专利名称：榛子叶片和花芽总rna提取方法
技术领域：
本发明涉及一种从植物组织中提取总RNA的方法，特别涉及一种从富含多糖、多酚、蛋白质等次生代谢产物的植物组织中提取总RNA的方法。
背景技术：
榛属于榛科(Corylaceae)榛属(Corylus L)树种，是珍贵的木本粮油资源，榛仁含脂肪、蛋白质、碳水化合物、还含有维生素C、E和多种矿物质，榛子的果壳可以作为制造活性碳的原料。树皮和果苞含单宁，可制栲胶，榛子树叶、树皮和果仁中发现有抗癌物紫杉醇，具有很高的经济价值(张宇和，柳鎏，等.中国果树志[M].北京中国林业出版社.2005 :1148.聂洪超，孙万河，等.杂交榛子生产上存在的问题及发展建议[J].北方果树· 2010，(6) :46-47.)。近年来，随着分子生物学的日益普及，国内外也逐渐开始利用分子生物学手段SSR(魏鑫，魏永祥，王颖，等.平欧杂种榛ISSR反应体系的优化与验证[J].北方园 艺.2010, (4) 125-128. Kahraman Giircan, Shawn A. Mehlenbacher. Development ofmicrosatellite marker loci for European hazelnut (Corylus aveliana L.) from ISSRfragments[J], Mol Breeding. 2010, (26) :551-559.)、RAPD(Shawn A. Mehlenbacher, Rebecca N. Brown, Eduardo R. Nouhra, Tufan Giikirmak, Nahla V. Bassil, ThomasL. Kubisiak. A genetic linkage map for hazelnut(Corylus avellana L. )based on RAPD andSSR markers [J]. Genome. 2006，(49) :122-133.)、RT-PCR 以及免疫组织定位 (D. Rigola, Μ. Ε. Pe, Μ. Sari-Gorla. A cDNA clone from hazelnut(Corylus avellana L.) encoding a lowmolecular weight heat shock protein expressed in the reproductive structures [J], Sex PlantReprod. 1998, (11) J9-30.)等技术对榛子的物种遗传多样性、 亲缘关系、基因克隆、蛋白定位等进行研究。而从榛子中提取高质量的总RNA是进行这些研究的基础和关键。榛子叶片以及花芽富含多糖、多酚、蛋白质等次生代谢产物，多糖的很多理化性质与RNA相似，很难将其分开，而多酚易被氧化成褐色的醌类物质，会使RNA降解，RNase和多酚氧化酶都属于蛋白质，要获得完整的、高质量的总RNA就必须能够去除蛋白，次生代谢产物则易与RNA结合，阻碍RNA的分离。因此，去除多糖、蛋白和次生代谢物质、抑制多酚的氧化是榛子总RNA提取成败的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种从植物组织中提取总RNA的方法，该方法特别适用于从富含多糖、多酚、蛋白质等次生代谢产物的植物组织榛子中提取总RNA。本发明所提供的从植物组织中提取总RNA的方法称为改良CTAB法，包括如下步骤1)将植物组织样品与聚乙烯吡咯烷酮和维生素C混合后，再加入液氮研磨成粉末；所述植物组织样品、所述聚乙烯吡咯烷酮和所述维生素C的配比为 0. 2g 0. Olg 0. Olg ；2)将步骤1)得到的粉末加入到55-65°C的提取液中，55-65°C水浴lOmin，得到样
品混合液；所述提取液的溶剂为水(DEPC与水体积比为1 1000的DEPC水)，溶质为十六烷基三甲基溴化铵、Tris-Cl、乙二胺四乙酸、三盐酸亚精胺、聚乙烯咯烷酮(简写PVP，分子式(C6H9N0)n) ；Solarbio公司的，商品目录号是P^90，分子量:40000 ；纯度> 99% )、氯化钠、β-巯基乙醇；所述十六烷基三甲基溴化铵在所述提取液中的含量为每IOOml所述提取液中含有3g所述十六烷基三甲基溴化铵，所述Tris-Cl的终浓度为IOOmM(ρΗ8. 0)，所述乙二胺四乙酸的终浓度为25mM(pH8. 0)，所述三盐酸亚精胺在所述提取液中的含量为每 IOOml所述提取液中含有0. 05g所述三盐酸亚精胺，所述聚乙烯吡咯烷酮在所述提取液中的含量为每IOOml所述提取液中含有3g所述聚乙烯吡咯烷酮，所述氯化钠的终浓度为2M, 所述β-巯基乙醇的终浓度为体积百分含量5%。由于β-巯基乙醇易降解，在配制所述提取液时，巯基乙醇在所述提取液使用之前(水浴之后加入样品之前加到提取液中)加入。3)对步骤2)得到的样品混合液进行RNA的抽提和RNA的沉淀，得到总RNA ；所述抽提为用氯仿/异戊醇进行的抽提；所述氯仿/异戊醇是由氯仿与异戊醇按照M 1的体积比混合得到的混合物。在本发明的实施例中，所述植物样品具体为按照如下方法得到的样品将新鲜的的植物组织置于液氮中速冻后-80°C保存(抑制内源RNase的活性)，得到所述植物组织样
