专利名称：麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法
技术领域：
本发明属草酸脱羧酶的制备领域，特别是涉及一种麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导
草酸脱羧酶的方法。
背景技术：
草酸脱羧酶可以催化草酸脱羧形成甲酸和二氧化碳，因此在酶法检测草酸含量，
降解工业废水中草酸盐，制备低草酸含量食品以及降低人体内草酸浓度等方面具有广阔的
应用前景。彩绒革盖菌作为生产草酸脱羧酶的重要菌种，如何降低其培养成本，大量生产菌
丝体，并诱导菌丝体合成草酸脱羧酶是一项重要课题。由于碳元素是生物体内含量最多的
元素，因此碳源是培养基中用量最大的一种，占生物产品总成本的比例较高，所以通过利用
低成本碳源替代目前使用的纯净葡萄糖能大幅度降低微生物的培养成本。 秸秆是农作物收割后的剩余物，作为农业生产的副产品，农村中每年大量的秸秆
主要用来烧火，或者粉碎后给家畜做饲料用。虽然焚烧后的秸秆可以撒在田里作为肥料，但
在焚烧过程中产生的气体会导致温室效应的增加，而且产生的烟尘也会造成空气污染。所
以，将秸秆水解后获得的水解液来作为培养工业微生物的碳源，不仅可以降低微生物培养
成本，减轻焚烧对环境的污染，而且提高了秸秆应用附加值，具有重大的经济效益和环境效
.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧 酶的方法，该方法简单，成本低，效率高；底物诱导产草酸脱羧酶不受抑制，产酶量稳定。
本发明的一种麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，包括
(1)将粉碎的麦秆按照固液比为lg : 5-15ml用酸溶液浸泡10_20h，在100-15(TC 条件下水解反应20-60min，离心去除残渣后，得到麦秆水解液，并用DNS法测定水解液中还 原糖含量(以葡萄糖为标准糖计)； (2)按7-30g/L的还原糖量，将麦秆水解液配制成发酵培养基，调节pH值为 4. 0-5. 0，过滤除去杂质，并添加氮源和无机盐，再检查并调节pH值至4. 0-5. 0，灭菌后备 用； (3)取2-3片直径为9 llmm含菌丝体的琼脂固体培养基，接入液体种子培养基， 于3(TC静置培养4-6天；待菌丝体在液体培养基上方形成白色菌丝群但尚未浮出水面时， 将菌丝体和培养基全部转移到含有无菌玻璃珠的容器中，对菌丝体进行震荡破碎获得含有 菌丝碎片的悬浊液，以3-15%的接种量接入上述发酵培养基，在20-3(TC和100-250rpm转 速条件下培养4-6天； (4)待菌丝球形成时，加入终浓度为5-20mM的草酸诱导草酸脱羧酶的产生，培养 0. 5-6天后获取菌丝体；菌丝体经液氮冷冻后研磨破碎，用0. 2M，pH 3. 7的醋酸缓冲液提取 菌丝碎片，离心去除残渣，所得上清液即为草酸脱羧酶粗酶液。
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所述步骤(1)中的酸为硫酸、盐酸或醋酸，质量百分比浓度为0. 5% -8% ;
所述步骤(2)用氢氧化钠溶液调节pH值； 所述步骤(2)中的发酵培养基的组分为麦秆水解物中的还原糖7 30g(以葡萄 糖为标准糖计)，蛋白胨3. Og， KH2P04 1. Og， Na2HP04 12H20 0. 2g， MgS04 7H20 0. 5g以及微 量元素lml，用水定容至1L; 所述的微量元素的组分为:FeS04 7H20 10g， MnS04 H20 1. Og， ZnS04 7H20 1. Og， CuS04 5H20 2. Og， CaCl2 2H20 13g，用水定容至1L ; 所述步骤(3)中的液体种子培养基，以葡萄糖代替发酵培养基中的还原糖，其余 组分含量与发酵培养基相同。 本发明通过水解麦秆获得培养彩绒革盖菌生长的碳源，并用底物草酸诱导菌丝体
