提高植物对低氧条件抗性的方法

专利名称：提高植物对低氧条件抗性的方法
提高植物对低氧条件抗性的方法本申请是发明人于2006年6月6日提交的题为“提高植物对低氧条件抗性的方法”的中国专利申请200680021382. X的分案申请。本发明提供用于提高植物对低氧或无氧条件抗性的方法。这类方法可用于促进植物根穿透生长培养基或土壌。本发明的方法可包括对植物基因组的修饰，所述修饰通过对植物提供外源胁迫耐受性基因或对应于这类外源基因的内源基因的胁迫耐受性变体。本发明的方法也可包括对植物或其生境，或对其细胞或种子使用新烟碱类化合物(neonicotinoid compound)，例如但不限于吡虫啉(imidacloprid)、烯啶虫胺 (nitenpyram)、ロ足虫脉(acetamiprid)、噻虫啉(thiacloprid)、噻虫嗪(thiamethoxam)、可尼丁(clothianidin)和呋虫胺(dinotefuran)。特別有效的新烟碱类化合物是包含氯吡啶(chloropyridine)侧链的新烟碱类化合物，例如吡虫啉、烯啶虫胺、啶虫脒和噻虫啉，特别是其在植物中的降解能够释放6-氯烟酸(6-chloronicotininc acid,6-CNA)的那些新烟碱类化合物，像例如吡虫啉和噻虫啉。植物或其生境也可直接用6-CNA处理。
背景技术：
改造为胁迫耐受的植物为本领域所已知。植物細胞和植物的胁迫耐受性可例如通过降低内源聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)或聚(ADP-核糖)糖原水解酶(PARG)的活性或水平实现，其分别描述于WO 00/04173和W004/090140中。欧洲专利申请No. 04077624. 7描述了使用下述核苷酸序列例如在植物中过表达来实现植物和植物細胞的胁迫耐受性，所述核苷酸编码參与NAD补救合成途径和/或NAD 从头合成途径的酶。然而，这些文件均没有公开使用其中提到的胁迫耐受性基因在植物細胞和植物中获得对低氧或无氧条件的耐受性的可能性。它们也没有公开其中所述胁迫耐受性基因用于下述目的的用途允许植物的根系更深地穿透进入生长培养基或土壌中。除昆虫控制外，新烟碱类化合物在植物中其他目的的应用也是本领域已知的(W0 01/26468，WO 03/096811)。WO 01/26468公开了改善植物生长的方法，其包括向植物或其所在地应用至少ー 种选自新烟碱类的化合物。W003/096811描述了在下述地点的农学植物的产量和/或活力可以通过用新烟碱类化合物处理植物的种子来提高或改进，所述地点中虫害水平低于所指示的需要使用杀虫剂用于昆虫控制目的的水平。所述方法被认为适用于非转基因植物和具有外源基因的植物，所述外源基因编码经修饰的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis) δ-内毒素蛋白质的产生。然而，这些文件均未描述为了提高植物細胞或植物对低氧或无氧条件的耐受性， 或允许植物的根系更深地穿透进入生长培养基或土壌的目的，将新烟碱类化合物用于植物的用途。因此，本领域仍未涉及增加植物根系或根进入生长培养基或土壌的穿透深度，或提高植物細胞或植物对低氧或无氧胁迫条件的耐受性的方法，所述方法如下文在不同的实施方案和权利要求中所述使用胁迫耐受性基因，或通过对植物或其細胞使用新烟碱类化合物。发明概述本发明的一个实施方案提供提高植物細胞或植物对低氧或无氧条件耐受性的新方法，所述方法包括向植物細胞或植物提供胁迫耐受性增强转基因，其中所述胁迫耐受性增强转基因选自-能够降低植物内源PARP基因表达的胁迫耐受性增强转基因，特别是其中所述转基因编码PARP抑制性RNA分子；-能够降低植物内源PARG基因表达的胁迫耐受性增强转基因，特別是其中所述转基因编码PARG抑制性RNA分子；或-编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径的植物功能酶的胁迫耐受性增强转基因，所述酶选自烟酰胺酶、烟酸盐/酯磷酸核糖基转移酶(nicotinate phosphoribosyltransferase)、畑酸单核苷酸腺嘌呤基转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。在另ー实施方案中，本发明涉及这类胁迫耐受性增强转基因促进植物根穿透生长培养基(包括土壌)的用途。本发明的另ー实施方案提供用于提高植物細胞或植物对低氧或无氧条件耐受性的方法，其包括向植物細胞、植物，或将长成此类植物的种子或其生境使用有效量的新烟碱类化合物。在另ー实施方案中，本发明涉及这类化合物促进植物根穿透生长培养基(包括土壌)的用途。本发明还涉及用于提高植物細胞或植物对低氧或无氧条件耐受性的方法，包括将有效量的6-氯烟酸提供给所述植物的細胞的步骤。本发明还涉及6-CNA用于促进植物根穿透进入生长培养基中的用途。


