专利名称：拟南芥DNA糖苷酶AtOGG1在提高种子寿命和萌发活力中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl在提高种子寿命和萌发活力中的应用。
背景技术：
种子作为农业生产的根本，其寿命和活力对于植物繁殖、作物产量、种质资源保存和生物多样性起着决定性的作用。成熟的干种子即使是在合适的贮藏条件下也会劣变，其程度随着贮藏时间的延长而加剧，并最终导致种子丧失活力，不能萌发。种子的劣变通常伴随着一系列生理生化上的变化，如DNA的损伤、脂质的过氧化和蛋白的损伤等。McDonald等认为，种子寿命受内在的遗传因子和外在的环境因素共同影响。尽管对于种子寿命和活力已经进行了大量的研究，但是对其确切的机理仍然不是十分清楚。农业生产上对种子质量的另外一个判断标准是种子在不利条件下的萌发活力，高质量的种子即使在逆境条件下仍能够保持高的萌发率和长出健壮的幼苗。关于种子劣变的原理，人们普遍接受的是自由基氧化学说，其中活性氧(Reactive Oxygen Species, R0S)被认为是导致种子劣变的一个重要因子。ROS能够将DNA、脂类和蛋白质过氧化，使得这三类生物大分子无法正常行使其在细胞中的功能，进而导致细胞的破裂和植物组织的损伤。为了应对由活性氧引起的氧化损伤，植物进化出了一套完整的抗氧化系统，包括酶促抗氧化系统和非酶促抗氧化系统。抗氧化系统效率的高低通常影响着种子的寿命和活力。例如，2004年，Sattler等证明维生素E对于维持种子的寿命和活力起着至关重要的作用。2008年，Oge等发现L型异天冬氨酸甲基转移酶参与种子的寿命和萌发活力。而超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶和抗坏血酸过氧化物酶等抗氧化酶也被证明与种子的寿命和活力有关(Bailly等，1996，2001 ;Lee等，2010)。DNA糖苷酶(OGGl)是一类能够将DNA中错配碱基切除的蛋白质，其参与碱基切除修复(base excision r印air，BER)过程。已有的研究表明，OGGl与动物的多种疾病和衰 ^ ; ) ^ (Jaiswal et al. , 2001; Osterod et al. , 2001; Shinmura and Yokota, 2001)。在模式植物拟南芥中，AtOGGl在种子发育后期脱水阶段和种子萌发前期吸水阶段表达大量上调，表明其可能跟种子成熟和萌发有很大的关系。种子脱水和吸水的过程中伴随着大量的ROS产生，进而导致DNA损伤和种子的衰老，AtOGGl能够参与BER途径修复DNA，因此其与种子衰老也有着密切的关系。种子在逆境条件下萌发同样会导致大量的ROS产生， 因此AtOGGl在种子萌发前期表达大量上调也与种子在不利条件下的萌发活力密切相关。
发明内容
本发明的目的在于提供拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl的新用途。本发明通过以下技术方案实现上述目的
研究发现，拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl具有提高种子寿命、萌发活力等功能，尤其是种子在胁迫环境如甲基紫精、高盐、甘露醇、高温等人工老化条件下的萌发活力。本发明主要通过制备含有拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl的转基因植物种子实现提高种子萌发活力的目的。具体制备方法如下
一种制备高萌发活力种子的方法，通过拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl的表达载体转化根癌农杆菌，转化的根癌农杆菌浸染植株后培养，收获的种子即为高萌发活力种子。所述拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl的表达载体是由AtOGGl的编码基因插入到真核表达载体PBI121构建而成，具体制备方法如下
(1)以拟南芥总RNA为模板，反转录得cDNA作为模板，以SEQID NO:广2所示序列为引物，扩增Jim^基因；