合成草酸脱羧酶。 (1)本发明利用麦秆水解液作为发酵培养彩绒革盖菌的碳源，方法简单，易于操 作； (2)本发明使用的麦秆产量大，成本低，作为生产碳源的原料价格低廉；且碳源的 制备可控性强，含糖量稳定； (3)与传统培养基碳源——葡萄糖相比，以该低值碳源生产彩绒革盖菌获得的菌 丝体生物量大，转化率高。 (4)与传统培养基相比，以该低值碳源培养菌体时，底物诱导产草酸脱羧酶不受抑 制，产酶量稳定。
图l麦秆水解液培养基(初始pH 5. 0)生产的菌丝体干重随发酵时间的变化；+ 水解液培养基_*_葡萄糖培养基； 图2麦秆水解液培养基(初始pH 5. 0)中利用草酸诱导合成的酶活力；+水解 液培养基+葡萄糖培养基； 图3麦秆水解液培养基(初始pH 5. 0)中添加草酸诱导后提取的菌丝体蛋白含 量；+水解液培养基+葡萄糖培养基； 图4麦秆水解液培养基(初始pH 5. 0)中利用草酸诱导合成的酶的比活力1 ; + 水解液培养基+葡萄糖培养基； 图5麦秆水解液培养基(初始pH 5. 0)中草酸诱导后的菌丝体破碎残渣干重；+ 水解液培养基+葡萄糖培养基； 图6麦秆水解液培养基(初始pH 5.0)中利用草酸诱导合成的酶的比活力2;+ 水解液培养基+葡萄糖培养基； 图7麦秆水解液培养基(初始pH 5. 0)中添加草酸诱导后的还原糖含量；+水 解液培养基+葡萄糖培养基； 图8麦秆水解液培养基(初始pH 5. 0)中草酸诱导后发酵液的pH变化；+水解 液培养基+葡萄糖培养基； 图9麦秆水解液培养基(初始pH 3. 5)生产的菌丝体干重。+水解液培养基+葡萄糖培养基
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 实施例1 麦秆水解液生产彩绒革盖菌(培养基初始pH值5. 0) 将充分磨碎的麦秆称重，以lg : 12ml的固液比加入浓度为1%的硫酸溶液，麦秆 粉经稀硫酸溶液浸泡10小时后，放置于高压蒸汽灭菌锅中，在12rC下，反应30min，过滤除 去麦秆残渣，获得麦秆水解液备用，用DNS法测定麦秆水解液中还原糖的含量(以葡萄糖为
标准糖)，4t:条件下储存备用； 每50mL培养基中加入含lg还原糖(以葡萄糖计)的麦秆水解液，再加入0. 15g 蛋白胨，O. 05g磷酸二氢钾，0. 025g MgS04 7H20，0. Olg Na2HP04 12H20，以及微量元素 50iiL(微量元素配方为FeS04 7H20 10g/L， MnS04 H20 1. Og/L， ZnS04 7H201. Og/L， CuS04 5H20 2. Og/L， CaCl2 2H20 13g/L)。培养基配制完成后，用氢氧化钠调节pH值至 5.0，灭菌后备用； 取一块琼脂平板菌种，用打孔器打下直径约10mm含菌丝体的固体培养基薄片，取 2-3片加入液体种子培养基(以葡萄糖代替还原糖)，3(TC静置4-6天。待菌丝体在液体培 养基上方形成白色菌盖但尚未完全浮出液面，全部移入装有玻璃珠的容器，进行震荡破碎， 获得含有菌丝碎片的悬浊液。将混匀的菌悬液按10%的接种量接入发酵培养基中，培养