P
ΡΠ O所述氯仿/异戊醇在抽提体系中体积百分含量可为50%。步骤幻中所述RNA的沉淀包括用LiCl对所述RNA进行沉淀的步骤；所述LiCl在沉淀体系中的终浓度为2M。步骤3)中所述RNA的沉淀还包括用无水乙醇对所述RNA进行沉淀的步骤。在本发明的实施例中，所述RNA的抽提和所述RNA的沉淀具体包括如下步骤a)向所述样品混合液中加入等体积的所述氯仿/异戊醇，混勻，于4°C 12000r/min 离心lOmin，回收上清液；b)向步骤a)得到的上清液中加入等体积的所述氯仿/异戊醇，混勻，于4°C， 12000r/min离心lOmin，回收上清液；c)向步骤b)得到的上清液中加入LiCl，使其终浓度为2M，混勻后于4°C放置过夜，于4°C 12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；d)将步骤c)所得的RNA沉淀用75%乙醇清洗，得到总RNA的粗提物；e)将步骤d)得到的总RNA的粗提物用SSTE缓冲液溶解，加入等体积的所述氯仿/异戊醇，混勻，于4°C，12000r/min离心lOmin，回收上清液；所述SSTE缓冲液的溶剂为水(DEPC与水体积比为1 1000的DEPC水)，溶质为NaCl、十二烷基磺酸钠、Tris-Cl 和EDTA ；所述NaCl的终浓度为0. 5M，所述十二烷基磺酸钠在所述SSTE缓冲液中的含量为每IOOml所述SSTE缓冲液中含有0. 5g所述十二烷基磺酸钠，所述Tris-Cl的终浓度为 IOmM (ρΗ8. 0)，所述 EDTA 的终浓度为 ImM (ρΗ8. 0)。f)向步骤e)得到的上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，混勻，于_20°C放置,于 4°C 12000r/min 离心 30min，得到 RNA 沉淀；g)将步骤f)得到的RNA沉淀用75%乙醇洗两次，再用无水乙醇洗一次，自然干燥，溶于100 μ 1 DEPC水，得到所述总RNA。本发明的另一个目的是提供一种从植物组织中提取总RNA的提取液。本发明所提供的提取液的溶剂为水(DEPC与水体积比为1 1000的DEPC水)， 溶质为十六烷基三甲基溴化铵、Tris-Cl、乙二胺四乙酸、三盐酸亚精胺、聚乙烯吡咯烷酮、 氯化钠、β -巯基乙醇；所述十六烷基三甲基溴化铵在所述提取液中的含量为每IOOml所述提取液中含有3g所述十六烷基三甲基溴化铵，所述Tris-Cl的终浓度为IOOmM(pH8. 0)，所述乙二胺四乙酸的终浓度为25mM(pH8. 0)，所述三盐酸亚精胺在所述提取液中的含量为每 IOOml所述提取液中含有0. 05g所述三盐酸亚精胺，所述聚乙烯吡咯烷酮在所述提取液中的含量为每IOOml所述提取液中含有3g所述聚乙烯吡咯烷酮，所述氯化钠的终浓度为2M, 所述β-巯基乙醇的终浓度为体积百分含量5%。由于β-巯基乙醇易降解，在配制所述提取液时，β-巯基乙醇在所述提取液使用之前加入。所述植物组织可为富含多糖、多酚、蛋白质等次生代谢产物的植物组织。在本发明的实施例中，所述植物组织具体为榛子组织，如榛子的幼叶、雄花芽或成熟叶片。本发明所提供的改良CTAB法，提取液中3% (w/v)的CTAB可以使蛋白质变性凝聚，进一步用氯仿抽提去除蛋白质；提取液中β-巯基乙醇、PVP的浓度分别加大至5% (ν/ v)>3% (w/v)，还加入了 0.05% (w/v)三盐酸亚精胺，这抑制了酚类的氧化，并去除未氧化的酚类化合物；提取液中用了高浓度的NaCl，沉淀步骤使用了高浓度的LiCl将部分多糖留在上清液中，通过氯仿抽提可以除去一些多糖。这些试剂增强了榛子植物组织的裂解能力， 提供了还原条件，使RNase活性抑制和变性的物质强力抑制了多酚的氧化，在一定程度上去除蛋白、多糖的效果显然非常好，此法提到的总RNA产量也比较高。实验证明，与CTAB法和改良SDS法相比，本发明所提供的改良CTAB法更适合榛子总RNA的提取，所获得的榛子叶片和雄花芽总RNA完整性更好，检查得出纯度和产量更高以及蛋白、多糖和酚类物质去除也更加彻底。所获得的总RNA能够满足后续试验的需求，是一种比较理想的榛子幼叶和雄花芽总RNA提取方法，随着榛子叶片不断成熟，各种水解酶大量积累，多酚和多糖的含量也随之增加，因此榛子成熟叶片总RNA的提取难度更大，成熟叶片的效果较嫩叶和雄花芽稍差一些，但提取效果仍明显优于CTAB法和改良SDS法。
