‘ (SEQVKORCl(-1639G > A) (290bp)上游引物5‘ -GCCAGCAGGAGAGGGAAATA-3 ‘ (SEQ下游引物5'-AGTTTGGACTACAGGTGCCT-3 ‘ (SEQCYP4F2(rs2108622)(238bp)上游引物5‘ -GTCATCCCCAAAGGTGCTCAC-3 ‘ (SEQ下游引物5'-TCAAAACCCTGCCCCCTCCT-3 ‘ (SEQ2.通过PCR扩增上述目标片段，反应体系和条件为PCR反应体系
DNA (50 ng/ul)1 ul
PCR 引物(IOuM)0.3ul/0.3 ul (上游/下游)
HotStarTaq Master Mix 7.5 ul 双蒸水5.9 ul
总计15 ulHotStarTaq Master Mix Kit :QIAGEN，美国PCR反应条件95°C/15min^(94oC/30sec^58°C/40sec -^72°C/30sec )X30 ^72°C/lmin
^4°C/oo3. PCR产物的纯化使用MultiScreen PCR 96-ffell Plate(Millipore)对 PCR 产物进行纯化。4.应用ABI3730自动序列分析仪，对PCR扩增产物片段进行测序分析。分别应用自动和人工序列分析软件，对测得序列中出现的目标变异型进行筛选。测序引物依次分别为SEQ ID NO :7_9
ID NO 1) ID NO 2)
ID NO 3) ID NO 4)
ID NO 5) ID NO 6)
CYP2C9*3 5' -CCCCAAACTGGAAACAAGAGA-3‘VKORCl(-1639G > A) 5' -GCCAGCAGGAGAGGGAAATA-3‘CYP4F2(rs2108622) 5' -CTCACGGGGAGGAGTCT-3‘测序分析的反应体系为
纯化的PCR产物2ul测序引物(5uM)Iul1/20 BigDye2ul双蒸水5ul测序反应条件为
96°C/2min^(96°C/10sec -^50°C/10sec -^60°C/3minl0sec )X30^4°C/oo5.应用SNPalyze V4. 0软件(DYNACOM，Kanagawa，日本)，对上述候选基因变异型进行最小等位基因频率、杂和性、哈迪-温伯格平衡和连锁不平衡等遗传特性的分析。实施例3 试剂盒的制备及使用方法1.试剂盒的成分本试剂盒的主要成分是实施例2所述的扩增引物和测序引物、PCR反应试剂 HotStarTaq Master Mix:BigDye Terminator v3. ICycle Sequencing Kit，还可以包含用以说明适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的说明书或/ 和记录有中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的计算机可读存储介质。2.试剂盒的储存条件试剂盒内干粉状引物可常温保存2个月，-20°C可长期保存。干粉状引物溶解后可在_20°C稳定保存6个月，短时间内经常使用吋，可以在室温下保存120小吋。HotStarTaq Master Mix Kit_20°C可保存一年，BigDye Terminator v3. ICycle Sequencing Kit 保存在-15to-25°C，可以分装，避免反复冻融(少于5至10次)，室温下融解。3.试剂盒的使用方法需要从患者的抗凝血液标本(约Iml)中提取基因组DNA，用于该试剂盒PCR扩增反应的DNA模板。1)引物的溶解在使用本试剂盒之前，需要先用无菌去离子双蒸水稀释引物，并分装后置-20°C保存。2)根据不同基因变异型的检测位点，选择试剂盒中相应的Taq酶混合物和相应的 PCR反应体系，常规进行PCR反应。PCR反应体系和反应条件PCR反应体系
DNA (50 ng/ul) PCR 引物(IOuM) HotStarTaq Master Mix
双蒸水
总计
1 ul
0.3ul/0.3 ul (上游/下游) 7.5 ul 5.9 ul
15 ulHotStarTaq Master Mix Kit :QIAGEN，美国PCR反应条件95°C/15min^(94oC/30sec^58oC/40sec^72°C/30sec )X30 ^72°C/lmin
—4°C/oo3)对PCR的扩增产物进行纯化，并应用自动序列分析仪，对PCR扩增产物片段进行基于Sanger法的测序分析。测序反应体系和反应条件(应用于ABI3730自动序列分析仪)测序分析的反应体系
纯化的PCR产物2ul测序引物(5uM)Iul1/20 BigDye2ul双蒸水5ul
测序反应条件
96°C/2min 4(96°C/10sec—50°C/10sec—60°C/3minl0sec )X30—4°C/oo4.检测结果的解释结果判定方法通过将测序结果峰图对应的核苷酸序列与NCBI的基因參考序列进行比对，查找待测位点对应的核苷酸序列是否发生了基因变异，进而判断待测位点基因变异型的存在与否。根据携带基因变异型的情况，结合临床环境因素和药物基因组学剂量预测模型，进而判断受试者对华法林抗凝治疗的敏感性和预测稳定治疗剂量。5.试剂盒的性能1)灵敏度使用人类组织細胞样品提取的基因组DNA IOOng可以成功进行PCR扩增和测序检测。通过设置阳性和阴性对照，实现变异型灵敏度的检测。2)重复性该试剂盒的试剂、反应体系和反应条件可重复应用于目前在市场上广泛使用的各种PCR扩增仪(例如美国应用生物系统公司、日本Takara公司、美国的 Bio-Rad公司的PCR仪等)和测序仪(例如美国应用生物系统公司的各型DNA测序仪)。3)稳定性在试剂盒内的干粉状引物没有溶解吋，可以常温保存2个月，在-20°C 可以稳定保存一年。在干粉状引物溶解后(IOOuM)应该分装成小份并在-20°C可以稳定保存6个月，短时间内经常使用吋，可以在室温(15°C到30°C)保存120小吋。PCR扩增相关混合试剂，PCR产物纯化试剂，测序相关试剂一般在-20°C可稳定保存12-18个月。实施例4 与华法林剂量相关的基因变异型在中国患者人群中的基因分型及与华法林剂量的相关性分析1.利用单变量分析方法，分別在两组患者中，对候选基因变异型CYP2C9*3和 VK0RC1*2(-1639G > Α)与每日华法林稳定治疗剂量的相关性进行分析。2.利用共变量分析方法，分別在两组患者中，通过对和华法林剂量相关的临床因素(包括性別，年齢，体重，目标INR，治疗指征，药物交互作用等)进行校准后，对候选基因变异型CYP2C9*3和VK0RC1*2 (-1639G > Α)与毎日华法林稳定治疗剂量的相关性进行分折。具体请详见表2。表2基因变异型与中国患者人群的华法林剂量相关性
