专利名称：一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法
技术领域：
本发明属于草酸脱羧酶的制备领域，特别涉及一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法。
背景技术：
草酸脱羧酶可以催化草酸脱羧形成甲酸和二氧化碳，因此在酶法检测草酸含量， 降解工业废水中草酸盐，制备低草酸含量食品以及降低人体内草酸浓度等方面具有广阔的应用前景。彩绒革盖菌作为生产草酸脱羧酶的重要菌种，如何降低其培养成本，大量生产菌丝体，并诱导菌丝体合成草酸脱羧酶是一项重要课题。由于碳元素是生物体内含量最多的元素，因此碳源是培养基中用量最大的一种，占生物产品总成本的比例较高，所以通过利用低成本碳源替代目前使用的纯净葡萄糖能大幅度降低微生物的培养成本。菊芋，又名洋姜，是一种菊科向日葵属宿根性草本植物。菊芋栽培对土质和环境要求较低，耐寒耐旱能力强，繁殖能力强，耐储存，利于大面积栽培。我国现在菊芋主要用途为腌制咸菜食用，导致经济价值较低，不能大面积推广栽培。菊芋中富含菊糖等多糖，采用浸提的方式提取菊芋汁内菊糖等营养物质，制成菊芋汁培养基培养彩绒革盖菌制备草酸脱羧酶，可以降低产酶成本提高菊芋经济附加值，具有很好的经济效益。与菊芋具有类似营养成分的植物还有菊苣和大丽花，也可以制成培养基培养彩绒革盖菌制备草酸脱羧酶。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，该方法工艺简单，成本低，效率高；底物诱导产草酸脱羧酶不受抑制，产酶量稳定。本发明的一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，包括(1)将菊芋在105°C汽蒸15-30min，然后按照1 1_1 10的质量比加水，勻浆得到菊芋浆；在30-120°C下浸提0. 5-3h，过滤，离心，得到菊芋汁；(2)将上述菊芋汁稀释至7-100g/L的总糖量，补加氮源和无机盐获得发酵培养基，调节PH值至4. 0-5. 0，灭菌后备用；(3)以3-15%的接种量将彩绒革盖菌的菌丝体种子液接入发酵培养基，在 10-30°C和100-250rpm条件下培养2-6天；(4)待菌丝球形成时，加入终浓度为I-IOOmM的草酸诱导产生草酸脱羧酶，培养
0.5-6天后获取菌丝体；(5)将上述菌丝体经破碎或冷冻后破碎，然后用0. 2M、pH 3. 7的醋酸缓冲液提取菌丝碎片，去除残渣，即得草酸脱羧酶粗酶液。所述步骤O)中的发酵培养基中组分为总糖为7_10(^的菊芋汁，3.(^蛋白胨，
1.OgKH2PO4,0. 2g Na2HPO4 · 12H20，0. 5g MgSO4 · 7H20 以及微量元素 1ml，以水定容至 1L。所述步骤(3)中的菌丝体种子液的培养基组分为7_5(^葡萄糖，3.(^蛋白胨，1. OgKH2PO4,0. 2g Na2HPO4 · 12Η20，0· 5g MgSO4 · 7Η20 以及微量元素 1ml，以水定容至 1L，。所述微量元素的组分为=FeSO4· 7H20 10g, MnSO4 · H2O 1. 0g, ZnSO4 · 7H20 1. 0g, CuSO4 · 5H20 2. 0g, CaCl2 · 2H20 13g，用水定容至 IL0所述步骤中的草酸加入方式为间歇式、分批补料式或连续式。所述步骤(5)中的破碎方式为研磨破碎、珠磨破碎、均质机破碎或超声破碎。所述步骤(1)中的菊芋为菊芋、菊苣、大丽花块茎等富含果聚糖的植物。所述步骤(1)中的菊芋汁可以被果聚糖或者果糖替代。本发明通过浸提菊芋汁获得培养彩绒革盖菌生长的碳源，并用底物草酸诱导菌丝体合成草酸脱羧酶。有益效果(1)本发明利用浸提菊芋汁作为发酵培养彩绒革盖菌的碳源，方法简单，易于操作；(2)本发明使用的菊芋产量大，成本低，作为生产碳源的原料价格低廉；且碳源的制备可控性强，含糖量稳定；(3)与传统培养基碳源——葡萄糖相比，以该低值碳源生产彩绒革盖菌获得的菌丝体生物量大，是葡萄糖碳源的5倍以上，转化率高；(4)与传统培养基相比，以该低值碳源培养菌体时，底物诱导产草酸脱羧酶不受抑制，产酶量稳定。