图1为榛子幼叶总RNA样品的电泳结果。其中，A为改良CTAB法提取结果(泳道 1-3为3个重复)；B为CTAB法提取结果(泳道1-2为2个重复)；C为改良SDS法提取结果(泳道1-2为2个重复)。图2为榛子雄花芽总RNA样品的电泳结果。其中，A为改良CTAB法提取结果(泳道1-3为3个重复)；B为CTAB法提取结果；C为改良SDS法提取结果(泳道1_2为2个重复)。图3为榛子成熟叶片总RNA样品的电泳结果。其中，A为改良CTAB法提取结果 (泳道1-2 ；B为CTAB法提取结果(泳道3-5为3个重复)；C为改良SDS法提取结果(泳道1-2为2个重复)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。溶液的配制(I)DEPC水1000ml超纯水中加入1000 μ 1焦碳酸二乙酯(DEPC)，摇勻，通风橱中过夜，第二天早上摇勻，121°C湿热灭菌lh，摇勻，冷却后备用，以下用到的所有溶液都需要用 0. (v/v) DEPC 水配制。(2) IM Tris-Cl (pH = 8. 0) 500ml 称 60. 5g Tris-Cl 溶于约 400ml DEPC 水中，浓盐酸调节PH至8. 0，定容至500ml。(3) 0. 5M EDTA (pH = 8. 0) 500ml 称取 93. 05g Na2EDTA · 2H20 禾口 IOgNaOH,溶于 350ml DEPC水，溶解后，用5M的NaOH (DEPC水溶液)调节pH至8. 0，定容至500ml。(4) 5M NaCl :146g NaCl 溶于 500ml DEPC 水中。(5) 10% SDS 500ml :50gSDS，溶解于 500ml DEPC 水中。(6) IOM LiCl 200ml :84. 8g 无水氯化锂溶于 200ml DEPC 水中。(7)改良CTAB的提取液终浓度为3% (w/v)的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、 终浓度为IOOmM Tris-Cl (pH8. 0)、终浓度为25mM的乙二胺四乙酸(EDTA) (pH8. 0)、终浓度为2M的NaCl、终浓度为3% (w/v)的聚乙烯吡咯烷酮(PVP) (Solarbio公司，商品目录号是 P^90，分子量40000 ；纯度> 99% )、终浓度为0. 05% (w/v)的三盐酸亚精胺、终浓度为 5% (体积百分含量)的巯基乙醇(易降解，使用时现加)。(8) SSTE缓冲液终浓度为0. 5Μ的NaCl、终浓度为0. 5% (w/v)的十二烷基磺酸钠(SDS)、终浓度为 IOmM 的 Tris-Cl (pH = 8. 0)、终浓度为 ImM 的 EDTA(pH = 8. 0)。(9) 10 X RNA上样缓冲液(IOXloading buffer)终浓度为60% (体积百分含量) 的甘油、终浓度为0.25% (w/v)的溴酚蓝、终浓度为IOmM的EDTA(pH = 8.0)、终浓度为 IOOmM 的 Tris-Cl (pH = 8. 0)，使用时用 DEPC 处理水稀释成 1 X loading buffer。(10) 10XTBE 称取 108g Tris, 7. 44g Nei2EDTA ·2Η20，55g硼酸，溶于 800ml 的 DEPC 水中，搅勻；用NaOH调节pH8. 3，DEPC处理水定容至1L，室温保存。使用时稀释成1XTBE。塑料制品和玻璃器皿的灭菌处理塑料制品和玻璃器皿都121 °C，高压灭菌60min，最好使用进口的枪头及离心管；电泳槽、制胶槽以及梳子用0. 5M EDTA和5M NaOH(0. 5M EDTA 500ul、5M NaOH 5ml、DEPC 水定容至 250ml)浸泡 2 小时，75% 乙醇冲洗， 晾干备用；用75%的乙醇拭擦移液枪内部和外部。24X1. 5/2ml离心管使用离心机型号Sorval Primo-R台式高速冷冻离心机； 6X50ml离心管使用离心机型号德国heraeus Bifuge Stratos全能台式高速离心机。实施例1、从榛子幼叶提取总RNA样品及其鉴定一、榛子幼叶总RNA样品的提取试验地设在位于北京市西郊鹜峰林场实验基地。2010年春季3月底，采集平欧杂交榛达维(育种代号84-2M)(张宇和，柳鎏，等.中国果树志板栗榛子卷[M].北京中国林业出版社.2005 :1-248.)带芽枝条带回室内得到水培幼叶。