图1 測量生长于琼脂溶液中的植物根深的測定法的示意图。用透明的或半透明的生长培养基C3)填充带有封ロ( 的容器(1)，所述生长培养基为例如0.4%的琼脂-水或0.7%的琼脂-水，其中可添加额外的测试化合物。向管中加入一粒预萌发的种子，并允
许其生长三周。在垂直位置生长三周后，从培养基顶部到根的最低点測量植物的根深 ⑶。图2:拟南芥(Arabidopsis thaliana) cv. Col-Ο植物根深(mm)的箱状图示，所述植物与非转基因拟南芥植物(Col-O)相比包含转基因，所述转基因编码能够降低内源 PARP2基因表达的dsRNA分子。分析以下种群· Col-O 数据指示野生型拟南芥株系· 427-16 数据指示对强光胁迫条件具有弱耐受性的包含抗PARP2基因的拟南芥转基因株系
· 427-20 数据指示对强光胁迫条件具有弱耐受性的包含抗PARP2基因的拟南芥转基因株系· 427-20 数据指示对强光胁迫条件具有中等耐受性的包含抗PARP2基因的拟南芥转基因株系该图左侧表示了各组值的代表性箱状图(或箱状图和须盒图)，所述值总结了以下的统计学測量-中位数-上四分位和下四分位数-最小和最大数据值。另外，在各组数值的右边，指示这些数值的均值和均值标准差。箱状图解释如下-箱自身包含中间50%的数据。箱的上缘(接合处)指出数据集的第75百分位数，下接合处指出第25百分位数。中间两个四分位数的范围已知为四分位数间距。-箱中的线指示数据的中位值。-须的末端指示最大和最小的数据值，存在异常值(outlier)的情况除外，在这种情况下须延伸至在1. 5倍四分位数间距的范围内最近的值点。图3 拟南芥cv. Col-O植物根深(mm)测量值的箱状示意图和均值标准差，所述植物包含转基因，所述转基因编码能够降低内源PARP基因表达的dsRNA分子。分析以下种群· Col-O 数据指示野生型拟南芥株系· 427-22 数据指示对强光胁迫条件具有高耐受性的包含抗PARP2基因的拟南芥转基因株系· 427-24 数据指示对强光胁迫条件具有低耐受性的包含抗PARP2基因的拟南芥转基因株系图4 拟南芥cv. C24植物根深(mm)测量值的箱状示意图和均值标准差，所述植物包含转基因，所述转基因编码能够降低内源PARP基因表达的dsRNA分子。分析了以下种群· C24 数据指示野生型拟南芥株系· 1599 数据指示对强光胁迫条件具有高耐受性的包含抗PARP2基因的拟南芥转基因株系· 1463 数据指示对强光胁迫条件具有中等耐受性的包含抗PARP2基因的拟南芥转基因株系· 1681 数据指示对强光胁迫条件具有中等耐受性的包含抗PARPl基因的拟南芥转基因株系· 1690 数据指示对强光胁迫条件具有中等耐受性的包含抗PARPl基因的拟南芥转基因株系图5 对待分离抗PARP2转基因的拟南芥Col-O种群测量的根深(mm)测量值的箱状示意图和均值标准差。分析了以下的种群
·不成对的(Azygous)数据指示来自不含有抗PARP2基因的种群的拟南芥植物·转基因的数据指示来自含有抗PARP2基因的种群的拟南芥植物图6 用多种浓度的吡虫啉处理的拟南芥cv. C24植物与未处理的拟南芥cv. C24 植物相比，根深(mm)测量值的箱状示意图和均值标准差。分析了以下的种群· 0 未处理的拟南芥CM植物· 50 用50毫克/升吡虫啉处理的拟南芥CM植物· 100 用100毫克/升吡虫啉处理的拟南芥CM植物图7 用多种浓度的6-氯烟酸处理的拟南芥cv. CM植物与未处理的拟南芥 cv. CM植物相比，根深(mm)测量值的箱状示意图和均值标准差。分析了以下的种群· 0 未处理的拟南芥CM植物· 1 用1毫克/升6-氯烟酸处理的拟南芥CM植物· 5 用5毫克/升6-氯烟酸处理的拟南芥CM植物发明详述本发明基于以下的认识包含胁迫耐受性基因(例如编码下述dsRNA的嵌合基因， 所述dsRNA目的在于使植物parpl或parp2基因的表达沉默)的植物产生了下述根系，所述根系的根与对照植物的根相比伸入生长培养基中更深。如现有技术所述，包含胁迫耐受性基因的植物根穿透更深的现象仍未被注意，并需要开发如本文所述的具体測定法用于统计学分析根进入培养基的穿透性。尽管不意图将本发明限制于具体的作用方式，仍认为胁迫耐受性基因提高植物细胞的耐受性(包括根的植物細胞对低氧和无氧条件的耐受性)，从而允许包含这类胁迫耐受性基因的根在较不良好的氧条件下生长，如可在生长培养基的更深区域或更深的土壤层中发现，那里氧张カ更低。植物根系进入更深土壌层的提高的穿透性部分地解释了在野外条件下对含有本文所述胁迫耐受性基因(例如下述dsRNA，所述dsRNA编码使内源parpl或 parp2基因表达沉默的基因)所观察到的植物提高的干旱抗性。添加新烟碱类化合物或6-氯烟酸后，可在所述测定法中观察到根伸长的类似效应。