图1为菊芋汁培养基(初始pH 5. 0)生产的菌丝体干重随发酵时间的变化；图2为不同糖浓菊芋汁培养基对菌丝体干重的影响；图3为不同糖浓菊芋汁培养基的转化率；图4为以草酸诱导菊芋汁培养基(初始pH 5.0)生产的菌丝合成草酸脱羧酶的结果；图5为以草酸诱导菊芋汁培养基(初始pH 5. 0)生产的菌丝合成草酸脱羧酶后的总糖含量变化。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1 菊芋汁生产彩绒革盖菌(培养基初始pH值5. 0) 将新鲜菊芋在105°C汽蒸15min，然后按照1 1的质量比加水，勻浆得到菊芋浆。该菊芋浆在80°C下浸提lh，经过2层纱布过滤，SOOOr/min离心lOmin，得到菊芋汁， 用苯酚硫酸法测定菊芋汁的总糖含量(以葡萄糖为标准糖计)，4°C条件下储存备用。每 50mL发酵培养基中加入含Ig总糖(以葡萄糖计)的菊芋汁，再加入0. 15g蛋白胨，0.05g磷酸二氢钾，0.025g MgSO4 ·7Η20，0· Olg Na2HPO4 · 12Η20，以及微量元素50 μ L(微量元素配方为FeS04 · 7H20 10g/L, MnSO4 · H2O 1. Og/L, ZnSO4 · 7H20 1. Og/L, CuSO4 · 5H20 2. Og/L, CaCl2 · 2H20 13g/L)。培养基配制完成后，用硫酸和氢氧化钠调节初始pH值至5. 0，灭菌后备用。取一块琼脂平板菌种，用打孔器打下直径约IOmm含菌丝体的固体培养基薄片，取 2-3片加入液体种子培养基，30°C静置4-6天。待菌丝体在培养基上方形成白色菌盖但尚未完全浮出液面，全部移入装有玻璃珠的容器，进行震荡破碎，获得含有菌丝碎片的悬浊液。 将混勻的菌悬液按8vol %的接种量接入发酵培养基中，培养1-5天，称取菌丝体绝干重。发现菊芋汁培养基的菌丝体产量高于对照培养基(葡萄糖)菌丝体产量，约高4-5倍，且处于上升趋势(见图1)。实施例2菊芋汁生产彩绒革盖菌(培养基初始PH值5. 0)将新鲜菊芋在105°C汽蒸20min，然后按照1 5的质量比加水，勻浆得到菊芋浆。 该菊芋浆在90°C下浸提1. 5h，经过2层纱布过滤，SOOOr/min离心lOmin，得到菊芋汁，用苯酚硫酸法测定菊芋汁的总糖含量(以葡萄糖为标准糖计)，4°C条件下储存备用。每50mL 发酵培养基中加入含0.35g总糖(以葡萄糖计)的菊芋汁，再加入0. 15g蛋白胨，0.05g磷酸二氢钾，0.025g MgSO4 · 7Η20，0· Olg Na2HPO4 · 12Η20，以及微量元素 50 μ L(微量元素配方为FeS04 · 7H20 10g/L, MnSO4 · H2O 1. 0g/L, ZnSO4 · 7H20 1. Og/L, CuSO4 · 5H20 2. Og/L, CaCl2 · 2H20 13g/L)。培养基配制完成后，用硫酸和氢氧化钠调节初始pH值至5. 0，灭菌后备用。取一块琼脂平板菌种，用打孔器打下直径约IOmm含菌丝体的固体培养基薄片，取 2-3片加入液体种子培养基，30°C静置4-6天。待菌丝体在培养基上方形成白色菌盖但尚未完全浮出液面，全部移入装有玻璃珠的容器，进行震荡破碎，获得含有菌丝碎片的悬浊液。 将混勻的菌悬液按3vol %的接种量接入发酵培养基中，培养1-5天，称取菌丝体绝干重。发现菌丝体产量的变化趋势与实施例1类似，同样高于对照培养基(葡萄糖)菌丝体产量，且处于上升趋势。