下面将详述如何利用改良CTAB法从榛子幼叶提取较高质量的总RNA样品，具体操作步骤如下1)采样2010年3月底采集榛子(平欧杂交榛达维，育种代号84_254)带芽枝条室内水培，一周后采集水培抽出的幼叶，将其经液氮速冻后立即置于-80°C冰箱中保存(液氮速冻的目的是抑制内源RNase的活性)，得到样品1 ；2)向50ml无菌离心管中加入IOml改良CTAB提取液，于65°C水浴锅中预热约 IOmin ；3)取约0. 2g步骤1)制备的样品1，置于预冷的研钵中，加入少量聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)和维生素C (PVP和维生素C各0. Olg)，用液氮充分研磨成粉，得到样品2 ；4)迅速将步骤3)研好的粉末(样品2)倒入步骤2)预热的改良CTAB提取液中， 65°C水浴lOmin，期间振荡1次，使其混勻，得到样品混合液3 ；5)向步骤4)得到的样品混合液3中加入等体积的氯仿异戊醇(氯仿/异戊醇体积比为24 1)，混勻，于40C 12000r/min离心IOmin,回收上清液；6)向步骤幻得到的上清液中加入等体积氯仿与异戊醇的体积比为M 1的氯仿 /异戊醇，混勻，于40C 12000r/min离心IOmin,回收上清液；7)向步骤6)得到的上清液中加入1/4体积的IOM的LiCl，混勻后于4°C放置过夜，于4°C 12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；8)将步骤7)所得的RNA沉淀用预冷的75%乙醇清洗，得到总RNA的粗提物；9)将步骤8)得到的总RNA的粗提物用SSTE缓冲液(如果用的是1. 2ml的离心管，加500ul即可；一般是加所用离心管的2/5体积即可)溶解，加入等体积的氯仿与异戊醇的体积比为M 1的氯仿/异戊醇混勻，于4°C 12000r/min离心lOmin，回收上清液；10)向步骤9)得到的上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，混勻，于_20°C放置 2h,于 4°C 12000r/min 离心 30min，得到 RNA 沉淀；11)将步骤10)得到的RNA沉淀用预冷的75%乙醇洗两次，再用预冷的无水乙醇洗一次，自然干燥5min(时间不宜太长，否则RNA不易溶解)，溶于100 μ 1 DEPC水，混勻， 于-80°C保存备用(可长期保存于2倍无水乙醇中)，总RNA样品不易降解。同时以CTAB法和改良SDS法作为对照。其中，所述CTAB法所用提取液配方为终浓度为2% (w/v)的CTAB ；终浓度为IOOmM的Tris-Cl ；终浓度为25mM的EDTA ；终浓度为 2% (w/v)的PVP ；终浓度为O. 05% (w/v)的三盐酸亚精胺；终浓度为2% (ν/ν)的β -巯基乙醇。具体的提取步骤如下(1) 1. 5ml无菌离心管中加入600 μ 1提取液于65°C水浴锅中预热15min ； (2)预冷研钵中放入0. Ig植物材料，加少量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和维生素 C(PVP和维生素C各0. Olg)，用液氮将0. Ig叶片研磨成细末；(3)迅粉速将研后的细末装到预热的提取液中，65°C水浴IOmin ； (4)加等量体积的氯仿异戊醇04 1)，振荡IOmin ； (5)4°C，12000r/min离心15min ； (6)取上清，加等量的氯仿异戊醇重复抽提，4°C，12000r/ min离心IOmin ； (7)收集上清液，加1/4体积IOM的LiCl，混勻，4°C过夜；(8) 4°C, 12000r/ min离心30min ;(9)弃上清，DEPC水溶解沉淀，加入等体积氯仿异戊醇抽提；(10)4°C， 12000r/min离心15min ； (11)收集上清，加2倍体积无水乙醇于_20°C或冰上中放置浊，沉淀总RNA ； (12)4°C 12000r/min离心30min ； (13)弃上清75%乙醇洗2次，无水乙醇冲洗一遍，超净台自然干燥15min ； (14)加入50 μ 1无RNAse的水溶解沉淀，_80°C保存备用。改良SDS法提取液的配方为终浓度为50mM的1Tris-HCl (ρΗ8. 0)，终浓度为0. 2M的NaCl ；终浓度为25mM的EDTA ；终浓度为4% (W/V)的SDS ；终浓度为3% (W/V)的PVP ；终浓度为15% (ν/ν)的乙醇；终浓度为5% (ν/ν)的β -巯基乙醇。