专利名称：嗜肺军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因芯片及包含该芯片的检测用试剂盒，尤其是涉及水体重要致病菌嗜肺军团菌01、02、03、04、05、06、07、011、012、013和015共11种血清型的基因芯片及检测用试剂盒。
背景技术：
水是生命得以存在的必要条件，它使我们人类得以繁衍生息，人类的生活、生产、 娱乐都离不开水。它同时也是许多病原微生物滋生、传播的场所和载体，这些病原微生物一旦进入人体则将可能使人患病、甚至导致死亡，严重威胁着人类健康。随着社会的发展和生活水平的提高，人们越来越关心自身的健康问题，而各种水体(包括生活饮用水，江河湖泊， 游泳场馆等)的安全问题也日益成为人们关注的热点。因此，为了保护人们的身体健康，对各种水体尤其是饮用水中病原微生物的检测是十分必要和亟需的。军团菌(^^iofldh)是一种革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然和人工环境的水体、土壤中，可以通过含菌气溶胶的方式在空气中播散而被人体吸入导致人类感染，引发急性发热性肺部疾病——军团病。自1976年首次在美国发现军团病以来，该病已呈现出世界性分布及病死率高的两大特点。军团菌的生长繁殖与环境因密切相关，集中空调的冷却塔冷却水、冷凝水以及温泉水是军团菌在外界适宜的生存环境。当环境水中的军团菌繁殖到一定浓度，则会形成气溶胶进而感染人。宿主感染主要受其易感性和细菌毒力的影响，任何年龄均可发生，但中老年、基础免疫较差者、长途旅行者、吸烟者为高危人群，并以医院、宾馆、大型建筑工地等公共场所易染军团菌。目前，军团菌属(Ze^/o/^Wace)已发现有50多个种，70多个血清型，并不断有新的菌种被发现。其中与人类关系最密切的的嗜肺军团菌pnewmphila),^· 从环境中分离出来，是军团菌属的代表种。根据0-抗原的不同，嗜肺军团菌可分为15个0 血清型。其中大约有70%的军团菌感染是由嗜肺军团菌01型引起的，20-30%是由其它血清型引起的，非嗜肺军团菌导致约才5-10%的军团菌感染，从此可得知，嗜肺军团菌01型在军团菌引起的病例中占有相当大的比例，是军团菌的主要致病类群，在军团菌的研究调查中占有重要的地位。此外，军团菌属种类多样，常规的细菌培养和血清鉴定分型，耗时长，工作量大，通量低，不能满足流行病学调查及对突发致病事件快速分析需要。免疫血清学方法是利用细菌抗原的独特性及抗原抗体结合的特异性建立起来的现代检测技术，具有特异性强等特点。许多临床疾病已经开始使用这种方法进行病原体检测，如利用HBV表面抗原检测HBV 病毒。然而，由于这种方法需要经过至少48小时的细菌培养、扩增和单菌落的分析，并需要对每一个样品的大量单菌落进行抗血清凝聚反应，耗时长且可能出现假阴性。另外，世界上没有一家公司或单位能生产全部细菌的抗血清，即使是最常用的大肠杆菌的抗血清，也只有少数几个公司和单位有全部血清型的抗血清而且价格昂贵。1993年，Luk，J. Μ. C et. al选取沙门氏菌W eflierica )0_抗原基因簇的特异核苷酸序列，通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的0-抗原[Luk，J. Μ. C. et.al (1993) "Selective amplification of abequose and paratose synthase genes (xfb) by polymerase chain reaction for identification of S. enterica major serogroups (A, B, C2 and D)，，， J. Clin. Microbiol. 31: 2118-2123]，开启了从0抗原基因簇中筛选特异分子标识的先河，为细菌多样的0-抗原检测提供了高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高的分子检测方法。细菌0抗原种类繁多，一般不同的细菌具有不同的0-抗原，同一种属内的细菌也大多有不同的0-抗原。研究表明，细菌0-抗原的多样性是由负责其合成的基因簇的遗传学多样性导致，0-抗原基因簇中的一些特定基因对于其编码的表面抗原具有极高的特异性， 由此为启发，可以从0抗原基因簇中筛选特异分子标识，用于军团菌分子分型。目前，应用军团菌检测方面的专利或专利申请主要有