1- 5天，称取菌丝体绝干重。发现麦秆水解液培养基的菌丝体产量高于对照培养基(葡萄 糖)菌丝体的产量，且仍处于上升趋势，4 6天为菌丝的生长旺盛期。 实施例2 麦秆水解液生产彩绒革盖菌(培养基初始pH值5. 0) 将充分磨碎的麦秆称重，以lg : 15ml的固液比加入浓度为3%的硫酸溶液，麦秆 粉经稀硫酸溶液浸泡10小时后，放置于高压蒸煮锅中，在IO(TC下，反应60min，过滤除去麦 秆残渣，获得麦秆水解液备用，用DNS法测定麦秆水解液中还原糖的含量(以葡萄糖为标准 糖)，4t:条件下储存备用； 每50mL培养基中加入含1.5g还原糖(以葡萄糖计)的麦秆水解液，再加入 0. 15g蛋白胨，0. 05g磷酸二氢钾，0. 025g MgS04 7H20，0. Olg Na2HP04 12H20，以及微量元 素50 y L(微量元素配方为FeS04 7H20 10g/L， MnS04 H20 1. Og/L， ZnS04 7H201. Og/L， CuS04 5H20 2. Og/L， CaCl2 2H20 13g/L)。培养基配制完成后，用氢氧化钠调节pH值至 5.0，灭菌后备用； 取一块琼脂平板菌种，用打孔器打下直径约lOmm含菌丝体的固体培养基薄片，取
2- 3片加入液体种子培养基，3(TC静置4-6天。待菌丝体在液体培养基上方形成白色菌盖但 尚未完全浮出液面，全部移入装有玻璃珠的容器，进行震荡破碎，获得含有菌丝碎片的悬浊 液。将混匀的菌悬液按15%的接种量接入发酵培养基中，培养1-5天，称取菌丝体绝干重。发现菌丝体产量的变化趋势与实施例1类似，同样高于对照培养基(葡萄糖)菌丝体产量， 且处于上升趋势，4 6天为菌丝的生长旺盛期。
实施例3 麦秆水解液生产彩绒革盖菌(培养基初始pH值5. 0) 将充分磨碎的麦秆称重，以lg : 5ml的固液比加入浓度为8%的硫酸溶液，麦秆粉 经稀硫酸溶液浸泡IO小时后，放置于高压蒸煮锅中，在15(TC下，反应20min，过滤除去麦秆 残渣，获得麦秆水解液备用。用DNS法测定麦秆水解液中还原糖的含量(以葡萄糖为标准 糖)，4t:条件下储存备用； 每50mL培养基中加入含0.35g还原糖(以葡萄糖计)的麦秆水解液，再加入 0. 15g蛋白胨，0. 05g磷酸二氢钾，0. 025g MgS04 7H20，0. Olg Na2HP04 12H20，以及微量元 素50 y L(微量元素配方为:FeS04 7H20 10g/L， MnS04 H20 1. Og/L， ZnS04 7H20 1. Og/L， CuS04 5H20 2. Og/L， CaCl2 2H20 13g/L)。培养基配制完成后，用氢氧化钠调节pH值至 5.0，灭菌后备用； 取一块琼脂平板菌种，用打孔器打下直径约lOmm含菌丝体的固体培养基薄片，取 2-3片加入液体种子培养基，3(TC静置4-6天。待菌丝体在液体培养基上方形成白色菌盖但 尚未完全浮出液面，全部移入装有玻璃珠的容器，进行震荡破碎，获得含有菌丝碎片的悬浊 液。将混匀的菌悬液按15%的接种量接入发酵培养基中，培养1-5天，称取菌丝体绝干重。 发现菌丝体产量的变化趋势与实施例1类似，同样高于对照培养基(葡萄糖)菌丝体产量， 且处于上升趋势，4 6天为菌丝的生长旺盛期。
实施例4 麦秆水解液生产菌丝体并诱导合成草酸脱羧酶(培养基初始pH值5. 0) 任取实施例1 3培养4 6天的菌丝，加入终浓度为10mM的草酸，诱导0. 5-5
天后，收取菌丝体，保存发酵液。菌丝体经液氮冷冻研磨破碎后，用0. 2M， pH 3. 7的醋酸缓
冲液提取菌丝碎片，离心去除残渣，上清即为粗酶液。残渣烘至绝干称重，上清测定草酸脱
羧酶活力及酶液蛋白含量，发酵液测定残留还原糖浓度。 对照组采用葡萄糖培养基，培养方法相同，在培养彩绒革盖菌4天后，加入终浓度 为10mM的草酸，诱导1至5天后，收取菌丝体，保存发酵液，将菌丝体液氮冷冻研磨破碎后， 用O. 2M，pH 3.7的醋酸缓冲液提取菌丝碎片，离心去除残渣，上清即为粗酶液。残渣烘至绝 干称重，上清测定草酸脱羧酶活力及酶液蛋白含量，发酵液测定残留还原糖浓度。结论
(a)菌丝体产草酸脱羧酶酶活的比较麦秆水解液组酶活力在24小时达到1. 3U， 在120小时达到高点2U，对照组在48小时达到0. 3U，远远低于麦秆水解液组(见图2)。