(2)以扩增的4扮你7基因为模板，以SEQID N0:3、所示序列为引物，扩增含酶切位点的*·基因片段；
(3)将含酶切位点的Jii^W基因片段与载体pGEMT-Easy进行连接，构建中间载体， 转化大肠杆菌DH5ci感受态，培养后挑取单克隆测序鉴定，提取鉴定正确的克隆的质粒，用 Sma I和fee I进行双酶切，回收小片段，与同样经过I和fee I进行双酶切的pBI121 载体连接，得到表达载体。本发明所述的拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl的基因序列在GenBank中的登录号为 NM-102020。根据获得的的序列信息，设计添加了酶切位点5 I和I的引物， 用PCR的方法从拟南芥叶片cDNA中扩增出4扮你7的开放读码框片段，然后将PCR产物连接入pGEMT-Easy载体，构建中间载体pGEMT-AtOGGl，转化大肠杆菌后，挑取单克隆测序鉴定。提取测序正确的克隆的质粒，用I和fee I酶切后回收小片段，连接入用同样酶消化的PBI121载体的大片段中，从而构建植物表达载体pBI121-At0GGl。将构建好的载体转化大肠杆菌，挑取单克隆测序鉴定。提取测序正确的克隆的质粒，电击法转化根癌农杆菌 EHA105，采用农杆菌介导的花序浸泡法转化拟南芥(Cb/O。通过卡那霉素筛选和叶片PCR 鉴定，获得转基因的阳性植株。继续培养直到获得T3代的转基因纯合子。利用Real-time PCR和Wfestern Blot证明J扮你7基因在转基因拟南芥种子中RNA水平和蛋白水平上都得到了大量表达。将拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl在水稻、小麦、玉米或大豆等多种农作物中高表达，有望提高作物种子的对损伤DNA的修复功能，并进一步提高种子的质量，本发明实施例以拟南芥CWY的种子为实验对象进行研究，以证明其功能。将筛选出的转基因种子和野生型种子，经过人工老化处理后，进行萌发实验。萌发实验结果显示转基因种子的萌发速度和最终萌发率都远高于野生型种子，转基因幼苗的生长状况明显好于野生型幼苗。上述结果表明Jii^似具有提高植物种子寿命和活力的能力。 将转基因和野生型种子在含有不同浓度的逆境胁迫因子(5- 200 μ M甲基紫精、75- 200 mM氯化钠和150- 600 mM甘露醇)的1/2 MS固体培养基上萌发，结果显示转基因种子的萌发速度和最终萌发率都明显高于对照的野生型种子，表明Jii^W能提高植物种子在逆境 (甲基紫精、高盐、甘露醇)胁迫下的萌发活力。将转基因和野生型种子经过50°C高温处理后在1/2 MS固体培养基上萌发，结果显示转基因种子的萌发速度和最终萌发率都明显高于对照的野生型种子，表明Jii^似能提高植物种子在高温胁迫下的萌发活力。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
4(1)证实了拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl能提高植物种子的寿命和在逆境(甲基紫精、高盐、甘露醇)胁迫下的萌发活力。(2)将似·转入到水稻、小麦、玉米和大豆等重要农作物中，则可提高重要农作物种子的贮藏寿命和活力。⑶AtOGGl的应用可降低全球每年因为种子劣变和逆境(甲基紫精、高盐、甘露醇、 高温)胁迫而造成的巨大农业损失，具有重要的经济效益和应用前景。
图1是植物表达载体pBI121-At0GGl的示图，RB 右边界，LB 左边界。图2是转基因拟南芥种子的Real-time PCR和flfestern Blot检测结果以及 8-oxo-dG含量测定结果，wt为野生型，OE-U 0E-2、0E-3分别是三个不同的转基因株系；A 为Real-time PCR的检测结果；B为flfestern Blot的检测结果，35kD是分子量大小，KD 千道尔顿，CBB 考马斯亮蓝染色)；C为8-oxo-dG含量测定结果。图3是人工老化处理1-7天的野生型和转基因拟南芥种子后的萌发结果和老化5 天后干种子和吸水24h的种子中8-oxo-dG含量测定结果图。A为人工老化处理1-7天后的种子播种后第7天的萌发结果，横坐标是老化处理天数，纵坐标是播种后第7天的萌发率。
