专利名称：一种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG标记的方法
技术领域：
本发明涉及酿酒酵母中Rav2p基因的改造与修饰，属于分子生物学相关领域。
背景技术：
V-ATP酶(VacuolarATPase)是一种普遍存在于真核生物的内膜系统的蛋白质大分子，其可以水解ATP来转移质子，维持细胞的正常生理环境。V-ATP酶在细胞内通过质子的运输，使细胞器的PH平衡，进而对生物学过程例如细胞膜运输、蛋白质降解、小分子的偶联运输起重要作用。V-ATP酶由两大结构功能部分共14种亚基组成:一部分是水溶性的V1,由8种亚基组成，主要功能是水解ATP ;另一部分是嵌于膜中的Vtl,由6种亚基组成，主要功能是转移质子。这两大部分之间形成一种柄状结构从而使得这两部分从功能和结构上成为一个整体。V-ATP酶在萄糖浓度降低时可以可逆分解为VdPV1两部分来调节酶的活性，RAVE:(reg μ lator of theH+_ATPase of vacuolar and endosomal membranes)在 V-ATP 酶这种活性调节方式中起很重要的作用。RAVE复合物由SkpIp、RavIp和Rav2p三个亚基组成。目前有关RAVE以及RAVE对V-ATP酶活性调节机理的研究很少，但是有研究发现RAVE通过与V-ATP酶V1部分的E亚基和G亚基作用从而调节V-ATP酶的活性。V-ATP酶的活性高低直接影响了细胞对酸性环境耐受性的强弱，利用本发明人构建的线性DNA可以实现对Rav2p的基因改造与修饰，或者对在酿酒酵母细胞内Rav2p基因的敲除，从而构建Rav2p基因缺陷型酿酒酵母。这种缺陷型酿酒酵母由于Rav2p的合成能力缺失，RAVE对V-ATP酶的调节机制也被破坏，所以这种缺陷型酿酒酵母对高压二氧化碳敏感，在食品加工过程中具有实际应用价值
发明内容
本发明的目的在于提供一种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C未端上快速添加FLAG标记的方法。该方法经济有效、方便快捷，不需要设计酶切位点和构建质粒。本发明提供了一种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG标记的方法，其特征在于使该菌蛋白Rav2p C末端上带有FLAG标记，并插入抗生素G418抗性基因KanMX6。一种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG标记的方法，其步骤如下:A、提取酿酒酵母BY4742和酿酒酵母SF838-5A RAVl-Myc13的基因组:(I)从YPD固体培养基上挑取酿酒酵母BY4742单菌落，接种于5ml的YPD液体培养基；从YPD固体培养基上挑取SF838-5A RAVl-Myc13单菌落，接种于5ml的YPD液体培养基，培养过夜；(2)用500 μ I的山梨醇缓冲液悬浮酿酒酵母，加入40μ lU000U/ml的Iyticase和I μ I β -巯基乙醇，混匀后37°C孵育3h，破坏细胞壁；
(3)蛋白酶k和RNase去除组蛋白和RNA ；(4)使用平衡酚和氯仿:异戊醇(24: I)分别萃取，离心去除蛋白、多糖等有机质，重复一次；(5)取上层水相，加入2倍体积无水乙醇，-20°C放置lh，12000r/min离心IOmin ；(6)弃上清并置于超净台吹干，加入50 μ I ddH20溶解DNA。B、克隆同源左、右臂和KanMX6:(I)以酿酒酵母BY4742基因组为模板，通过引物Rfkanpl、Rfkanp2和Rfkanp5、Rfkanp6来分别扩增同源左、右臂；(2)以酿酒酵母SF838-5A RAVl_Mycl3的基因组为模板，通过引物Rfkanp3和Rfkanp4 来扩增 KanMX6。C、融合同源左、右臂和KanMX6这三个片段:以同源左、右臂和KanMX6为模板,通过引物Rfkanpl、Rfkanp6来融合这三个片段，形成一条完整的DNA片段。D、制作酿酒酵母BY4742感受态: (I)从YPD固体培养基上挑取酿酒酵母BY4742单菌落，接种于30ml的YPD液体培养基；(2)离心收集细胞，用无菌水洗涤一次；(3)用0.1M LiAc处理细胞并分装。E、将融合产物导入感受态细胞:(I)将分装的感受态细胞离心收集；(2)加入 PEG4000、LiAc、SS-DNA、融合产物等；(3)热激发将融合产物导入感受态细胞；(4)加入新鲜的YPD培养基进行预培养；(5)涂布F、验证融合产物是否整合进酿酒酵母BY4742的基因组中:(I)在同源左右片段的上、下游50bp附近设计验证引物Y1、Y2 ；YI:GAACTTACGCTTTGTAGGAATGAGC ；Υ2:AATGAGCCAAGCACGAACCTTGC ；(2)提取重组菌基因组；(3)以重组菌株基因组为模板，通过引物Y1、Y2来扩增融合产物，根据PCR的大小可以判断融合产物有没有整合到酿酒酵母的基因组上。