具体的提取步骤如下(1) 取0. Ig叶片于研钵中，加少量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和维生素C(PVP和维生素C各O.Olg)， 加入液氮研磨成粉末状；⑵转入加有Iml 65°C预热的提取液中；(3)加入Iml酚氯仿 异戊醇05 24 1)，涡旋振荡混勻J4)4°C 12000r/min离心15min ;(5)取上清，加入等体积的氯仿异戊醇(24 1)，充分混勻；(6)4°C 12000r/min离心15min ;(7)取上清，加入 1/4 体积 IOM 的氯化锂，-20°C放置 2-3h 或 4°C过夜；(8)4°C 12000r/min 离心 30min ； (9)用 75%乙醇清洗，DEPC水溶解沉淀，加入等体积氯仿异戊醇04 1)抽提；(10) 4°C 120001·/ min离心15min ； (11)收集上清，加1/10体积3M NaAc和2. 5倍体积的无水乙醇，_20°C放置2-3h ;(12)4°C 12000r/min离心30min，弃上清，75%乙醇洗沉淀2次；(13)于通风橱中干燥后溶于50 μ 1无RNAse的水中，_80°C保存备用。二、榛子幼叶总RNA样品的鉴定利用1 %琼脂糖凝胶电泳检测总RNA提取好坏，主要依据^SrRNA与18SrRNA电泳谱带的特征。如果带型清晰且亮，28SrRNA亮度高于18SrRNA，且约是18SrRNA的2倍，则表明所提取到的总RNA量大、质量高、未降解。利用分光光度计检测所提取的总RNA样品的浓度和纯度，若0拟60/280在1. 8-2. 0之间，说明所提的总RNA较纯，无其他杂质的污染。1、榛子幼叶总RNA完整性的检测取1 μ 1上述步骤一提取的总RNA样品，进行琼脂糖凝胶IXTBE电泳检测。由图1所示，本发明所提供的改良CTAB法提取的榛子幼叶总RNA样品，点样孔干净，条带清晰，无拖尾，所提到的RNA较完整，且^SrRNA亮度是18SrRNA的2倍，说明提取过程中没有降解现象发生，而且在电泳检测中看不到蛋白质和多糖污染，所提的RNA纯净。而CTAB法提取的榛子幼叶总RNA，条带也比较清晰，28SrRNA亮度与18SrRNA相当，说明^SrRNA降解明显，条带有拖尾现象，DNA污染严重，有蛋白质、多糖等杂质污染，产量也较少；改良SDS法提取的榛子幼叶总RNA，不完整，28SrRNA降解明显，条带有拖尾，DNA、蛋白质、多糖等杂质污染严重。2、榛子幼叶总RNA浓度和纯度的检测上述步骤1以琼脂糖凝胶IXTBE电泳检测榛子幼叶总RNA完整性，其结果表明改良CTAB法提取榛子幼叶总RNA样品的效果比较好。以下为利用分光光度计检测上述步骤一改良CTAB法和改良SDS法各自提取的榛子幼叶总RNA样品的OD值，进一步比较这两种方法提取的产率和质量。结果如表1所示，改良CTAB法和改良SDS法所提取的幼叶的0皿60/280分别为 2. 04和1. 80，在1. 8-2. 0之间，说明这两种方法方法所提取的RNA纯度较高，DNA、蛋白质和多糖污染少。但是，在RNA产率上看，改良CTAB法(每克榛子幼叶提取Ml. 57 yg总RNA) 远比改良SDS法(每克榛子幼叶提取111. 8μ g总RNA)高。本实施例的结果表明，综合上述三种方法，改良CTAB法、CTAB法和改良SDS法都能从榛子幼叶中提取到总RNA，相比较而言，改良CTAB法所提的总RNA较完整，条带清晰，得到了较高质量的RNA ；同时改良CTAB法所提取的总RNA样品的产率也较高(每克榛子幼叶提取Ml. 57 μ g总RNA)，这说明本发明所提供的改良CTAB法适合于榛子幼叶总RNA的提取。实施例2、从榛子雄花芽提取总RNA样品及其鉴定
一、榛子雄花芽总RNA样品的提取试验地设在位于北京市西郊鹜峰林场实验基地。2010年8月，采集平欧杂交榛达维(育种代号84-2M)(张宇和，柳鎏，等.中国果树志板栗榛子卷[M].北京中国林业出版社.2005 1-248.)雄花芽。下面将详述如何利用改良CTAB法从榛子雄花芽提取较高质量的总RNA样品，具体操作步骤如下1)采样2010年7月初采集榛子(平欧杂交榛达维，育种代号84_254)雄花芽，将其经液氮速冻后立即置于-80°C冰箱中保存(抑制内源RNase的活性)，得到样品1 ；2)向50ml无菌离心管中加入IOml改良CTAB提取液，于65°C水浴锅中预热约 IOmin ；3)取约0. 