实施例3菊芋汁生产彩绒革盖菌(培养基初始pH值5. 0)将新鲜菊芋在105°C汽蒸30min，然后按照1 10的质量比加水，勻浆得到菊芋浆。该菊芋浆在110°c下浸提2h，经过2层纱布过滤，SOOOr/min离心lOmin，得到菊芋汁， 用苯酚硫酸法测定菊芋汁的总糖含量(以葡萄糖为标准糖计)，4°C条件下储存备用。每 50mL发酵培养基中加入含l_4g总糖(以葡萄糖计)的菊芋汁，再加入0. 15g蛋白胨，0. 05g 磷酸二氢钾，0.025g MgSO4 ·7Η20，0· Olg Na2HPO4 · 12Η20，以及微量元素50 μ L(微量元素配方为FeS04 · 7H20 10g/L, MnSO4 · H2O 1. 0g/L, ZnSO4 · 7H20 1. Og/L, CuSO4 · 5H20 2. Og/L, CaCl2 · 2H20 13g/L)，配制成含菊芋汁20、40和80g/L的发酵培养基。培养基配制完成后， 用硫酸和氢氧化钠调节PH值至5. 0，灭菌后备用。取一块琼脂平板菌种，用打孔器打下直径约IOmm含菌丝体的固体培养基薄片，取 2-3片加入液体种子培养基，30°C静置4-6天。待菌丝体在培养基上方形成白色菌盖但尚未完全浮出液面，全部移入装有玻璃珠的容器，进行震荡破碎，获得含有菌丝碎片的悬浊液。将混勻的菌悬液按15ν01%的接种量接入发酵培养基中，培养1-5天，称取菌丝体绝干重。 结果见图2和图3，结果发现菌丝体产量的变化趋势与实施例1类似，同样高于对照培养基 (葡萄糖)菌丝体产量，且80g/L的干重高于20g/L和40g/L的干重。图3表明40g/L菊芋培养基的糖转化率最高，是优选浓度。实施例4菊芋汁生产菌丝体并诱导合成草酸脱羧酶(培养基初始PH值5. 0)任取实施例1 3培养2 6天的菌丝，加入终浓度为5-100mM的草酸，诱导0. 5-6 天后，收取菌丝体，保存发酵液，将菌丝体液氮冷冻研磨破碎后，用0. 2M, pH 3. 7的醋酸缓冲液提取菌丝碎片，离心去除残渣，上清即为粗酶液。残渣烘至绝干称重，上清测定草酸脱羧酶活力(图4)，发酵液测定残留总糖浓度(图幻。对照组采用葡萄糖培养基，培养方法相同。图4结果显示菊芋汁培养的菌丝合成的草酸脱羧酶的活力是葡萄糖培养的5倍以上。图5显示菊芋汁培养的菌丝对草酸的加入不敏感，糖能继续被消耗，代谢能力明显比葡萄糖培养的菌丝强。实施例5菊苣汁生产彩绒革盖菌(培养基初始pH值5. 0)将新鲜菊苣在105°C汽蒸15min，然后按照1 1的质量比加水，勻浆得到菊苣浆。该菊苣浆在80°C下浸提lh，经过2层纱布过滤，SOOOr/min离心lOmin，得到菊苣汁， 用苯酚硫酸法测定菊苣汁的总糖含量(以葡萄糖为标准糖计)，4°C条件下储存备用。每 50mL发酵培养基中加入含Ig总糖(以葡萄糖计)的菊苣汁，再加入0. 15g蛋白胨，0.05g 磷酸二氢钾，0.025g MgSO4 ·7Η20，0· Olg Na2HPO4 · 12Η20，以及微量元素50 μ L(微量元素配方为FeS04 · 7H20 10g/L, MnSO4 · H2O 1. Og/L, ZnSO4 · 7H20 1. Og/L, CuSO4 · 5H20 2. Og/L, CaCl2 · 2H20 13g/L)。培养基配制完成后，用硫酸和氢氧化钠调节初始pH值至5. 0，灭菌后备用。取一块琼脂平板菌种，用打孔器打下直径约IOmm含菌丝体的固体培养基薄片，取 2-3片加入液体种子培养基，30°C静置4-6天。待菌丝体在培养基上方形成白色菌盖但尚未完全浮出液面，全部移入装有玻璃珠的容器，进行震荡破碎，获得含有菌丝碎片的悬浊液。 将混勻的菌悬液按8vol %的接种量接入发酵培养基中，培养1-5天，称取菌丝体绝干重。发现菊苣汁培养基的菌丝体产量高于对照培养基(葡萄糖)菌丝体产量，约高4倍，且处于上升趋势，结果类似于图1。