本发明的优点:本发明利用融合PCR技术连接三个片段，不需要设计酶切位点和保护碱基，省去了酶切和连接的步骤。相比传统的方法更加方便快捷，更加经济有效；本发明不需要构建穿梭质粒，将融合的PCR产物导入酿酒酵母就可进行同源重组，省去了对质粒的酶切和连接等步骤；本发明将抗生素G418抗性基因KanMX6插入在同源左、右臂之间，待融合产物导入酿酒酵母进行同源重组 后，抗生素G418抗性基因KanMX6便整合到了酿酒酵母的基因组上，使原本对抗生素G418敏感的酿酒酵母BY4742具有了抗性，以便对重组菌株的筛选。
图1:1为同源左臂400bp ;2为同源右臂400bp ;3_6为KanMX61741bp ;M为DNA分
子量标准；图2:1为融合产物25IObp ；M为DNA分子量标准；图3: 1-10为验证的PCR产物2656bp ；M为DNA分子量标准。
具体实施例方式实施例1:—种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG标记的方法，其步骤如下:从NCBI上查找Rav2p的基因序列，Genebank序列号为NC 001136。A、提取酿酒酵母BY4742和酿酒酵母SF838-5A RAVl-Myc13的基因组:(I)从YPD固体培养基上挑取酿酒酵母BY4742单菌落，接种于5ml的YPD液体培养基；从YPD固体培养基上挑取酿酒酵母SF838-5A RAVl-Myc13单菌落，接种于5ml的YPD液体培养基，30 0C 200rpm培养至OD ^ 3 ;(2)用500 μ I的山梨醇缓冲液悬浮酿酒酵母，加入40μ lU000U/ml的Iyticase和I μ I β -巯基乙醇，混匀后37°C孵育3h，破坏细胞壁；(3) 8000r pm lmin离心弃上清(加速要慢)，加500 μ ITE缓冲液(ph8.0),混勻后加 50 μ 1、10% SDS，加入 10μ l、200mg/ml 蛋白酶 k，再加入 10μ lU0g/ml RNase，37°C孵育Ih蛋白酶k和RNase去除组蛋白和RNA ；(4)加入500 μ I平衡酹,颠倒混勻、静置5min, 8000r/min离心lmin,移取上层加Λ 250 μ I平衡酚和250 μ I氯仿:异戊醇(24: I)颠倒混匀、静置5min，加500 μ I氯仿，颠倒混勻、静置5min,8000r/min离心lmin,取上层水相；(5)取上层水相，加入2倍体积无水乙醇，_20°C放置lh，12000r/min离心IOmin ；(6)弃上清并置于超净台吹干，加入50 μ I ddH20溶解DNA。B、克隆同源左、右臂和KanMX6:(I)设计Rav2p基因终止密码子前400bp片段的一对引物Rfkanpl和Rfkanp2,把这段片段命名为同源左臂，其中Rfkanp2后半部分为FLAG标记的基因序列；Rfkanpl:5’ -GGTGACTAAAAAACCTTGG-3’ ；R f k a η P 2:5，- cttgtcatcgtcgtccttgtagtcC TTATATGTACTTAACTGTTTGCTA-3’ (FLAG)；以酿酒酵母BY4742基因组为模板，通过引物Rfkanpl、Rfkanp2和Rfkanp5、Rfkanp6来分别扩增同源左、右臂。在36 μ I ddH20中分别添加5μ I IOXPfu Buffer、5 μ I 2.0mM dNTP> I μ I 0.1uM RfkanpK I μ 10.1uM Rfkanp2> I μ I Pfu DNA Polymerase,共5(^1体系。在951:下预变性51^11，然后在941: lmin——53°C lmin——72°C lmin循环 30 次，最后 72°C IOmin ；(2)设计Rav2p基因下游400bp片段的一对引物Rfkanp5和Rfkanp6,把这段片段命名为同源右臂；Rfkanp5:5’ -TCTACTAGCGATAACATTAACA-3，；Rfkanp6:5’ -ATTAGATTTGATTGAAGAG-3，；