表示野生型，·■▲表示不同的转基因株系；B为老化5天后干种子和吸水24h的种子中 8-oxo-dG含量测定，黑色矩形表示干种子，白色矩形表示吸水24h的种子。图4是人工老化处理5天后野生型和转基因拟南芥种子后的幼苗生长图。Wt表示野生型。0Ε-1、0Ε-2、0Ε-3分别是三个不同的转基因株系。图5是不同逆境处理条件下野生型和转基因拟南芥种子萌发结果图。A为甲基紫精处理后的种子播种后第8天的萌发结果；B为氯化钠处理后的种子播种后第8天的萌发结果横坐标是老化处；C为甘露醇处理后的种子播种后第8天的萌发结果；D为5(T52°C高温处理后的种子播种后第8天的萌发结果。横坐标是不同的逆境浓度，纵坐标是播种后第 8天后的萌发率。 表示野生型，··▲表示不同的转基因株系。
具体实施例方式实施例1拟南芥DNA糖苷酶蛋白基因Jii^似基因全长cDNA的克隆 (1)拟南芥叶片的准备野生型拟南芥种子萌发2周后，收集叶片。(2)总RNA的提取采用hvitrogen公司的Trizol产品提取总RNA。(3)获得 cDNA 采用 Takara 公司的 Primekript 1st Strand cDNA Synthesis Kit的说明书步骤反转录(2)中的RNA以获得cDNA。(4)获得基因全长cDNA 以获得的cDNA为模板，根据GenBank (登录号为 NM-102020)公布的序列设计引物，PCR扩增获得4扮你7基因，测序确认。PCR引物如下
正向引物:SEQ ID N0:1 5' - ACGGCGATGAAGAGACCTCGACCT- 3，； 反向引物:SEQ ID NO:2 5' - AATAACTACGCTCATTTGCCAGGG-3，。实施例2植物表达载体的构建 (1)基因片段的克隆
以实施例1所述的拟南芥Jii^W基因全长cDNA为模板，通过PCR克隆得到添加了酶切位点5 I和fee I的PCR片段。PCR引物如下，下划线部分为酶切位点 正向引物SEQ ID N0:3 :5，-TCCCCCGGGATGAAGAGACCTCGACCTAC-3‘； 反向引物SEQ ID N0:4 :5，-CGAGCTCTCATGGCTTCAACGTATCAC-3’。PCR反应体系为1基因，5 μ L dNTP(2. 5 mM),2 μ L MgCl2 1. 5 μ L 正向引物(10 μΜ)，1·5 PL 反向引物(10 μ Μ),5 μ L 10XPCR 缓冲液，1 μ L KOD plus 酶(Τ0Υ0Β0公司产品)，最后补充去离子水，使总体系为50 UL0 PCR的反应条件为94°C 5 分钟；然后进入如下循环94°C 30秒，60°C 45秒，72°C 70秒，共观个循环；最后72°C延伸10分钟。(2) T载体连接
取2 μ L PCR产物与pGEMT-Easy载体进行连接，按照Promega公司的说明书步骤进行操作，构建中间载体pGEMT-AtOGGl。(3)大肠杆菌转化
将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态(天根公司产品)，按照天根公司的产品说明书进行操作。在含有IPTG、X-gal和氨苄青霉素(100 mg/L)的LB固体培养基上涂板，37°C过夜培养后，挑取白色单菌落，在含有氨苄青霉素(100 mg/L)的LB液体培养基中生长，取少量菌液进行PCR鉴定。(4)细菌质粒DNA的制备
收集上述LB液体培养基中的菌体，按照天根公司的质粒小提试剂盒说明书制备细菌质粒DNA，酶切和测序鉴定。测序由广州hvitrogen公司完成。(5)表达载体构建
提取测序正确的克隆的质粒，按照iTakara公司的产品说明书，用5 I和fee I进行双酶切，然后回收小片段，连接入用同样酶消化的PBI121载体大片段中，构建植物表达载体 pBI121-At0GGl，示图如图1所示。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态，进行PCR、 酶切和测序鉴定。(6)根癌农杆菌的转化
