专利名称：检测食品中沙门菌的环介导等温扩增方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种食品中病原菌的快速检测方法，特别是一种以HisJ为靶基因的环介导等温扩增检测食品中沙门菌的方法及试剂盒，属于食品检测生物技术领域，适用于食品中沙门菌属的检测。
背景技术：
沙门菌是最常见的食源性疾病病原菌，不仅能导致动物疾病，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙门菌引起的中毒病例占首位或第二位。沙门菌作为致病菌检测的一项重要指标，在公共卫生、食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中均是必需检测的项目，有重要社会、经济的意义。传统的沙门菌检测常用分离培养和血清学方法，确诊检验结果至少需5 7天，检验方法存在繁琐、费时费力、 特异性低等缺陷。因此，快速、准确、简便的沙门菌检测方法将是发展的方向。建立一种能快速检测沙门菌的检测方法具有重要的意义。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是建立于链替换自动循环反应基础之上。模板上的六个位点在恒温条件下被四条基础引物所识别并扩增，这赋予了此技术高度的特异性。与其他方法相比，环介导等温扩增只需要一个可以保持60-65°C恒温的简单加热装置如水浴锅。而且，环介导等温扩增反应在合成大量DNA的同时伴有大量的白色硫酸镁副产物，所以结果的判定只需肉眼简单观察浊度或通过加入DNA染料STOR GreenI后观察颜色变化。HisJ基因被报道可以成功检测沙门菌分离株并被证明是一个可靠的靶基因(G. G. Stone, R. D. Oberst, Μ. P. Hays, S. McVey, and Μ. Μ. Chengappa, " Detection of Salmonella serovars from clinicalsamples by enrichment broth cultivation-PCR procedure," Journal ofClinical Microbiology, vol.32，no. 7，pp. 1742-1749，1994 ；C.Gentry-Weeks, H. J. Hutcheson, L. M.Kim, D.Bolte, J. Traub-Dargatz, P. Morley, B. Powers, and M. Jessen, " Identification of twophylogeneticalIy related organisms from feces by PCR for detection ofSalmonella spp," Journal of Clinical Microbiology,vol. 40,no. 4,pp. 1487-1492, 2002)。
发明内容
本发明的目的是提供一种环介导等温扩增检测食品中沙门菌的方法，该方法能够快速、准确、高灵敏地检测食品中的沙门菌。本发明通过以沙门菌种属特异性基因HisJ为靶基因，设计了一组四条引物特异性扩增HisJ基因以达到检测沙门菌的目的。为了使检测具有好的灵敏度与特异性，我们使用了 BPW(蛋白胨水)进行预增菌，使用了孔雀绿培养基进行选择性增菌。获得了高特异性高灵敏度的结果。本发明是通过以下技术方案实现的
一种环介导等温扩增检测食品中沙门菌的方法，采用GenBank登录号为 CP001363. 1的沙门菌HisJ基因序列，设计一组四条引物SALFIP、SALBIP、SALF3和SALB3C， 以常规水煮裂解法提取的鼠伤寒沙门菌基因组DNA为模板进行环介导等温扩增，其步骤如下A、所述的引物序列为SALFIP :ttgcctttcagcgacgcgacttttctgattcccgtctggtggt ； (SEQ ID NO. 1)SALBIP :tgctacaggggacgacgcagttttacgatctcaatccctttcgg ； (SEQ ID NO. 2)SALF3 :aggaaatcgcgtttaccgac ； (SEQ ID NO. 3)SALB3C :gttgtcctgcccctggta. (SEQ ID NO. 4)B、所述的水煮裂解法步骤为取细菌悬液Iml 8，000Xg离心5分钟，沉淀使用 PBS悬浮并洗涤；接着再用8，000 Xg离心获取沉淀并使用100 μ 1超纯水重悬细菌；使用煮沸法裂解细菌，即细菌悬浮液在100°C煮沸lOmin，12，OOOXg离心3分钟，吸取上清作为模板；C、反应体系设为25 μ L，体系组成引物SALFIP和SALBIP各1. 