(1)扩增常见致病型军团菌^jrB基因特异区引物及其应用(公布号CN102168131)， 该专利申请提供了一种分别扩增米克戴德军团菌aegionella micdadei)；博兹曼军团菌{Legionella bozemanii)；长 难军团菌{Legionella longbeachae)中穿/^召—因(DNA gyrase B subunit gene，以下简称^jr扔特异区的引物，还提供了一种包括扩增米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌WTi 基因特异区的引物的PCR试剂盒，利用该PCR试剂盒对米克戴德军团菌、博兹曼军团菌、长滩军团菌进行检测，简便快速、特异性好、灵敏度高，可用于水体和临床样品的监督和检测、饮用水中病原菌检测、细菌学分类及流行病学调查等领域，具有深远的社会效益和较大的经济效益。(2) 一种检测水中常见致病菌的DNA微阵列(公布号CN1396270A，
公开日2003 年2月12日)，该专利申请公开了一种DNA微阵列检测水中常见致病菌的技术。该技术利用 16S rRNA基因检测与鉴定水中常见致病菌，两条引物分别设计在16S rRNA基因的保守区， 探针在16S rRNA基因的可变区。该DNA微阵列技术可检测埃希氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、变形杆菌属、厌氧梭状芽孢杆菌属、链球菌属、军团杆菌、结核分枝杆菌、 耶尔森氏菌、李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌，可用于临床疾病诊断、水和食品的监督与检测与流行病学调查。该技术由于16S rRNA的高度保守性，分辨能力较低，无法区分到种，也无法区分大肠杆菌和志贺氏菌。
(3)—种扩增嗜肺军团菌gyrB基因特异区的引物及其应用(公布号CN101967474)， 该专利申请公开了一种扩增嗜肺军团菌中gyrB基因(DNA gyrase B subunit gene,以下简称gyrB)特异区的引物，还提供了一种包括扩增嗜肺军团菌gyrB基因特异区的引物的PCR试剂盒，利用该PCR试剂盒对嗜肺军团菌进行检测，简便快速、特异性好、灵敏度高， 可用于水体和临床样品的监督和检测、饮用水中病原菌检测、细菌学分类及流行病学调查等领域，具有深远的社会效益和较大的经济效益。(4)嗜肺军团菌基因克
隆、重组、表达和蛋白纯化方法(公布号CN1664105)，该专利申请公开了一种嗜肺军团菌 Legionella pneumophila macrophage infectivity potentiator (ffii/7)基因的克隆、重组、表达、纯化方法与专用引物，以及MIP蛋白及其类似物、衍生物在军团菌感染病人的临床诊断和治疗方面的应用。本方法将获得的嗜肺军团菌基因组DNA，用PCR方法获得皿>基因，并将该基因重组后克隆到大肠杆菌表达载体中，诱导表达后提取MIP蛋白，进而应用亲和层析方法得到高纯度的蛋白，为临床进一步诊断嗜肺军团菌感染应用于检测嗜肺军团菌抗原和抗体。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测嗜肺军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒，以弥补传统饮用水水质检测技术存在的费时、耗力，分辨能力差的缺陷，扩展病原微生物检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容
一种检测嗜肺军团菌ilegionella Pneumophila )的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于该寡聚核苷酸探针包含下述DNA片段中的至少一种
(1)嗜肺军团菌04、012、013、015的权 基因中所选取的至少一种DNA片段；
(2)嗜肺军团菌01、02、03、05、06、07的Mi基因中所选取的至少一种DNA片段；
(3)嗜肺军团菌011的冊ck基因中所选取的至少一种DNA片段；
(4)(1)或(2)或(3)中选取的DNA片段的互补DNA片段。本发明所述的固相载体为带有活性基团的玻璃片。所述寡聚核苷酸探针优选具有SEQ ID NO: 1-23所示的核苷酸序列，或不同于SEQ ID NO: 1-23但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1-23所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；本发明所述的基因芯片，还包括正对照探针和负对照探针。上述的优选序列及功能如下所示 SEQ ID (5，-3，)
NO:1 CAGTCATGGATATCACTCGCGACTATCTC用于检测嗜肺军团菌 01
NO 2 GCGAAATATAAATCGGAACAGGTTTGG用于检测嗜肺军团菌 01
NO 3 CAACTCCGGATTGGTAAATAAAATTTATTTT用于检测嗜肺军团菌 04
NO 4 CGGTTTAATTATAATTTGCGCCACCATTTATG 用于检测嗜肺军团菌 04 NO 5 GTTAGCAGTTGGAGATCAGGATTTTCA用于检测嗜肺军团菌 02