新烟碱类的使用对根生长深度的效应与昆虫的存在无关，所述昆虫是上述新烟碱类的靶标。因此，该效应也与植物或植物細胞或长成植物的种子的胁迫耐受性(特別是与低氧或无氧相关的胁迫耐受性)的生物化学改良相关。因此，在第一个实施方案中，本发明指向胁迫耐受性增强转基因提高植物細胞、植物或种子对低氧或无氧条件的耐受性的用途。本文使用的“低氧或无氧条件”是指植物細胞、植物或这类植物的部分所暴露的条件，其中氧的可用性低或非常低。无氧条件是指几乎不能获得氧的条件。一般地，溶解氧浓度低于约2毫克/升的条件被称为低氧(0. 1毫克/升到2毫克/升)，溶解氧低于0. 1毫克/升，特別是低于0.05毫克/升的条件被称为无氧。水中正常溶解的氧浓度为约8毫克/升。土壌中的低氧条件是指氧张カ低的条件，特别是土壤大气中氧降至低于5%的条件。低氧条件可发生于植物或植物部分被淹没吋。低氧条件还可发生于氧消耗高吋，例如在包含大量微生物代谢过程中的有机碎屑的土壤层中。另外，低氧条件发生于生长培养基的较深层，其中氧从表面发生扩散。低氧条件还发生于土壤较深层，因为氧扩散和导致的氧张カ比表面降低。氧减少的速率取决于土壤的紧密度(compactness) (土壤越紧密，存在的土壤大气越少)、分解中的有机材料的存在、水含量等。本文使用的“胁迫耐受性增强转基因”是指这样的转基因，即当所述转基因被引入植物細胞或植物中，或在植物細胞或植物中表达时，给细胞或植物提供更好的胁迫耐受性， 所述胁迫耐受性例如通过使用化合物(除草剤、杀真菌剂、杀虫剂、植物生长调节剂、佐剂、 肥料)、暴露于非生物胁迫(例如干旱、水涝、淹没、强光条件、强UV辐射、提高的过氧化氢水平、极端(高或低)温度、臭氧及其他大气污染物、土壤盐度或重金属、低氧、无氧等等)或生物胁迫(例如病原体或害虫感染，包括真菌感染、病毒感染、細菌感染、昆虫感染、线虫感染、支原体感染和支原体样生物感染等)而被赋予植物。这类胁迫耐受性增强转基因可以是如WO 00/04173或EP04077984. 5(在本文引用作为參考)中所述的，能够降低植物細胞或植物中多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)基因的表达和/或活性的转基因。多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)也称为多聚(ADP-核糖)转移酶(ADPRT) (EC 2. 4. 2. 30)，是发现于多数真核生物中的核酶，所述真核生物包括脊椎动物、节肢动物、软体动物、粘菌类(slime mould)、沟编藻类(dinoflagellates)、真菌和除酵母外的其他低等真核生物。所述酶活性也已在大量植物中得到证明(Payne等人，1976 ；Willmitzer和Wagner， 1982 ；Chen 等人，1994 ；0' Farrell, 1995)PARP主要催化来自NAD+的ADP-核糖部分向靶蛋白中谷氨酸残基的羧基的转化， 以及随后的ADP-核糖聚合作用。主要的靶蛋白是PARP自身，但是组蛋白、高迁移率类染色体蛋白质(high mobility groupchromosomal protein)、拓扑异构醇、内切核酸醇禾ロDNA 聚合酶也显示为可受到此修饰。作为具体的实施方案，胁迫耐受性增强转基因可包含以下有效连接的DNA片段a)植物可表达的启动子；b)被转录后得到下述RNA分子的DNA区，所述RNA分子(PARP抑制性RNA分子) 能够降低植物的内源PARP编码基因的表达；c)參与转录终止和多聚腺苷酸化的DNA区。所述DNA区转录后可产生所谓的反义RNA分子，所述反义RNA分子以转录方式或转录后方式降低靶植物或靶植物細胞中PARP编码基因的表达，所述反义RNA分子包含至少 20或21个连续的核苷酸，所述连续核苷酸与所述植物細胞或植物中存在的PARP编码基因核苷酸序列的互补序列具有至少95%到100%的序列同一性。所述DNA区还可产生所谓的有义RNA分子，所述有义RNA分子以转录方式或转录后方式降低靶植物或靶植物細胞中PARP编码基因的表达，所述有义RNA分子包含至少20 或21个连续的核苷酸，所述连续核苷酸与所述植物細胞或植物中存在的PARP编码基因的核苷酸序列具有至少95%到100%的序列同一性。然而，约20nt的PARP编码区的反义或有义RNA区的最小核苷酸序列可以包含在更大的RNA分子中，所述更大RNA分子的大小在20nt到与靶基因尺寸相等的长度间变化。因此，所述反义或有义核苷酸区可以是约21nt到约5000nt长，例如长度为21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt 或甚至约 5000nt 或更长。另外，本发明