提取测序正确的克隆的质粒，通过电击法转化根癌农杆菌ΕΗΑ105。实施例3拟南芥的遗传转化 1.拟南芥转化前处理
当拟南芥主苔长至5飞cm时，在花序基部剪掉整个花序，去其顶端优势，1周后在腋芽部位长出4飞个新生侧苔，待其侧苔花序形成花蕾并部分开花或形成广2个角果时，即可用于转化，转化前需剪去已长成的角果。转化的前一天给植物浇足水分，并罩一个塑料袋以保持高湿环境。2.浸染培养基的准备
用于浸泡拟南芥花絮的浸染培养基成分为含5% (质量)蔗糖的1/2MS培养基，pH=5. 8 (用IM KOH调节)，高压灭菌。用时添加0.02 °Γθ. 05 % (质量)表面活性剂Silwet L-77， 摇勻。3.农杆菌准备及拟南芥转化
(1)菌种的活化将储存的农杆菌液或平板保存的农杆菌在含卡那霉素(Km，100 mg/L )和利福平(Rif，30 mg/L)的YEB固体培养基上划板活化，并进行PCR检测。
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(2)挑取活化的含目的基因的单克隆阳性农杆菌至5 mL新鲜含卡那霉素和利福平的YEB液体培养基中，280C，180 rpm摇动培养M小时。(3)取上述菌液5 mL (1°/Γ2%)接至500 mL新鲜含卡那霉素和利福平的YEB液体培养基中，280C，180 rpm培养18 24小时，使OD600值达到0. 8左右(用YEB+Rif+Km作为空白对照)。(4)将上述菌液分装到100 mL离心管中，室温，5000 rpm离心20分钟收集菌体。(5)将收集的菌体悬浮在浸染培养基中，使最终菌体适宜浓度0D_值大约为 0. 8^1 (用浸染培养基作对照)。(6)将上述浸染液倒在烧杯中，将待转化的植物迅速倒扣在浸染液中，使花序浸没 60秒钟后取出。操作时尽量小心，不要让土屑等掉入到浸染培养基中。(7)转化后用吸水纸吸去过多的菌液，但不需要吸得太干。将植株平放，并用黑色塑料袋罩住拟南芥地上部分。保湿暗培养16 24h后，小心去掉塑料袋，并浇足水，恢复正常光照。(8)为了提高转化率，在一周以后重复一次浸染过程。(9)正常管理，收获成熟种子。收获后的种子在含有50 mg/L的卡那霉素和150 mg/L的羧苄青霉素的1/2 MS固体培养基上筛选转基因阳性植株。实施例4转基因种子的Real-time PCR检测
(1)总RNA的提取按照百泰克公司的植物通用RNA提取试剂盒说明书步骤提取野生型和不同的转基因株系的拟南芥干种子总RNA。(2)第一链 cDNA 的合成按照 Takara 公司的 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit的说明书步骤操作。(3) Real-time PCR 反应 AtOGGl基因特异引物
正向引物SEQ ID NO:5 :5' -TACAGAGCCAAATACATA ACAG-3‘； 反向引物SEQ ID N0:6 5' -TGCTACCTTCGGACCAAC-3‘。内参1 tin2基因引物
正向引物SEQ ID NO:7 :5' -ATTACCCGATGGGCAAGTCA-3‘； 反向引物SEQ ID NO:8 :5' -TGCTCATACGGTCAGCGATA-3‘。Real-time PCR的反应体系为1 μ L稀释30倍的第一链cDNA模板，IOyL SYBR Green ΜΙΧ(Τ0Υ0Β0 公司)，0. 4 yL 正向引物(10 μΜ)，0·4 yL 反向引物(10 μΜ)，最后补充去离子水，使总体系为20 UL0 PCR反应条件为95°C 5分钟，然后进入如下循环94°C 10秒，58°C 10秒，72°C 20秒，共40个循环。Real-time PCR反应共做3次生物重复，每个生物重复包含3次技术重复(/ =9)。以肌动蛋白2 (IiiM)为内参。Real-time PCR的结果如图2A所示，在3个不同的转基因株系种子中都能检测到4扮你7基因的表达相对于野生型拟南芥种子中有大幅度上升。实施例5转基因种子的Wfestern Blot检测