NO 6 GCCATGATATGAGTGCTATTGAATCGATTTG 用于检测嗜肺军团菌 02 和 03 NO 7 TATTAGCAGTAGGAGATCAAGATTTTCAAA 用于检测嗜肺军团菌 03 NO 8 AGGAAAGAGTACTTTACTGAAAATTTTATCCA 用于检测嗜肺军团菌 05 NO 9 AGCCAAGGTGGTTGTTTCAGATTCGCAAACT用于检测嗜肺军团菌 05
NO: 10 CCAAATATCACCTGGCGAACGCATAGGTTTAA 用于检测嗜肺军团菌 05 NO: 11 ATCCAGAATAACTACTCCGACTTATGGTGAA用于检测嗜肺军团菌 05
N0:12 TAGATTCAATTGCAAGATCTCATGCCC用于检测嗜肺军团菌 06
N0:13 ACAAGGTTCTTATTCATTCTCTTAAGCTTT用于检测嗜肺军团菌 06
N0:14 CTGTGTAGAGCTTAATTGTGTGAGATTATTGG 用于检测嗜肺军团菌 07 N0:15 TATTATTTATTTTCTTACACCGCATTATTGG用于检测嗜肺军团菌 011
NO 16 TCATCTCATATTGATTCAGTTAATTAGTTT用于检测嗜肺军团菌 011
NO 17 CATATTGATTCAGTTAATTAGTTTATTATTCAT 用于检测嗜肺军团菌 011 NO 18 GATTATAAATCACGAAAAATGGTTTAGCCCT用于检测嗜肺军团菌 011
NO 19 CAGTTATAGAGATGCACTAAATGGTCGAT 用于检测嗜肺军团菌 012 和 015 N0:20 TTCACCTCATTGGTTAAGATTCTGGTATG用于检测嗜肺军团菌 012 和 015
5NO: 21 TGCCACAGTTTATGATAAACTTAATTATCA 用于检测嗜肺军团菌 013 NO: 22 CCTACTATTTGTTATTCAAGCAATGTTT用于检测嗜肺军团菌 013
NO: 23 TTTGTACCACTGGCATTACAATTTTATTAT用于检测嗜肺军团菌 013
NO:33 :0A532
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTCCTACGGGAGGCAGC 为正对照探针 WL-4006 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 为负对照探针 Cy3 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Cy-3 为荧光探针本发明的基因芯片，可用于嗜肺军团菌01、02、03、04、05、06、07、011、012、013和015 等11种血清型中至少一种致病菌的检测。本发明所述的基因芯片的制备方法，主要包含步骤
1)根据权利要求1所述嗜肺军团菌的Wzm基因、WZt基因及冊ck基因保守区设计并制备出用于PCR扩增的引物；
2)制备待测样品的基因组DNA，使用步骤1)中的引物，对待测样品基因组DNA进行PCR 扩增，得到靶序列；
3)标记步骤2)中得到的靶序列；
4)将标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交； 5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析杂交结果。其中，步骤1)中所述的引物包括SEQ ID NO: 24_32所示的核苷酸序列的至少一种，各条引物探针的寡核苷酸序列由5’端至3’端的组成及其对应扩增作用是
Pl (SEQ ID NO: 24) TGCAGCAAGCAAAAGTTCAG用于扩增嗜肺军团菌01血清型rzi基因的上游引物；
P2 (SEQ ID NO25)CAACTCCGGATTGGTAAA用于扩增嗜肺军团菌04血清型权 基因的上游引物；
P3 (SEQ ID N0J6) TTCAGAAATCCTCTGGAAG用于扩增嗜肺军团菌02和03血清型rzi 基因的上游引物；
P4 (SEQ ID NO:27) ATAATAAAGCAAGCCTTGAT用于扩增嗜肺军团菌05血清型rzi基因的上游引物；
P5 (SEQ ID NO28)TAAAGATATTGTAGAGAGCCAGC用于扩增嗜肺军团菌06血清型权 基因的上游引物；
Ρ6 (SEQ ID N0J9)TTAAGTGCGGACTACCCA用于扩增嗜肺军团菌07血清型rzi基因的上游引物；
P7 (SEQ ID N0:30) TTGAATTCATTATTTCTTTTCG 用于扩增嗜肺军团菌 011 血清型 recA 基因的上游引物；
P8 (SEQ ID N0:31)GGGGATATTCAACCGTTA 用于扩增嗜肺军团菌 012 禾Π 015 血清型 wzm 基因的上游引物；