的目的不要求所使用的抑制性PARP RNA分子的核苷酸序列或转基因的编码区与内源PARP 基因完全相同或互补，所述内源PARP基因的表达被靶向以在植物細胞中降低。序列越长， 对整体序列同一性的要求越不严格。因此，有义或反义区可以具有与内源PARP基因或其互补序列的核苷酸序列约40%或50%或60%或70%或80%或90%或100%的整体序列同一性。然而如前文所述，反义或有义区应当包含20个连续核苷酸的核苷酸序列，其与内源 PARP基因的核苷酸序列具有约100%的序列同一性。优选地，约100%序列同一性的一段序列应当是约50,75或IOOnt0就本发明的目的而言，以百分比表示的两个相关核苷酸序列的“序列同一性”是指两个最佳比对的序列中具有相同残基的位置数除以所比较的位置数(X100%)。空位被认为是具有不相同残基的位置，即ー个序列存在残基而另ー个序列中不存在该残基的比对中的位置。两个序列的比对通过Needleman和mmsch算法(Needleman和1Wunsch 1970)计算机辅助序列比对进行，可使用标准软件程序如GAP (其为Wisconsin Package 10. 1版本 (Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin，美国)的一部分)，使用默认评分矩阵 (空位产生罚分50和空位延伸罚分3)来便利地进行。应当明白一旦參照相应DNA分子的核苷酸序列定义RNA分子的核苷酸序列吋，核苷酸序列中的胸腺嘧啶⑴应当用尿嘧啶⑶代替。本申请的上下文会明确是參照用RNA 还是DNA。上述转基因降低内源PARP基因表达的效力可以通过包含DNA元件而被进ー步增強，所述DNA元件导致异常的、未多聚腺苷酸化的PARP抑制性RNA分子的表达。适用于该目的的一个这类DNA元件为如W000/01133A1中所述的编码自我剪接核酶的DNA区。如WO 99/53050A1中所述，上述转基因降低植物細胞内源PARP基因表达的效カ还可通过如下方式进ー步增强在ー个植物細胞中同时包括本文所述编码反义PARP抑制性 RNA分子的转基因和本文所述编码有义PARP抑制性RNA分子的转基因，其中所述反义和有义PARP抑制性RNA分子能够通过所述至少20个连续核苷酸之间的碱基配对形成双链RNA 区。如在WO 99/53050A1中所进ー步描述的，能够形成双链RNA区的有义和反义PARP 抑制性RNA区可以存在于ー个RNA分子中，优选地被间隔区分离。间隔区可包含内含子序列。这类转基因可如下所述便利地构建将反向重复序列中包含来自分离的或鉴定的内源PARP基因的至少20个核苷酸的DNA片段(其表达被靶向降低)与植物可表达的启动子和參与转录终止和多聚腺苷酸化的3’末端形成区有效地连接。为了实现这类转基因的构建，可使用WO 02/059294A1中描述的载体。现有的命名法将经典的含锌指的聚合酶称作PARPl蛋白质(和相应的parpl基因)，而结构上非经典的PARP蛋白质现在被称为PARP2 (和相应的parp2基因)，本文使用的“PARP编码基因”可指二者中的任ー类型。以下的实验性鉴定证实的和假定的多聚ADP-核糖聚合酶蛋白质序列、其部分或同源序列的数据库登录号(在本文引用作为參考)可以根据本发明使用BAD53855(稻 (Oryza sativa)) ；BAD52929(稻)；XP_477671 (稻)；BAC84104(稻)；AAT25850 (玉米(Zea mavs)) ；AAT25849(玉米)；NP 197639(拟南芥)；NP 8δ0165(拟南芥)；NP I88IO7 (拟南芥)；NP_850586(拟南芥)；BAB09119 (拟南芥)；AAD20677 (拟南芥)；Ql 1207(拟南芥)； C84719(拟南芥)；T51353(拟南芥)；Τ01311(拟南芥)；ΑΑΝ12901 (拟南芥)；AAM13882(拟南芥)；CAB80732(拟南芥)；CAA10482 (拟南芥)；AAC79704 (玉米):AAC19283 (拟南芥)； CAAlO888 (玉米)；CAAlO889 (玉米)；CAA8拟88 (拟南芥)。作为本发明具体的实施方案，降低PARP基因表达的基因可包含以下有效连接的 DNA片段a)植物可表达的启动子；b)被转录后产生RNA分子的DNA区，所述RNA分子包含a.反义核苷酸序列，其包含至少约20个连续的核苷酸，所述连续的核苷酸与选自以下的约20个连续核苷酸的核苷酸序列具有约96%的序列同一性SEQ ID 1 (拟南芥 parpl编码区)、SEQ ID 2 (拟南芥parp 2编码区)、SEQ ID 3 (玉米parpl编码区)、SEQ ID 4 (另一玉米parpl编码区)、SEQ ID 5 (玉米parp2编码区)或SEQ ID 6 (棉花parp2 部分cDNA)的核苷酸序列或编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有与所述核苷酸序列编码的氨基酸序列相似或相同的氨基酸序列。b.