在36μ1 ddH20 中分别添加 5μ I IOXPfu Buffer, 5 μ I 2.0mM dNTPU μ I 0.1uMRfkanp5> I μ I 0.luMRfkanp6、I μ I Pfu DNA Polymerase,共 50 μ I 体系。在 95°C下预变性 5min，然后在 94°C lmin-53°C lmin-72°C lmin 循环 30 次，最后 72°C lOmmin。(3)设计 KanMX6 基因的引物 Rfkanp3 和 Rfkanp4_3’ ；Rfkanp3:5’ -gactacaaggacgacgatgacaagTAGTGAATTCGCGCCACTTC_3’ (FLAG)；Rfkanp4:5，-TGTTAATGTTATCGCTAGTAGAGAATTCGAGCTCGTTTAAA-3，；以酿酒酵母SF838-5A RAVl_Mycl3的基因组为模板，通过引物Rfkanp3和Rfkanp4来扩增 KanMX60 在 36 μ I ddH20 中分别添加 5 μ I IOXPfu Buffer,5 μ I 2.0mM dNTP、l μ I
0.1uM Rfkanp3> I μ I 0.1uM Rfkanp4> I μ I Pfu DNA Polymerase,共 50 μ I 体系。在 95°C下预变性 5min，然后在 94°C lmin——53°C lmin——72°C 3min 循环 30 次，最后 72°C lOmin。C、融合同源左、右臂和KanMX6这三个片段:以同源左、右臂和KanMX6为模板,通过引物Rfkanpl、Rfkanp6来融合这三个片段，形成一条完整的DNA片段。将扩增的同源左、右臂和KanMX6PCR产物用上海生物工程的PCR产物纯化试剂盒进行纯化后作为模板按下表进行配制:
权利要求
1.一种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG标记的方法，其特征在于使该菌蛋白Rav2pC末端上带有FLAG标记，并插入抗生素G418抗性基因KanMX6。
2.按照权利要求1所述，其特征在于使酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上带有FLAG标记的方法包括如下步骤: A.设计Rav2p基因终止密码子前400bp片段的一对引物Rfkanpl和Rfkanp2，把这段片段命名为同源左臂，其中Rfkanp2后半部分为FLAG标记的基因序列；Rfkanpl: GGTGACTAAAAAACCTTGG ；Rfkanp2:cttgtcatcgtcgtccttgtagtcCTTATATGTACTTAACTGTTTGCTA (FLAG)； B.设计Rav2p基因下游400bp片段的一对引物Rfkanp5和Rfkanp6，把这段片段命名为同源右臂；Rfkanp5:TCTACTAGCGATAACATTAACA ；Rfkanp6:ATTAGATTTGATTGAAGAG ； C.以酿酒酵母基因组为 模板，通过引物Rfkanpl和Rfkanp2扩增同源左臂； D.以酿酒酵母基因组为模板，通过引物Rfkanp5和Rfkanp6扩增同源右臂。
3.按照权利要求1所述，其特征在于使酿酒酵母含有抗生素G418抗性基因KanMX6的方法包括如下步骤: A.设计KanMX6基因的引物Rfkanp3和Rfkanp4；Rfkanp3:gactacaaggacgacgatgacaagTAGTGAATTCGCGCCACTTC (FLAG)；Rfkanp4:TGTTAATGTTATCGCTAGTAGAGAATTCGAGCTCGTTTAAA ； B.以含有KanMX6基因的酿酒酵母SF838-5ARAVl_Mycl3基因组为模板，通过引物Rfkanp3 和 Rfkanp4 扩增 KanMX6 基因； C.利用融合PCR技术连接同源左臂、抗生素G418抗性基因KanMX6、同源右臂； D.将连接的DNA片段导入酿酒酵母，接种于含有G418的培养基培养，挑选阳性克隆。
全文摘要
一种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG标记的方法，涉及酿酒酵母中Rav2p基因的改造与修饰，属于分子生物学相关领域。本发明提供了一种在酿酒酵母蛋白Rav2p的C末端上快速添加FLAG标记，其特征在于使该菌蛋白Rav2p的C末端上带有FLAG标记，并插入抗生素G418抗性基因KanMX6，有利于重组菌的筛选。利用本发明人构建的线性DNA，实现对Rav2p的基因改造与修饰，从而构建Rav2p的C末端上含有FLAG标记的酿酒酵母重组菌。
文档编号C12N15/62GK103194469SQ20121000395
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者张震宇, 顾春银, 李忠浩, 杨冬美 申请人:江南大学