P9 (SEQ ID而:32)17611^1"11^^60^046用于扩增嗜肺军团菌013血清型》^ 基因的上游引物。本发明的另一目的是提供一种嗜肺军团菌检测用试剂盒，该试剂盒包括上述的基因芯片，所述的基因芯片包含SEQ ID N0:1-23的核苷酸序列或其互补核苷酸序列的至少一种；还包含PCR扩增的引物，该引物具有SEQ ID NO: 24-32的核苷酸序列的至少一种，其中，用于嗜肺军团菌04、012、013、015的議基因PCR扩增的引物序列根据嗜肺军团菌04、 012、013、015的》^ 基因序列设计；用于嗜肺军团菌01、02、03、05、06、07的权 基因PCR 扩增的引物序列根据嗜肺军团菌01、02、03、05、06、07的基因序列设计；用于嗜肺军团菌011的呢cA基因PCR扩增的引物序列根据嗜肺军团菌011的呢cA基因序列设计。本发明所述的试剂盒还包括杂交盒、杂交液等。本发明所述的试剂盒，可用于对嗜肺军团菌01、02、03、04、05、06、07、011、012、 013和015等11种血清型的至少一种致病菌的检测。本发明公开的用于检测水体重要致病菌嗜肺军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒与现有技术相比，有益效果在于
(1)现有芯片技术研究所设计的引物和探针基本都位于16S rRNA基因，本发明将在具有明显进化优势的綱Zwzt基因上，设计特异探针和引物，有效的避免了分辨能力较低，无法区分到种的弊端，大大弥补了现有技术中检测芯片的检测范围的欠缺。(2)该检测方法大约需M小时。在一张片基上可同时检测8个样品，减少了成本， 实现高通量，同时检测多个样品的目的，特别适合于检测那些多重感染的样品。(3)本发明将芯片技术引入到水体重要致病菌的快速检测中，建立了一种快速、灵敏、高通量、准确性高、重复性强的全新的血清型分型检测基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到对11种主要的病原微生物进行检测的目的，由于操作简便，准确性高，能一次完成多种型别的检测，重复性强，因此对于水质监测部门水质监测有重要的应用价值，实现对嗜肺军团菌的快速准确的检测。
图1为本发明的基因芯片结构外形示意图； 图2为本发明芯片的单一点阵结构示意图3为利用本发明的基因芯片检测嗜肺军团菌01的的杂交结果示意图； 图4为利用本发明的基因芯片检测嗜肺军团菌02的的杂交结果示意图； 图5为利用本发明的基因芯片检测嗜肺军团菌03的杂交结果示意图； 图6为利用本发明的基因芯片检测嗜肺军团菌04的杂交结果示意图； 图7为利用本发明的基因芯片检测嗜肺军团菌05的杂交结果示意图； 图8为利用本发明的基因芯片检测嗜肺军团菌06的杂交结果示意图； 图9为利用本发明的基因芯片检测嗜肺军团菌07的杂交结果示意图； 图10为利用本发明的基因芯片检测嗜肺军团菌011的杂交结果示意图； 图11为利用本发明的基因芯片检测嗜肺军团菌012的杂交结果示意图； 图12为利用本发明的基因芯片检测嗜肺军团菌013的杂交结果示意图； 图13为利用本发明的基因芯片检测嗜肺军团菌015的杂交结果示意图； 图14为利用本发明的基因芯片进行模拟实验检测嗜肺军团菌01的杂交结果示意图； 图15为利用本发明的基因芯片进行灵敏度实验检测lOOng/μ L嗜肺军团菌04的杂交结果示意图16为利用本发明的基因芯片进行灵敏度实验检测lOng/μ L嗜肺军团菌04的杂交结果示意图；图17为利用本发明的基因芯片进行灵敏度实验检测Ing/μ L嗜肺军团菌04的杂交结果示意图18为利用本发明的基因芯片进行灵敏度实验检测0. Ing/yL嗜肺军团菌04的杂交结果示意图。
具体实施例方式为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例， 并配合说明书附图，作详细说明如下。实施例1探针的设计和制备序列获得
(1)嗜肺军团菌01的Ki基因的获得从GenBank公共数据库下载得到嗜肺军团菌01 的wzt基因序列；
(2)嗜肺军团菌04、012、013、015的双 基因序列由本实验室破译获得；
(3)嗜肺军团菌02、03、05、06、07的Mi基因由本实验室破译获得；
(4)嗜肺军团菌011的呢cA基因由本实验室破译获得；
(5)16S rRNA基因序列的获得从GenBank公共数据库下载得到嗜肺军团菌的全部 16S rRNA基因序列及其近缘菌的全部16S rRNA基因序列。2.探针设计举例