2g步骤1)制备的样品1，置于预冷的研钵中，加入少量聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)和维生素C (PVP和维生素C各0. Olg)，用液氮充分研磨成粉，得到样品2 ；4)迅速将步骤3)研好的粉末(样品2)倒入步骤2)预热的改良CTAB提取液中， 65°C水浴lOmin，期间振荡1次，使其混勻，得到样品混合液3 ；5)向步骤4)得到的样品混合液3中加入等体积的氯仿与异戊醇的体积比为 24 1的氯仿/异戊醇，混勻，于4°C 12000r/min离心lOmin，回收上清液；6)向步骤幻得到的上清液中加入等体积氯仿与异戊醇的体积比为M 1的氯仿 /异戊醇，混勻，于40C 12000r/min离心IOmin,回收上清液；7)向步骤6)得到的上清液中加入1/4体积的IOM的LiCl，混勻后于4°C放置过夜，于4°C 12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；8)将步骤7)所得的RNA沉淀用预冷的75%乙醇清洗，得到总RNA的粗提物；9)将步骤8)得到的总RNA的粗提物用SSTE缓冲液(如果用的是1. 2ml的离心管，加500ul即可；一般是加所用离心管的2/5体积即可)溶解，加入等体积的氯仿与异戊醇(氯仿/异戊醇体积比为对1)，混勻，于4°C 12000r/min离心lOmin，回收上清液；10)向步骤9)得到的上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，混勻，于_20°C放置 2h,于 4°C 12000r/min 离心 30min，得到 RNA 沉淀；11)将步骤10)得到的RNA沉淀用预冷的75%乙醇洗两次，再用预冷的无水乙醇洗一次，自然干燥5min(时间不宜太长，否则RNA不易溶解)，溶于100 μ 1 DEPC水，混勻， 于-80°C保存备用(可长期保存于2倍无水乙醇中)，总RNA样品不易降解。同时以CTAB法和改良SDS法作为对照(具体方法同实施例1)。二、榛子雄花芽总RNA样品的鉴定利用1 %琼脂糖凝胶电泳检测总RNA提取好坏，主要依据^SrRNA与18SrRNA电泳谱带的特征。如果带型清晰且亮，28SrRNA亮度高于18SrRNA，且约是18SrRNA的2倍，则表明所提取到的总RNA量大、质量高、未降解。利用分光光度计检测所提取的总RNA样品的浓度和纯度，若O拟60/280在1. 8-2. O之间，说明所提的总RNA较纯，无其他杂质的污染。1、榛子雄花芽总RNA完整性的检测取1 μ 1上述步骤一提取的总RNA样品，进行1 %琼脂糖凝胶1 X TBE电泳检测。由图2所示，本发明所提供的改良CTAB法提取的榛子雄花芽总RNA样品，点样孔干净，条带清晰，无拖尾，所提到的RNA较完整，且^SrRNA亮度是18SrRNA的2倍，说明提取过程中没有
10降解现象发生，而且在电泳检测中看不到蛋白质和多糖污染，所提的RNA纯净；CTAB法提取的榛子雄花芽总RNA，条带也比较清晰，但是^SrRNA亮度与18SrRNA相当，说明^SrRNA降解明显，条带有拖尾现象，DNA污染严重，有蛋白质、多糖等杂质污染，产量也较少；改良SDS 法提取的榛子雄花芽总RNA，不完整，28SrRNA降解明显，条带有拖尾，DNA、蛋白质、多糖等杂质污染严重。2、榛子雄花芽总RNA浓度和纯度的检测上述步骤1以琼脂糖凝胶IXTBE电泳检测榛子雄花芽总RNA完整性，其结果表明改良CTAB法提取榛子雄花芽总RNA样品的效果相对比较好。以下为利用分光光度计检测上述步骤一改良CTAB法和改良SDS法各自提取的榛子雄花芽总RNA样品的OD值，进一步比较这两种方法提取的产率和质量。结果如表1所示，改良CTAB法和改良SDS法所提取的雄花芽的0拟60/280分别为 2. 01和1. 08，这说明，相比改良SDS法，改良CTAB法所提取的RNA纯度较高，DNA、蛋白质和多糖污染少。同时，在RNA产率上看，改良CTAB法(每克榛子雄花芽提取199. 53yg总 RNA)远比改良SDS法(每克榛子雄花芽提取60. Olyg总RNA)高。本实施例的结果表明，综合上述三种方法，改良CTAB法、CTAB法和改良SDS法都能从榛子雄花芽中提取到总RNA，相比较而言，改良CTAB法所提的总RNA较完整，条带清晰， 得到了较高质量的RNA ；同时改良CTAB法所提取的总RNA样品的产率也较高(每克榛子雄花芽提取199. 53 μ g总RNA)，这说明本发明所提供的改良CTAB法适合于榛子雄花芽总RNA 的提取。实施例3、从榛子成熟叶片提取总RNA样品及其鉴定一、榛子成熟叶片总RNA样品的提取试验地设在位于北京市西郊鹜峰林场实验基地。2010年8月，采集平欧杂交榛达维(育种代号84-2M)(张宇和，柳鎏，等.中国果树志板栗榛子卷[M].北京中国林业出版社· 2005 :1-248.)的成熟叶片。