(1)原核表达以实施例2所述的中间载体pGEMT-AtOGGl为模板，通过PCR克隆得到添加了酶切位点&oR I和Xho I的PCR片段。PCR引物如下，下划线部分为酶切位点 正向引物SEQ ID NO:9 :5' -CCGGAATTCATGAAGAGACCTCGACCTAC-3‘；反向引物SEQ ID NO: 10:5' - CCGCTCGAGTCATGGCTTCAACGTATCAC-3‘。PCR反应体系为1基因，5 μ L dNTP(2. 5 mM),2 μ L MgCl2 1. 5 μ L 正向引物(10 μ Μ), 1.5 yL 反向引物(10 μ Μ),5 μ L 10XPCR 缓冲液，1 yL KOD plus 酶 (TOYOBO公司产品)，最后补充去离子水，使总体系为50 μ L0 PCR反应程序94°C 5分钟； 然后进入如下循环94°C 30秒，60°C 45秒，72°C 70秒，共观个循环；最后72°C延伸10 分钟。纯化后的PCR产物用I和Xho I酶切后，回收，连接入用同样酶消化的pET-14b (Novagen公司产品大片段)中，构建原核表达载体6His_At0GGl。然后转化大肠杆菌BL21 (DE3)，进行PCR、酶切和测序鉴定，方法与实施例2相同。蛋白的纯化按照Novagen公司的 His bind purification kit 说明书进行。(2)抗体制备上述纯化后的蛋白用于注射兔子制备特异性抗体anti-AtOGGl。(3)蛋白提取野生型和转基因拟南芥种子的蛋白提取参照Fan等(1997) (1997， Antisense suppression of phospholipase D [alpha] retards abscisic acid [mdash] and ethylene-promoted senescence of postharvest arabidopsis Leaves. The Plant Cell Online 9: 2183)的方法。(4)Western Blot :免疫印记参照Mizzen等(1996)(Mizzen, C.A.,et al. , 1996， Sensitive detection of metallothioneins—l, _2 and _3 in tissue homogenates by immunoblotting: a method for enhanced membrane transfer and retention. J. Biochem. Bioph. Meth. 32: 77-83)的方法。Western Blot 的结果如图 2B 所示，在三个不同的转基因株系种子中都能检测到AtOGGl蛋白的含量的表达相对于野生型拟南芥种子中有大幅度上升。实施例6转基因种子经人工老化处理后的萌发实验
(1)人工老化是在密闭容器中完成的。利用不同饱和盐溶液在不同温度条件下能够使密闭容器的空气保持固定的相对湿度的原理来进行老化处理。分别配制饱和的KCl和MgCl2 溶液，将含有1 L体积的过饱和的MgCl2溶液放置于2. 5 L体积的密闭容器中，然后将密闭容器放置于20°C (相对湿度33%)的培养箱中，平衡2天备用；将含有1 L体积的过饱和的 KCl溶液放置于2. 5 L体积的密闭容器中，然后将密闭容器放置在15°C (相对湿度85%)和 400C (相对湿度82%)的培养箱中备用，平衡2天。(2)将野生型和转基因的拟南芥种子用1. 5 mL的去掉盖子的离心管装好后(每管大约120粒)放置于离心管架上后迅速放入在15°C培养箱中已经平衡好的含有KCl过饱和溶液的密闭容器中，平衡三天，使所有种子的含水量达到一致。(3) 3天后，将平衡好的拟南芥种子取出，迅速放入在40°C培养箱中已经平衡好的含有KCl过饱和溶液的密闭容器中，处理广7天。(4)处理完成后，将拟南芥种子取出，迅速放入在20°C培养箱中已经平衡好的含有 MgCl2过饱和溶液的密闭容器中，平衡3天。(5 天后，取出拟南芥种子并马上进行消毒灭菌，4°C层积处理两天后进行萌发实验，统计萌发率及对幼苗的生长情况进行拍照。(6)人工老化后的种子萌发结果如图3所示，从老化2天后开始至老化7天的时间中转基因种子的萌发速度和最终的萌发率都远高于野生型的种子。老化5天后的种子在播种后第7天，野生型种子的萌发率仅为27%，而转基因株系的萌发率高达6(Γ75%。播种10天后的幼苗的生长情况如图4所示，转基因幼苗的子叶展开率和幼苗大小要明显好于野生型，表明过量表达基因能提高种子的寿命和活力。