嗜肺军团菌01的探针将嗜肺军团菌01的Ki基因序列导入Glustal X软件中， 选取一条代表序列在公共数据NCBI中作Blastn比对，确定可否作为特异靶点以及特异靶点的位置。将序列导入OligoArray 2.0软件中。参数设定如下_n 20 ；-1 30 ；-L 40 ；-D 3000 ；-t 79 ；-T 90 ；_s 65 °C ；-χ 65 °C ；-N 2 ；-ρ 33，-P 65；_m GGGGG CCCCC TTTTT AAAAA ；-g 15。运行程序在线设计探针。3.探针合成将下表1中的探针序列的5’端加T延长至40 bp并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。4.探针筛选将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异的探针。其它探针的设计方法与嗜肺军团菌01探针设计方法相同，使用的设计参数也相同。本发明通过多次杂交实验进行探针筛选，得到的优选的探针如表1所示 表1.本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的嗜肺军团菌
权利要求
1.一种检测嗜肺军团菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于该寡聚核苷酸探针包含下述DNA片段中的至少一种(1)嗜肺军团菌04、012、013、015的权 基因中所选取的至少一种DNA片段；(2)嗜肺军团菌01、02、03、05、06、07的Mi基因中所选取的至少一种DNA片段；(3)嗜肺军团菌011的卿A基因中所选取的至少一种DNA片段；(4)(1)或(2)或(3)中选取的DNA片段的互补DNA片段；上述所述的固相载体为带有活性基团的玻璃片。
2.权利要求1所述的基因芯片，其中所述寡聚核苷酸探针具有SEQID N0:l-23所示的核苷酸序列，或不同于SEQ ID NO: 1-23但编码的氨基酸序列与SEQ ID N0:l_23所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列。
3.权利要求1或2所述的基因芯片，其中还包括正对照探针和负对照探针；具有SEQ ID NO: 33-34所示的核苷酸序列。
4.权利要求1所述的基因芯片在制备检测水体中菌嗜肺军团菌11个血清型中至少一种致病菌的方面应用。
5.权利要求1所述基因芯片的使用方法，其特征在于包含步骤(1)根据权利要求1所述病原菌的議基因、κ 基因和卿A基因设计并合成用于PCR 扩增的引物；(2)制备待测样品的基因组DNA，使用步骤(1)中的引物，对待测样品基因组DNA进行 PCR扩增，得到靶序列；(3)标记步骤(2)中得到的靶序列；(4)将标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交；(5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析杂交结果。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述的引物包括SEQID NO: 24-32 所示的核苷酸序列的至少一种。
7.—种检测嗜肺军团菌的试剂盒，其特征在于包含权利要求2所述SEQ ID NO: 1-23所示的核苷酸序列或其互补核苷酸序列的至少一种。
8.权利要求7所述的试剂盒，其特征在于还包含PCR扩增的引物，该引物具有SEQID NO: 24-32的核苷酸序列的至少一种。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于还包含杂交盒、杂交液。
10.权利要求7所述的试剂盒在制备检测嗜肺军团菌01、02、03、04、05、06、07、011、 012、013和015共11种血清型中至少一种致病菌方面的应用。
全文摘要
本发明提供了一种嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)的基因分型芯片及检测用试剂盒，其主要针对嗜肺军团菌O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O11、O12、O13和O15等11种血清型。该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，上述寡聚核苷酸探针包含从具有明显生物进化优势的wzm基因、wzt基因和wecA基因上选取的DNA片段或其互补的DNA片段。利用设计的引物将待检测样品基因组DNA扩增并标记后，用上述基因芯片进行杂交，根据杂交信号，可检测出嗜肺军团菌的不同血清型。利用本发明的基因芯片可达到检测嗜肺军团菌血清型的目的，操作简便，准确性高，重复性强，并且可更准确的指导医疗用药。
文档编号C12R1/01GK102424862SQ201210003928
公开日2012年4月25日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者冯露, 周光朋, 姚芳芳, 曹勃阳, 王磊 申请人:南开大学