有义核苷酸序列，其包含至少约20个与反义核苷酸序列互补的核苷酸。因此， 有义核苷酸序列可包含至少约20个连续核苷酸的序列，所述序列与选自以下的约20个连续核苷酸的核苷酸序列具有约96%的序列同一性SEQ ID 1 (拟南芥parpl编码区)、SEQ ID 2 (拟南芥parp 2编码区)、SEQ ID 3 (玉米parpl编码区)、SEQ ID 4 (另一玉米parpl 编码区)、SEQ ID5 (玉米parp2编码区)或SEQ ID 6 (棉花parp2部分cDNA)的核苷酸序列或编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有与所述核苷酸序列编码的氨基酸序列相似或相同的氨基酸序列；其中有义和反义核苷酸序列能够形成双链RNA分子(dsRNA)；c)用于转录终止和多聚腺苷酸化的DNA区。然而，应当明白可使用如WO 00/04173或EP 04077984. 5中描述的其他降低PARP
基因表达的基因。在本发明的另ー实施方案中，胁迫耐受性增强转基因可以是能够降低植物或植物細胞的PARG编码基因表达和/或活性的转基因，如W02004/090140 (在本文引用作为參考) 中所述。PARG (多聚(ADP-核糖)糖原水解酶；E. C. 3. 2. 1. 143)通过其外切糖苷酶和内切糖苷酶活性(PARG)将聚(ADP-核糖)聚合物转化为游离的ADP-核糖。在植物中，通过基于基因图谱对野生型基因的克隆而鉴定了聚(ADP-核糖)糖原水解酶在突变体中失活，所述突变体受到拟南芥中时钟控制基因转录和从植物性生长到开花的光周期依赖性转换(tej)的影响。该基因的核苷酸序列可以在登录号AF394690(Panda 等人，2002 Dev. Cell. 3,51-61 ；SEQ ID No 7)下从核苷酸数据库中获得。其他来自植物的植物PARG编码基因的核苷酸序列以及从其他植物分离其他 PARG编码基因及其变体的方法可见于WO 2004/090140A2,该核苷酸序列例如来自马铃薯 (Solanum tuberosum)的 PARG 基因(SEQ ID No8)；稻(SEQ ID No 9)或玉米(SEQ ID No 10)。因此，在一个实施方案中，被改造为抗胁迫的植物或植物細胞可包含以下有效连
13接的DNA片段a)植物可表达的启动子；b)当被转录后产生抑制性RNA分子的DNA区，所述RNA分子包含i.反义核苷酸区，其包含至少约20个连续的核苷酸，所述连续的核苷酸与选自以下的约20个连续核苷酸的核苷酸序列具有至少96%的序列同一性编码植物PARG蛋白的核苷酸序列(例如SEQ ID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9或SEQ ID 10的核苷酸序列)的互补序列，或编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有与所述核苷酸序列相似或相同的氨基酸序列；或ii.有义核苷酸区，其包含至少约20个选自以下的连续核苷酸编码植物PARG蛋白质的核苷酸序列(例如SEQ ID 7, SEQ ID 8, SEQ ID 9或SEQ ID 10的核苷酸序列)，或编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有与所述核苷酸序列相似或相同的氨基酸序列； 或iii.如i)或ii)所述的反义和有义核苷酸序列，其中所述反义和有义核苷酸序列能够形成双链RNA分子；c)參与转录终止和聚腺苷酸化的DNA区。本领域技术人员将立刻可以明白，有义和反义核苷酸序列或dsRNA分子的长度， 以及ParG抑制性RNA分子的序列同一性的其他參数可如上所述用于PARP抑制性RNA分子。本发明的另ー实施方案中，胁迫耐受性增强转基因可以是编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径的植物功能酶的转基因。因此，胁迫耐受性增强基因可包含以下如EP 04077624. 7中所述(在本文引用作为參考)的有效连接的DNA分子a)植物可表达的启动子；b)编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径的植物功能酶的DNA区，所述酶选自烟酰胺酶、烟酸盐/酯磷酸核糖基转移酶、畑酸单核苷酸腺嘌呤基转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶；和c)參与转录终止和聚腺苷酸化的3’末端区。本文使用的“烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径的植物功能酶”是这样的酶， 即当将其引入植物中、与合适的调控元件(例如植物可表达的启动子和终止子区)连接后能够在植物細胞中被转录并翻译而产生有功能的NAD补救合成途径的酶。