(b)菌丝体产蛋白量及草酸脱羧酶蛋白比活力的比较麦秆水解液培养菌丝体诱 导后蛋白含量随着时间的延长先升后降，并在72小时到达高点0. 57mg ;对照组的蛋白含量 随时间变化的波动较小，维持在O. lmg左右(见图3)。将菌丝体破碎所得酶蛋白活力除以 酶液蛋白量得酶液蛋白比活(标记为比活力1)，麦秆水解液培养基比活力在24小时最高， 达到12U/mg，随后下降，在72小时后随酶活上升略微上升。对照组比活力只有在48小时达 到较高点为5. 7U/mg(见图4)。可见诱导24小时，是比较理想的收获菌丝体的时间。
(c)菌丝体破碎后残渣绝干重的比较麦秆水解液培养菌丝体诱导后破碎菌丝过 滤得残渣，在105t:下烘烤至绝干称重，残渣干重在诱导48小时，即培养8天后趋于平稳，在0. 12g菌丝体左右，而对照组在0.5g菌丝体左右，后期略有上升(见图5)。将发酵液所产 菌丝体破碎所得酶蛋白活力除以菌丝残渣干重得酶液干重比活力(标记为比活力2)，麦秆 水解液培养基比活在24小时和120小时较高，达到15U/g菌丝体，与酶活力趋势大致相同。 而对照组在48小时达到高点6U/g菌丝体(见图6)。 (d)麦秆培养基发酵后残留还原糖含量的比较麦秆水解液培养基发酵培养后，
还原糖含量不断降低，在诱导5天后接近于零。而对照组在发酵诱导后含糖量维持在16g/
L左右(见图7)。表明彩绒革盖菌能充分利用麦秆水解液中的还原糖。 (e)麦秆培养基发酵后pH值的变化麦秆培养基发酵后的pH值保持缓慢上升趋
势，从24小时至120小时，从5. 0上升至6. 0。对照组的pH值在第二天即酶产量最高时达
到高点3. 4，而后维持在3左右(见图8)。说明高pH值在麦秆水解液培养基中没有对诱导
彩绒革盖菌产草酸脱羧酶产生影响。 (f)菌丝体产蛋白量及草酸脱羧酶蛋白比活力的比较麦秆水解液培养菌丝体诱 导后蛋白含量随着时间的延长先升后降，并在72小时到达高点0. 57mg ;对照组的蛋白含量 随时间变化的波动较小，维持在O. lmg左右(见图3)。将菌丝体破碎所得酶蛋白活力除以 酶液蛋白量得酶液蛋白比活(标记为比活力1)，麦秆水解液培养基比活力在24小时最高， 达到12U/mg，随后下降，在72小时后随酶活上升略微上升。对照组比活力只有在48小时达 到较高点为5. 7U/mg(见图4)。可见诱导24小时，是比较理想的收获菌丝体的时间。
(g)菌丝体破碎后残渣绝干重的比较麦秆水解液培养菌丝体诱导后破碎菌丝过 滤得残渣，在105t:下烘烤至绝干称重，残渣干重在诱导48小时，即培养8天后趋于平稳，在 0. 12g菌丝体左右，而对照组在0.5g菌丝体左右，后期略有上升(见图5)。将发酵液所产 菌丝体破碎所得酶蛋白活力除以菌丝残渣干重得酶液干重比活力(标记为比活力2)，麦秆 水解液培养基比活在24小时和120小时较高，达到15U/g菌丝体，与酶活力趋势大致相同。 而对照组在48小时达到高点6U/g菌丝体(见图6)。 (h)麦秆培养基发酵后残留还原糖含量的比较麦秆水解液培养基发酵培养后， 还原糖含量不断降低，在诱导5天后接近于零。而对照组在发酵诱导后含糖量维持在16g/ L左右(见图7)。表明彩绒革盖菌能充分利用麦秆水解液中的还原糖。
(i)麦秆培养基发酵后pH值的变化麦秆培养基发酵后的pH值保持缓慢上升趋 势，从24小时至120小时，从5. 0上升至6. 0。对照组的pH值在第二天即酶产量最高时达 到高点3. 4，而后维持在3左右(见图8)。说明高pH值在麦秆水解液培养基中没有对诱导 彩绒革盖菌产草酸脱羧酶产生影响。
实施例6 麦秆水解液生产彩绒革盖菌(培养基初始pH值3. 5) 培养基配制方法同实施例l，配制完成后，用氢氧化钠调节pH值至3. 5，灭菌后备用。 接种及培养方法同实施例1，初始pH 3. 5的水解液培养基菌丝体产量很低，远低 于对照葡萄糖培养基菌丝体的生物量(见图9)。
权利要求