下面将详述如何利用改良CTAB法从榛子成熟叶片提取较高质量的总RNA样品，具体操作步骤如下1)采样采集榛子(平欧杂交榛达维，育种代号84-254)的成熟叶片，将其经液氮速冻后立即置于-80°C冰箱中保存(抑制内源RNase的活性)，得到样品1 ；2)向50ml无菌离心管中加入IOml改良CTAB提取液，于65°C水浴锅中预热约 IOmin ；3)取约0. 2g步骤1)制备的样品1，置于预冷的研钵中，加入少量聚乙聚烯吡咯烷酮(PVP)和维生素C (PVP和维生素C各0. Olg)，用液氮充分研磨成粉，得到样品2;4)迅速将步骤3)研好的粉末(样品2)倒入步骤2)预热的改良CTAB提取液中， 65°C水浴lOmin，期间振荡1次，使其混勻，得到样品混合液3 ；5)向步骤4)得到的样品混合液3中加入等体积的氯仿与异戊醇的体积比为 24 1的氯仿/异戊醇，混勻，于4°C 12000r/min离心lOmin，回收上清液；6)向步骤幻得到的上清液中加入等体积氯仿异戊醇(氯仿/异戊醇的体积比为 24 1)，混勻，于40C 12000r/min离心IOmin,回收上清液；7)向步骤6)得到的上清液中加入1/4体积的IOM的LiCl，混勻后于4°C放置过夜，于4°C 12000r/min离心30min，得到RNA沉淀；8)将步骤7)所得的RNA沉淀用预冷的75%乙醇清洗，得到总RNA的粗提物；9)将步骤8)得到的总RNA的粗提物用SSTE缓冲液(如果用的是1. 2ml的离心管，加500ul即可；一般是加所用离心管的2/5体积即可)溶解，加入等体积的氯仿与异戊醇的体积比为M 1的氯仿/异戊醇混勻，于4°C 12000r/min离心lOmin，回收上清液；10)向步骤9)得到的上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，混勻，于_20°C放置 2h,于 4°C 12000r/min 离心 30min，得到 RNA 沉淀；11)将步骤10)得到的RNA沉淀用预冷的75%乙醇洗两次，再用预冷的无水乙醇洗一次，自然干燥5min(时间不宜太长，否则RNA不易溶解)，溶于100 μ 1 DEPC水，混勻， 于-80°C保存备用(可长期保存于2倍无水乙醇中)，获得较纯的总RNA样品。同时以CTAB法和改良SDS法作为对照(具体方法同实施例1)。二、榛子成熟叶片总RNA样品的鉴定利用1 %琼脂糖凝胶电泳检测总RNA提取好坏，主要依据^SrRNA与18SrRNA电泳谱带的特征。如果带型清晰且亮，28SrRNA亮度高于18SrRNA，且约是18SrRNA的2倍，则表明所提取到的总RNA量大、质量高、未降解。利用分光光度计检测所提取的总RNA样品的浓度和纯度，若O拟60/280在1. 8-2. O之间，说明所提的总RNA较纯，无其他杂质的污染。1、榛子成熟叶片总RNA完整性的检测取1 μ 1上述步骤一提取的总RNA样品，进行琼脂糖凝胶IXTBE电泳检测。由图3所示，本发明所提供的改良CTAB法提取的榛子成熟叶片总RNA样品，点样孔干净，条带清晰，无拖尾，所提到的RNA较完整，且^SrRNA亮度是18SrRNA的2倍，说明提取过程中没有降解现象发生，而且在电泳检测中看不到蛋白质和多糖污染，所提的RNA纯净。而CTAB法提取的榛子成熟叶片总RNA，条带也比较清晰，28SrRNA亮度与18SrRNA相当，说明^SrRNA 降解明显，条带有拖尾现象，DNA污染严重，有蛋白质、多糖等杂质污染，产量也较少；改良 SDS法提取的榛子成熟叶片总RNA，不完整，28SrRNA降解明显，条带有拖尾，DNA、蛋白质、多糖等杂质污染严重。2、榛子成熟叶片总RNA浓度和纯度的检测上述步骤1以琼脂糖凝胶IXTBE电泳检测榛子成熟叶片总RNA完整性，其结果表明改良CTAB法提取榛子成熟叶片总RNA样品的效果比较好。以下为利用分光光度计 (紫外/可见分光光度计)检测上述步骤一改良CTAB法和改良SDS法各自提取的榛子成熟叶片总RNA样品的OD值，进一步比较这两种方法提取的产率和质量。结果如表1所示，改良CTAB法和改良SDS法所提取的成熟叶片的O拟60/280分别为2. 02和1.68，这说明改良CTAB法所提取的RNA纯度较高，DNA、蛋白质和多糖污染少。同时，在RNA产率上看，改良CTAB法(每克榛子成熟叶片提取116. 005 μ g总RNA)远比改良 SDS法(每克榛子成熟叶片提取94. 525 μ g总RNA)高。本实施例的结果表明，综合上述三种方法，改良CTAB法、CTAB法和改良SDS法都能从榛子成熟叶片中提取到总RNA，相比较而言，改良CTAB法所提的总RNA较完整，条带清晰，得到了较高质量的RNA ；同时改良CTAB法所提取的总RNA样品的产率也较高(每克榛子成熟叶片提取116. 005 μ g总RNA)，这说明本发明所提供的改良CTAB法适合于榛子成熟叶片总RNA的提取。
表1两种提取方法提取榛子总RNA紫外吸收结果