6 μ Μ，引物SALF3 和SALB3C各0. 4 μ M，dNTPs为1. 6mM,硫酸镁为6mM，甜菜碱为1M，8U的Bst DNA聚合酶大片段，1 X thermopol缓冲液，和2 μ 1的样品基因组DNA ；D、环介导等温扩增反应程序为混合液在63°C孵育60分钟后，反应液在80°C加热3分钟终止；可通过在PCR管中加入1. 0 μ 1 1/10稀释的STOR green I (绿色荧光核酸染料)原液(黄色)后溶液的颜色变化来确定是否含有沙门菌。当含有沙门菌扩增DNA产物时，溶液呈现绿色；当无沙门菌扩增产物时，颜色仍为黄色。也可用肉眼观察PCR管中是否存在白色沉淀来判断样品中是否含有沙门菌。有白色沉淀，样品为沙门菌阳性；无白色沉淀，样品为沙门菌阴性。本发明还公开了一种沙门菌检测试剂盒，包括试剂A :2X预混反应缓冲液 12. 5X20 μ L ；试剂B 反应酶液IX 20 μ L ；试剂C 预混引物干粉，在使用前加入40 μ L超纯水，2 X 20 μ L ；试剂D为阴性对照ImL ；试剂E为阳性对照ImL ；试剂F为SYBER Green I 1Χ20μ L。或者试剂A:10XThermoPol 缓冲液(New England Biolabs, USA) 50 μ L, IOmM dNTPs (Promega, USA) 80 μ L, IM硫酸镁(Promega，USA) 3 μ L，5Μ 甜菜碱(Sigma，USA) 100 μ L， 超纯水17μ L ；试剂B :8U Bst DNA 聚合酶大片段(New England Biolabs, USA) 20 μ L ；试剂C 引物SALFIP和SALBIP干粉各0. 8nmol，弓丨物SALF3和SALB3C干粉各 0. 2nmol ；试剂D 超纯水ImL ；试剂E 高纯鼠伤寒沙门菌ATCC 14028s基因组模板lmL(10ng/ μ L)；试剂F 10000 X SYBER Green I (invitrogen) 2 μ L, DMSO 18 μ L。试剂贮藏条件-20°C。本发明中总反应体系设为25 μ L，体系组成引物SALFIP和SALBIP各1. 6 μ Μ，引物 SALF3 和 SALB3C 各 0. 4 μ Μ，dNTPs 为 1. 6mM,硫酸镁为 6mM，甜菜碱为 1M，8U 的 Bst DNA 聚合酶大片段，lXHiermoPol缓冲液，和2μ 1的样品基因组DNA。
本发明所述的样品，待检时，采用水煮裂解法提取基因组DNA，具体步骤如下吸取摇勻的培养细菌悬液Iml于1. 5ml微量离心管中8，OOOXg离心5分钟，沉淀使用PBS悬浮并洗涤。接着再用8，000 Xg离心获取沉淀并使用ΙΟΟμΙ超纯水重悬细菌。使用煮沸法裂解细菌，即细菌悬浮液在100°C煮沸10min，12，000Xg离心3分钟，吸取上清作为模板。与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果1、操作简单，检测时间短，从样品DNA的提取到检测出结果仅需约1. 5小时(不包括样品处理与预增菌)；2、特异性强，灵敏度高；3、适用范围广，可用于食品样品如鸡肉、猪肉、蔬菜等中沙门菌的检测，其最低检测限为增菌液中含沙门菌8X 102CFU/ml ；4、本方法可替代传统的食品中沙门菌的检测方法。
图1. LAMP引物设计箭头和方框表示引物在靶基因上的延伸方向。限制性酶切位点HinfI用加粗字体显不。图2.限制性酶切分析沙门菌ATCC 14028s株LAMP扩增产物泳道1.未酶切LAMP产物；泳道2. HinfI酶切后的LAMP产物；泳道3.阴性对照； 泳道M. DL2000 (宝生物)图3-6是LAMP方法与PCR方法间的灵敏度比较泳道M. DL2000 ；泳道1_8.分别对应于10倍稀释沙门菌ATCC14028s菌液即 8. OX IO6-S. OX Kr1CFUAil ；泳道9.模板为大肠杆菌的阴性对照；泳道10.模板为水的阴性对照。图3.琼脂糖(1. 5% w/v)电泳使用EB染色显示LAMP反应灵敏度。图4琼脂糖(1. 5% w/v)电泳使用EB染色显示PCR反应灵敏度。图5肉眼检测LAMP产物的浊度。图6肉眼检测STOER Green I染色后的LAMP反应产物。