该酶包括得自植物来源的来自NAD补救合成的酶(和编码基因)，以及得自酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae))或得自其他酵母或真菌的酶。认为后面的蛋白质甚至可更适用于本发明的方法，因为它们较不可能受到酶反馈调节等，而类似的来自植物的酶可受到所述调节。參与NAD补救合成途径的酶包括以下-畑酰胺酶(EC3. 5. 1. 19)，其催化烟酰胺的酰胺基水解，从而释放烟酸根和NH3。 该酶也已知为烟酰胺脱氨酶、畑酰胺酰胺酶、YNDase或烟酰胺酰胺水解酶；-烟酸盐/酯磷酸核糖基转移酶(EC2.4.2. 11)，其也已知为烟酸核糖核苷酸酶、 烟酸单核苷酸糖原水解酶；烟酸单核苷酸焦磷酸化酶；烟酸磷酸核糖基转移酶；其催化以下反应烟酸盐/酷-D-核糖核苷酸+ ニ磷酸盐=烟酸盐/酷+5-磷酸-α -D核糖1_ ニ磷酸盐-烟酸核苷酸腺苷酰基转移酶(EC2. 7. 7. 18)也已知为去酰胺-NAD+焦磷酸化酶； 烟酸单核苷酸腺苷酰基转移酶；去酰胺烟酰胺腺嘌呤二核苷酸焦磷酸化酶；NaMT-ATase ； 烟酸单核苷酸腺苷酰基转移酶；其催化以下反应ATP+烟酸核糖核苷酸=ニ磷酸盐+去酰胺基-NAD+-NAD-合酶(EC 6. 3. 1. 5)，也已知为NAD合成酶；NAD+合酶；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶；二磷酸吡啶核苷酸合成酶；其催化以下反应去酰胺基-NAD++ATP+NH3= AMP+ ニ磷酸盐 +NAD+在本发明的一个实施方案中，编码NAD补救合成途径的植物功能酶的DNA区可包含来自SEQ ID Noll、12、13、14或15的核苷酸序列或编码下述蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质具有与上述核苷酸序列所编码的蛋白质相似或相同的氨基酸序列。如Hunt等，2004所述，这些酶的植物同源物已被鉴定，且这些DNA序列可被用于相似的效应(Hunt等人，2004，New Phytologistl63 (I) :31-44)。经鉴定的DNA序列具有以下的登录号烟酰胺酶为 At5g23220(SEQ ID No 16) ；At5g23230 (SEQ ID No 17)和 At3gl6190(SEQ ID No 18)；烟酸盐 / 酯磷酸核糖基转移酶为 At4g36940 (SEQ ID No 19)、 At2g23420 (SEQ ID No20)，烟酸单核苷酸腺嘌呤基转移酶为 At5g55810 (SEQ ID No 21), NAD 合成酶为 Atlg55090(SEQ ID No 22)。然而，应当明白被改造为抗胁迫的植物也可包含这些核苷酸序列的变体，其包括插入、缺失和取代。同样的，可使用来自除酿酒酵母以外物种的所述核苷酸序列的同源物。 这些包括但不仅限于来自植物的核苷酸序列，和编码具有相同氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列，以及这类核苷酸序列的变体。所述核苷酸序列的变体与经鉴定的核苷酸序列(其编码来自NAD补救补救途径的酶，例如序列表中鉴别的序列)应具有优选至少约80 %，或85 %或90 %或95 %的序列同一性。优选这些变体将编码功能性蛋白质，其具有与来自NAD补救途径的酶相同的酶活性。阅读上文对胁迫耐受性增强转基因提高植物細胞、植物或种子对低氧或无氧条件耐受性的本发明用途的描述后，本领域技术人员会立刻明白可使用对应这类胁迫耐受性增强转基因的内源基因的变体获得相似的效应，所述变体使得带有这类变体的植物細胞或植物有更高的胁迫耐受性。举例而言，植物内源parp2基因的变体(其具有更低的表达水平， 并给具有该变体的植物提供提高的胁迫耐受性)可以以与降低内源parp2基因表达的转基因相似的方式使用。这类变体基因可通过育种技术被引入植物細胞或植物。本领域技术人员也会明白不同胁迫耐受性增强基因或转基因的表达可引起一群不同的事件，这显示不同的效应分布——从几乎没有效应到非常显著的效应。然而，本领域技术人员显然能够区分、鉴别或分离最适应需要的群体代表。另ー实施方案本发明提供用于促进植物根穿透进入生长培养基或土壌的方法，其包括对植物提供胁迫耐受性增强转基因或这些胁迫耐受性增强转基因的内源变体，如本文在其不同的实施方案中所述的那些。本文使用的“植物根伸长”或“植物根穿透进入生长培养基或土壌”是指从生长培养基表面到根的最低点所测量的根在固体生长培养基(包括土壌)中生长的深度(也參见图1)。