权利要求
1.从植物组织中提取总RNA的方法，包括如下步骤1)将植物组织与聚乙烯吡咯烷酮和维生素C混合后，再加入液氮研磨成粉末；所述植物组织、所述聚乙烯吡咯烷酮和所述维生素C的配比为0.2g O.Olg O.Olg；2)将步骤1)得到的粉末加入到55-65°C的权利要求6所述提取液中，55-65°C保温 lOmin，得到样品混合液；3)对步骤2、得到的样品混合液进行RNA的抽提和RNA的沉淀，得到总RNA；所述抽提为用氯仿/异戊醇进行的抽提；所述氯仿/异戊醇是由氯仿与异戊醇按照M 1的体积比混合得到的混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述氯仿/异戊醇在抽提体系中体积百分含量为50%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中所述RNA的沉淀包括用LiCl对所述RNA进行沉淀的步骤；所述LiCl在沉淀体系中的终浓度为2M。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于步骤幻中所述RNA的沉淀还包括用无水乙醇对所述RNA进行沉淀的步骤。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述RNA的抽提和所述RNA的沉淀包括如下步骤a)向所述样品混合液中加入等体积的所述氯仿/异戊醇，混勻，于4°C12000r/min离心lOmin，回收上清液；b)向步骤a)得到的上清液中加入等体积的所述氯仿/异戊醇，混勻，于4°C，12000r/ min离心IOmin,回收上清液；c)向步骤b)得到的上清液中加入LiCl，使其终浓度为2M，混勻后于4°C放置过夜，于 40C 12000r/min 离心 30min，得到 RNA 沉淀；d)将步骤c)所得的RNA沉淀用75%乙醇清洗，得到总RNA的粗提物；e)将步骤d)得到的总RNA的粗提物用SSTE缓冲液溶解，加入等体积的所述氯仿/异戊醇，混勻，于4°C，12000r/min离心lOmin,回收上清液；f)向步骤e)得到的上清液中加入2倍体积预冷的无水乙醇，混勻，于-20°C放置池，于 40C，12000r/min 离心 30min，得到 RNA 沉淀；g)将步骤f)得到的RNA沉淀用75%乙醇洗两次，再用无水乙醇洗一次，自然干燥，溶于100 μ 1 DEPC水，得到所述总RNA0
6.从植物组织中提取总RNA的提取液，其特征在于所述提取液的溶剂为水，溶质为十六烷基三甲基溴化铵、Tris-Cl、乙二胺四乙酸、三盐酸亚精胺、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、 β -巯基乙醇；所述十六烷基三甲基溴化铵在所述提取液中的含量为每100ml所述提取液中含有3g所述十六烷基三甲基溴化铵，所述Tris-Cl的终浓度为IOOmM,所述乙二胺四乙酸的终浓度为25mM，所述三盐酸亚精胺在所述提取液中的含量为每100ml所述提取液中含有0. 05g所述三盐酸亚精胺，所述聚乙烯吡咯烷酮在所述提取液中的含量为每100ml所述提取液中含有3g所述聚乙烯吡咯烷酮，所述氯化钠的终浓度为2M，所述β-巯基乙醇的终浓度为体积百分含量5%。
7.根据权利要求1-5中任一所述的方法，或权利要求6所述提取液，其特征在于所述植物组织为榛子组织。
8.根据权利要求7所述方法或所述提取液，其特征在于所述植物组织为榛子的幼叶、 雄花芽或成熟叶片。
全文摘要
本发明公开了一种从植物组织中提取总RNA的方法。本发明所提供的方法包括如下步骤1)将植物组织与PVP和维生素C混合后，再加入液氮研磨成粉末；所述植物组织、所述PVP和所述维生素C的配比为0.2g∶0.01g∶0.01g；2)将步骤1)得到的粉末加入到55-65℃的提取液中，55-65℃保温10min，得到样品混合液；3)对步骤2)得到的样品混合液进行RNA的抽提和RNA的沉淀，得到总RNA；所述抽提为用氯仿/异戊醇进行的抽提。所述提取液含有3％的CTAB、100mM的Tris-c1(pH8.0)、25mM的EDTA(pH8.0)、2M的NaCl、5％的β-巯基乙醇、3％的PVP、0.05％的三盐酸亚精胺等。实验证明，本发明所提供的方法能够从植物组织，如榛子的幼叶、雄花芽或成熟叶片中提取得到高质量的总RNA。
文档编号C12N15/10GK102424825SQ20121000300
公开日2012年4月25日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者侯智霞, 孟晓庆, 张兰, 苏淑钗 申请人:北京林业大学