权利要求
1.一种适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒，其特征在干，包含CYP2C9、VKORCl和CYP4F2相关基因型的扩增引物，CYP2C9、VKORCl和CYP4F2相关基因型的测序引物，PCR反应试剂，测序试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包含用以说明适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的说明书或/和记录有中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的计算机可读存储介质。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在干，所述适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型为每日华法林稳定治疗剂量(毫克/日)=2. 757-0. 013 Xage-O. 515 X target INR-1. 175 X Ln (INR on day 4)+0. 996XBSA-2. 382XCYP2C9*3/*3_0. 679XCYP2C9*l/*3+ 0. 536XVK0RC1-1639AG+2. 080XVK0RC1-1639GG+0. 658 X CYP4F2rs2108622TT 模型中的參数赋值说明为 Age 年龄Target INR 目标国际标准化比值，如果INR的目标范围是1. 6-2. 5，则为1 ；如果INR 的目标范围是2-3，则为0INR on day 4 开始服用华法林第4日的INR值 BSA 体表面积CYP2C9*3/*3 如果是该变异型携帯者，则为1 ；否则为0 ； CYP2C9*l/*3 如果是该变异型携帯者，则为1 ；否则为0 ； VK0RC1-1639AG 如果是该变异型携帯者，则为1 ；否则为0 ； VK0RC1-1639GG 如果是该变异型携帯者，则为1 ；否则为0 ； CYP4F2rs2108622TT 如果是该变异型携带者，则为1 ；否则为0。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在干，所述CYP2C9相关基因型的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :1-2所示。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在干，所述VKORCl相关基因型的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :3-4所示。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在干，所述CYP4F2相关基因型的扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 5-6所示。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在干，所述CYP2C9相关基因型的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 7所示。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在干，所述VKORCl相关基因型的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所示。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在干，所述CYP4F2相关基因型的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 9所示。
10.根据权利要求1-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂采用 HotStarTaq Master Mix Kit，所述测序试剂采用BigDye Terminator v3. ICycle Sequencing Kit。
全文摘要
本发明提供一种适合中国人群华法林个体化抗凝的药物基因组学检测试剂盒，其主要包含CYP2C9、VKORC1和CYP4F2相关基因型的扩增引物，CYP2C9、VKORC1和CYP4F2相关基因型的测序引物，PCR反应试剂，测序试剂。还可以包含用以说明适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的说明书或/和记录有中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型的计算机可读存储介质。本发明的华法林药物基因组学检测试剂盒，制备简单、使用方便；采用该试剂盒，通过检测华法林药物基因组学指标，整合临床环境因素，利用本发明建立的适合中国人群的华法林药物基因组学剂量预测模型软件，能够准确的估计中国患者人群的华法林抗凝治疗剂量。
文档编号C12Q1/68GK102534001SQ20121000399
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者尹彤, 许强 申请人:尹彤