权利要求
1.一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，包括(1)将菊芋在105°c汽蒸15-30min，然后按照1 1_1 10的质量比加水，勻浆得到菊芋浆；在30-120°C下浸提0. 5-3h，过滤，离心，得到菊芋汁；(2)将上述菊芋汁稀释至7-100g/L的总糖量，补加氮源和无机盐获得发酵培养基，调节pH值至4. 0-5.0，灭菌后备用；(3)以3-15ν01%的接种量将彩绒革盖菌的菌丝体种子液接入发酵培养基，在10-30°C 和100-250rpm条件下培养2_6天；(4)待菌丝球形成时，加入终浓度为I-IOOmM的草酸诱导产生草酸脱羧酶，培养0.5-6 天后获取菌丝体；(5)将上述菌丝体经破碎或冷冻后破碎，然后用0.2M、pH 3. 7的醋酸缓冲液提取菌丝碎片，去除残渣，即得草酸脱羧酶粗酶液。
2.根据权利要求1所述的一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，其特征在于所述步骤O)中的发酵培养基中组分为总糖为7-10(^的菊芋汁，3.(^蛋白胨， 1. Og KH2PO4,0. 2g Na2HPO4 · 12Η20，0· 5g MgSO4 · 7H20 以及微量元素 1ml，以水定容至 1L。
3.根据权利要求1所述的一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，其特征在于所述步骤C3)中的菌丝体种子液的培养基组分为7-50g葡萄糖，3. Og蛋白胨，1. Og KH2PO4,0. 2g Na2HPO4 · 12Η20，0· 5g MgSO4 · 7H20 以及微量元素 lml,以水定容至 1L，。
4.根据权利要求2或3所述的一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法， 其特征在于所述微量元素的组分为=FeSO4 ·7Η20 10g，MnSO4 .H2O 1. 0g，ZnSO4 ·7Η20 1. 0g, CuSO4 · 5Η20 2. 0g, CaCl2 · 2Η20 13g，用水定容至 IL0
5.根据权利要求1所述的一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，其特征在于所述步骤中的草酸加入方式为间歇式、分批补料式或连续式。
6.根据权利要求1所述的一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，其特征在于所述步骤(5)中的破碎方式为研磨破碎、珠磨破碎、均质机破碎或超声破碎。
全文摘要
本发明涉及一种菊芋碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，包括(1)浸提菊芋汁；(2)将上述菊芋汁稀释至7-100g/L的总糖量，补加氮源和无机盐获得发酵培养基，调节pH值至4.0-5.0，灭菌后备用；(3)以3-15vol％的接种量将彩绒革盖菌的菌丝体种子液接入发酵培养基培养2-6天；(4)待菌丝球形成时，加入终浓度为1-100mM的草酸诱导产生草酸脱羧酶，培养0.5-6天后获取菌丝体；(5)将上述菌丝体经冷冻后破碎，然后用醋酸缓冲液提取菌丝碎片，去除残渣，即得草酸脱羧酶粗酶液。本发明工艺简单，成本低，效率高；底物诱导产草酸脱羧酶不受抑制，产酶量稳定。
文档编号C12R1/645GK102533707SQ20121000291
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者宫搏阳, 杨雪霞, 洪枫 申请人:东华大学