一种麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，包括(1)将粉碎的麦秆按照固液比为1g∶5-15ml用酸溶液浸泡10-20h，在100-150℃条件下水解反应20-60min，离心去除残渣后，得到麦秆水解液，并用DNS法测定水解液中还原糖含量；(2)按7-30g/L的还原糖量，将麦秆水解液配制成发酵培养基，调节pH值为4.0-5.0，过滤除去杂质，并添加氮源和无机盐，再检查并调节pH值至4.0-5.0，灭菌后备用；(3)取2-3片直径为9～11mm含菌丝体的琼脂固体培养基，接入液体种子培养基，于30℃静置培养4-6天；待菌丝体在液体培养基上方形成白色菌丝群但尚未浮出水面时，将菌丝体和培养基全部转移到含有无菌玻璃珠的容器中，对菌丝体进行震荡破碎获得含有菌丝碎片的悬浊液，以3-15％的接种量接入上述发酵培养基，在20-30℃和100-250rpm转速条件下培养4-6天；(4)待菌丝球形成时，加入终浓度为5-20mM的草酸诱导草酸脱羧酶的产生，培养0.5-6天后获取菌丝体；菌丝体经液氮冷冻后研磨破碎，用0.2M，pH3.7的醋酸缓冲液提取菌丝碎片，离心去除残渣，所得上清液即为草酸脱羧酶粗酶液。
2. 根据权利要求1所述的一种麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中的酸为硫酸、盐酸或醋酸，质量百分比浓度为0. 5% -8%。
3. 根据权利要求1所述的一种麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，其特征在于所述步骤(2)用氢氧化钠溶液调节pH值。
4. 根据权利要求1所述的一种麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，其特征在于所述步骤(2)中的发酵培养基的组分为麦秆水解物中的还原糖7 30g，蛋白胨3. Og， KH2P04 1. Og， Na2HP04 12H20 0. 2g， MgS04 7H20 0. 5g以及微量元素lml，用水定容至1L。
5. 根据权利要求4所述的一种麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，其特征在于所述的微量元素的组分为FeS04 7H20 10g， MnS04 H20 1. Og， ZnS04 7H20 1. Og，CuS04 5H20 2. Og， CaCl2 2H20 13g，用水定容至1L。
6. 根据权利要求1所述的一种麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，其特征在于所述步骤(3)中的液体种子培养基，以葡萄糖代替发酵培养基中的还原糖，其余组分与发酵培养基相同。
全文摘要
本发明涉及一种麦秆碳源培养彩绒革盖菌诱导草酸脱羧酶的方法，包括(1)将粉碎的麦秆用酸溶液浸泡，在100-150℃条件下水解；(2)配制发酵培养基，调节pH值为4.0-5.0；(3)取菌丝体接入液体种子培养基，待形成白色菌丝群但尚未浮出水面时，将菌丝体和培养基全部转移到含有无菌玻璃珠的容器中，震荡破碎，以3-15％的接种量接入发酵培养基；(4)培养4-6天，加入草酸，培养0.5-6天后获取菌丝体；菌丝体经液氮冷冻后研磨破碎，用醋酸缓冲液提取菌丝碎片，离心。本发明方法简单，易于操作，成本低，且碳源的制备可控性强，含糖量稳定。
文档编号C12N9/88GK101724618SQ20091020093
公开日2010年6月9日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年12月25日
发明者曹张军, 杨光, 杨雪霞, 洪枫, 陈奇知 申请人:东华大学