通常，“植物根伸长或穿透的提高”是指从培养基表面到根生长的最低点所测量的生长培养基中根生长深度的至少统计学显著的提高，其也可测量为野生型參照植物根深与被改造为胁迫耐受的植物根深的比较中的差异，或测量为用特別的化合物处理的植物根深与未处理植物根深的比较中的差异。为了正确理解本发明，明白以下内容是重要的通过本发明方法达到的植物根系更深地穿透进入生长培养基或土壌中不等于根系在体积或干重或鲜重上的提高。事实上， 根系的体积可被显著提高，但是根全部处在生长培养基或土壌表面下非常浅表处。相反，根据本发明处理的植物根在尺寸、体积、重量或甚至长度上可以是相等的，但是更深地伸入生长培养基或土壌的表面下。本文使用的“生长培养基”旨在涉及适用于植物生长的任何培养基，包括土壌。这类培养基包括固化的或凝胶化的液体，例如水-琼脂、泥炭(peat)、草炭(turf)、不同类型
的土壌等。在另ー实施方案中，本发明指向新烟碱类化合物提高植物細胞、植物或种子对低氧或无氧条件耐受性的用途。因此，本发明提供用来提高植物細胞、植物或种子对低氧或无氧条件耐受性的方法，其包括对植物細胞、植物、种子或植物的生境或对生长培养基使用有效量的式(I)的新烟碱类化合物的步骤。
权利要求
1.用于提高植物細胞或植物对低氧或无氧条件耐受性的方法，其包括步骤 a)对所述植物細胞或所述植物的細胞提供胁迫耐受性增强转基因；其中所述胁迫耐受性增强转基因选自1.能够降低植物内源PARP基因表达的胁迫耐受性增强转基因，特别是其中所述转基因编码PARP抑制性RNA分子； .能够降低植物内源PARG基因表达的胁迫耐受性增强转基因，特别是其中所述转基因编码PARG抑制性RNA分子；或iii.编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径的植物功能酶的胁迫耐受性增强转基因，所述酶选自烟酰胺酶、烟酸盐/酯磷酸核糖基转移酶、畑酸单核苷酸腺嘌呤基转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。
2.用于促进植物根穿透进入生长培养基的方法，其包括步骤a)对所述植物細胞或所述植物的細胞提供胁迫耐受性增强转基因；其中所述胁迫耐受性增强转基因选自i.能够降低植物内源PARP基因表达的胁迫耐受性增强转基因，特别是其中所述转基因编码PARP抑制性RNA分子； .能够降低植物内源PARG基因表达的胁迫耐受性增强转基因，特别是其中所述转基因编码PARG抑制性RNA分子；或iii.编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径的植物功能酶的胁迫耐受性增强转基因，所述酶选自烟酰胺酶、烟酸盐/酯磷酸核糖基转移酶、畑酸单核苷酸腺嘌呤基转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述胁迫耐受性增强基因编码PARP抑制性RNA分子。
4.根据权利要求3的方法，其中所述转基因包含以下有效连接的DNA片段a)植物可表达的启动子；b)编码PARP抑制性RNA分子的DNA区，其包含选自SEQID No 1的核苷酸序列、SEQ ID No 2的核苷酸序列、SEQ ID No 3的核苷酸序列、SEQ ID No 4的核苷酸序列、SEQ ID No 5的核苷酸序列或SEQ ID No 6的核苷酸序列的20个连续核苷酸中的至少19个；和c)转录终止和多聚腺苷酸化DNA区。
5.根据权利要求3的方法，其中所述转基因包含以下有效连接的DNA片段a)植物可表达的启动子；b)编码PARP抑制性RNA分子的DNA区，其包含选自SEQID No 1的核苷酸序列、SEQ ID No 2的核苷酸序列、SEQ ID No 3的核苷酸序列、SEQ ID No 4的核苷酸序列、SEQ ID No 5的核苷酸序列或SEQ ID No 6的核苷酸序列的互补序列的20个连续核苷酸中的至少 19个；和c)转录终止和多聚腺苷酸化DNA区。
6.根据权利要求3的方法，其中所述转基因包含以下有效连接的DNA片段a)植物可表达的启动子；b)编码PARP抑制性RNA分子的DNA区，所述RNA分子包含i.有义核苷酸序列，其包含选自SEQ ID No 1的核苷酸序列、SEQ IDNo 2的核苷酸序列、SEQ ID No 3的核苷酸序列、SEQ ID No 4的核苷酸序列、SEQ ID No 5的核苷酸序列或 SEQ ID No 6的核苷酸序列的20个连续核苷酸中的至少19个；和 .反义核苷酸序列，其包含与所述有义核苷酸序列中所述至少20个连续核苷酸互补的核苷酸序列，其中所述有义和反义核苷酸序列能够形成双链RNA区；以及c)转录终止和多聚腺苷酸化DNA区。
7.根据权利要求6的方法，其中所述反义核苷酸序列与所述有义核苷酸序列具有约 95 %的序列同一性或完全相同。
8.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述转基因编码ParG抑制性RNA分子。