实施例7 转基因种子的逆境胁迫萌发实验
野生型和转基因拟南芥种子在消毒灭菌后，放置于4°C层积处理两天。然后播种于含有不同浓度的逆境胁迫因子(5- 200 μ M甲基紫精、75- 200 mM氯化钠和150- 600 mM甘露醇)的1/2 MS固体培养基上萌发。统计每一天种子的萌发率，共计8天。将转基因和野生型拟南芥干种子直接放置于50°C的水中处理30分钟后播种于1/2MS固体培养基上的萌发统计每一天种子的萌发率，共计8天。情况如图5所示，转基因种子的萌发速度和最终的萌发率都远高于野生型的种子，表明过量表达基因能提高种子在多种逆境胁迫下萌发的活力。
权利要求
1.拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl在提高种子寿命和萌发活力中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl提高拟南芥种子在胁迫环境下的萌发活力。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述胁迫环境为人工老化环境。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述人工老化环境为甲基紫精、盐、甘露醇和/或最高52°C的高温胁迫环境。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于是通过制备含有拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl 的转基因植物种子实现提高种子萌发活力的目的。
6.一种制备高萌发活力种子的方法，其特征在于通过拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl的表达载体转化根癌农杆菌，转化的根癌农杆菌浸染植株后培养，收获的种子即为高萌发活力种子。
7.根据权利要求6所述制备高萌发活力种子的方法，其特征在于所述拟南芥DNA糖苷酶AtOGGl的表达载体制备方法如下(1)以拟南芥总RNA为模板，反转录得cDNA作为模板，以SEQID NO:广2所示序列为引物，扩增Jim^基因；(2)以扩增的4扮你7基因为模板，以SEQID N0:3、所示序列为引物，扩增含酶切位点的*·基因片段；(3)将含酶切位点的Jii^W基因片段与载体pGEMT-Easy进行连接，构建中间载体， 转化大肠杆菌DH5ci感受态，培养后挑取单克隆测序鉴定，提取鉴定正确的克隆的质粒，用 Sma I和fee I进行双酶切，回收小片段，与同样经过I和fee I进行双酶切的pBI121 载体连接，得到表达载体。
8.根据权利要求6所述制备高萌发活力种子的方法，其特征在于所述根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述种子为水稻、小麦、玉米、大豆或拟南 Jt Col-O的种子。
全文摘要
本发明公开了拟南芥DNA糖苷酶AtOGG1在提高种子寿命和萌发活力中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明通过构建AtOGG1的植物表达表达载体，制备含有AtOGG1的转基因植株，发现转基因拟南芥种子比野生型拟南芥种子具有更强的抵抗人工老化的能力和甲基紫精、盐、甘露醇和高温胁迫下的萌发活力。将AtOGG1转入到水稻、小麦、玉米和大豆等重要农作物中，也可能提高重要农作物种子的贮藏寿命和活力。AtOGG1的应用可降低全球每年因为种子劣变和多种逆境(氧化、盐、干旱和高温)胁迫而造成的巨大农业损失，在植物品种选育和农业生产领域具有广泛的应用前景，具有重要的经济效益。
文档编号C12N15/66GK102533815SQ20121000309
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者陈虎辉, 黄上志 申请人:中山大学