具体实施例方式实施例11、设计、合成引物在GenBank中搜索沙门菌属的HisJ基因序列，对其同源性进行比较，其同源性在 99%以上。参照GenBank中鼠伤寒沙门菌ATCC 14028s (accession CP001363. 1)设计引物。 使用日本荣研化学有限公司的I^rimerExplorer V4软件按照默认设定进行设计(http:// primerexplorer. jp/elamp4. 0. 0/index. html)。环介导等温扩增的引物设计区域位于沙门菌基因组 HisJ 基因 2，516，325-2，516，524nt 内(图 1)。一组四条引物 SALFIP、SALBIP、 SALF3和SALB3C在大连宝生物公司按照PAGE纯度级别合成。2、环介导等温扩增反应程序和反应体系建立通过对引物浓度、硫酸镁浓度、甜菜碱浓度等的选择，确定最佳反应体系和反应程
5序。优化后的引物SALFIP和SALBIP最佳浓度为1. 6 μ Μ，引物SALF3和SALB3C最佳浓度为 0. 4 μ Μ，硫酸镁最佳浓度为6mM，甜菜碱最佳浓度为1M。3、方法特异性和酶切鉴定将甘油低温保存的鼠伤寒沙门标准菌ATCC 14028s置于冰上解冻，接种到BPW内培养复苏M小时，细菌悬液按10倍递增稀释至8. OX IO6-S. OX Kr1CFUAil，分别提取核酸 DNA，用本发明的环介导等温扩增检测体系进行检测，考察检测下限，同时以HisJ基因为模板的常规PCR做参照，对灵敏度进行评价。应用103株已知沙门菌或非沙门菌(表1和表 2)测试基于HisJ为靶基因的环介导等温扩增技术检测沙门菌的特异性。表1实验中使用的沙门菌
权利要求
1.一种检测食品中沙门菌的环介导等温扩增方法，其特征在于以沙门菌HiSj基因为靶基因，使用四条环介导等温扩增特异性引物检测沙门菌，所述四条环介导等温扩增特异性引物序列如SEQ ID N01-4所示。
2.根据权利要求1所述检测食品中沙门菌的环介导等温扩增方法，其步骤如下A、以水煮裂解法提取鼠伤寒沙门菌基因组DNA:取细菌悬液Iml8,000 X g离心5分钟，沉淀使用PBS悬浮并洗涤；接着再用8，000 X g离心获取沉淀并使用100 μ 超纯水重悬细菌；使用煮沸法裂解细菌，即细菌悬浮液在100 0C煮沸10 min,12,000 X g离心3 分钟，吸取上清作为模板；B、将序列分别如SEQID N01-4所示的一组4条引物SALFIP、SALBIP、SALF3和 SALB3C与反应试剂组合，进行环介导等温扩增检测；其反应体系为25 μ ，体系组成引物SALFIP和SALBIP各1. 6 μΜ，引物SALF3和 SALB3C各0. 4 μΜ, dNTPs为1. 6 mM，硫酸镁为6 mM，甜菜碱为1 M，8 U的Bst DNA聚合酶大片段，lXHiermoPol缓冲液，和2 μ 的样品基因组DNA ；其反应程序混合液在63 0C孵育60分钟后，反应液在80 °C加热3分钟终止，观察。
3.一种沙门菌检测试剂盒，其特征在于包括 试剂A: 2X预混反应缓冲液12. 5X20 μ ； 试剂B:反应酶液1X20 μ ；试剂C:预混引物干粉，在使用前加入40 PL超纯水，2X20 μ ； 试剂D为阴性对照1 mL ； 试剂E为阳性对照1 mL ； 试剂 F 为 SYBER Green I 1X20 μ 。
4.一种沙门菌检测试剂盒，其特征在于包括试剂 A 10 X ThermoPol 缓冲液 50 μ , 10 mM dNTPs 80 μ , 1 M 硫酸镁 3 μ ,5 M甜菜碱100 μ ，超纯水17 μ ；试剂B :8 U Bst DNA聚合酶大片段20μ ；试剂C:引物SALFIP和SALBIP干粉各0. 8 nmol，引物SALF3和SALB3C干粉各0. 2 nmol ；试剂D 超纯水1 mL ；试剂E 高纯鼠伤寒沙门菌ATCC 14028s基因组模板1 mL (10 ng/^L)； 试剂 F :10000 X SYBER Green I 2 μ , DMSO 18 μ 。
全文摘要
本发明涉及一种食品中病原菌的快速检测方法，特别是一种以HisJ为靶基因的环介导等温扩增检测食品中沙门菌的方法及试剂盒。所述的检测方法是以沙门菌HisJ基因为靶基因，使用四条环介导等温扩增特异性引物检测沙门菌，所述四条环介导等温扩增特异性引物序列如SEQIDNO1-4所示。本发明具有操作简单，检测时间短，特异性强，灵敏度高；适用范围广等优点，可替代传统的食品中沙门菌的检测方法。
文档编号C12Q1/68GK102424861SQ20121000367
公开日2012年4月25日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者孙林, 张磊, 潘志明, 焦新安, 耿士忠, 陈祥, 黄金林 申请人:扬州大学