9.根据权利要求8的方法，其中所述转基因包含以下有效连接的DNA片段a)植物可表达的启动子；b)编码PARG抑制性RNA分子的DNA区，其包含选自SEQID No7的核苷酸序列、SEQ ID No 8的核苷酸序列、SEQ ID No 9的核苷酸序列或SEQ ID No 10的核苷酸序列的20个连续核苷酸中的至少19个；和c)转录终止和多聚腺苷酸化DNA区。
10.根据权利要求8的方法，其中所述转基因包含以下有效连接的DNA片段a)植物可表达的启动子；b)编码PARG抑制性RNA分子的DNA区，其包含选自SEQID No7的核苷酸序列、SEQ ID No 8的核苷酸序列、SEQ ID No 9的核苷酸序列或SEQ ID No 10的核苷酸序列的互补序列的20个连续核苷酸中的至少19个；和c)转录终止和多聚腺苷酸化DNA区。
11.根据权利要求8的方法，其中所述转基因包含以下有效连接的DNA片段a)植物可表达的启动子；b)编码PARG抑制性RNA分子的DNA区，所述RNA分子包含i.有义核苷酸序列，其包含选自SEQ ID No 7的核苷酸序列、SEQ IDNo 8的核苷酸序列、SEQ ID No 9的核苷酸序列或SEQ ID No 10的核苷酸序列的20个连续核苷酸中的至少19个；和 .反义核苷酸序列，其包含与所述有义核苷酸序列中所述至少20个连续核苷酸互补的核苷酸序列，其中所述有义和反义核苷酸序列能够形成双链RNA区；和c)转录终止和多聚腺苷酸化DNA区。
12.根据权利要求11的方法，其中所述反义核苷酸序列与所述有义核苷酸序列具有约 95 %的序列同一性或完全相同。
13.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述转基因编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成途径的植物功能酶，所述酶选自烟酰胺酶、烟酸盐/酯磷酸核糖基转移酶、畑酸单核苷酸腺嘌呤基转移酶或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶。
14.根据权利要求13的方法，其中所述转基因包含下述核苷酸序列，所述核苷酸序列选自SEQ ID 11的核苷酸序列、SEQ ID 12的核苷酸序列、SEQ ID 13的核苷酸序列、SEQ ID 14的核苷酸序列、SEQ ID 15的核苷酸序列、SEQ ID 16的核苷酸序列、SEQ ID 17的核苷酸序列、SEQ ID 18的核苷酸序列、SEQ ID 19的核苷酸序列、SEQ ID 20的核苷酸序列、SEQID 21的核苷酸序列或SEQ ID 22的核苷酸序列。
15.根据权利要求1到14中任ー项的方法，其包括另ー步骤，即对所述植物或其生境， 或对所述植物的种子使用有效量的式(I)化合物
16.根据权利要求15的方法，其中所述式(I)化合物中由Het表示的所述杂环代表被氯取代的吡啶-3-基杂环。
17.权利要求16的方法，其中所述(I)式的化合物是吡虫啉或噻虫啉。
18.根据权利要求1到14中任ー项的方法，其还包括步骤将有效量的6-氯烟酸提供给所述植物的細胞。
19.用于提高植物細胞或植物对低氧或无氧条件耐受性的方法，其包括步骤将有效量的6-氯烟酸提供给所述植物細胞或植物。
20.用于促进植物根穿透进入生长培养基的方法，其包括步骤将有效量的6-氯烟酸提供给所述植物的細胞。
21.根据权利要求19或权利要求20的方法，其中通过对所述植物或其生境或对所述植物的种子使用有效量的式(I)化合物而对所述植物細胞或植物提供所述6-氯烟酸
22.根据权利要求21的方法，其中包含氯吡啶侧链的新烟碱类在植物降解过程中释放所述6-氯烟酸。
23.权利要求22的方法，其中所述新烟碱类是吡虫啉或噻虫啉。
24.根据权利要求19或权利要求20的方法，其中将所述6-氯烟酸直接应用于所述植物或其所述生境、所述植物細胞或所述种子。
25.以下物质用于促进植物根伸入生长培养基中的用途a)外源DNA，其包含胁迫耐受性增强转基因或对应于这类胁迫耐受性增强转基因的内源基因的变体，和/或b)6-氯烟酸或式(I)化合物
26.以下物质用于提高植物对低氧或无氧条件耐受性的用途a)外源DNA，其包含胁迫耐受性增强转基因或对应于这类胁迫耐受性增强转基因的内源基因的变体，和/或b) 6-氯烟酸或式(I)化合物
27.权利要求沈的用途，其中通过暴露于水涝、浸没或淹没将所述低氧或无氧条件带给所述植物。
全文摘要
本发明提供用于提高植物对低氧或无氧条件抗性的方法。这类方法可被用于促进植物根在生长培养基中或进入土壤中的穿透。本发明的方法可包括提供有胁迫耐受性基因的植物。可通过对植物使用化合物，包括新烟碱类化合物来获得相似的效应。
文档编号C12N15/11GK102533846SQ20121000363
公开日2012年7月4日 申请日期2006年6月6日 优先权日2005年6月15日
发明者M·德布洛克, M·梅茨拉夫 申请人:拜尔作物科学公司