专利名称：人白细胞介素-10的高效表达方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种由生物技术制备人白细胞介素-10(hIL-10)的方法，特别涉及一种毕赤酵母高效表达hIL-10的载体的构建方法和高效表达hi L-10菌株的筛选和建立。
背景技术：
hIL-10能抑制T细胞介导的免疫炎症反应和通过刺激B淋巴细胞反应而参与体液免疫调节，具有良好的临床应用前景。目前已应用于包括I型糖尿病、银屑病、类风湿关节炎、多发性硬化、丙型肝炎等多种免疫性疾病的临床实验研究。天然hIL-10主要由巨噬细胞产生的分子量为18.5KD，无糖基修饰，活性形式是由非共价键连接两个单体而形成的同
源寡二聚体。国内外对hIL-10作用机制及临床治疗疾病的应用进行了广泛而深入的研究，一方面确认了 hIL-10生物学功能，另一方面也扩展了其临床应用范围；因此，市场对hIL-10的需要将越来愈大。目前国内外已报道hIL-10的重组表达系统主要有Ecoli，CH0-Kl，还有一些研究人员使用植物叶片表达；使用酵母表达hIL-10的相关工作也很少，关键是难以大量得到具有天然活性的同源寡二聚体。国际市场上重组hIL-10非常昂贵，且国内尚无企业生产。国际上商品化重组hIL-10主要是大肠杆菌来源的，具有161个氨基酸，比正常hIL-10多一个氨基酸，在治疗上具有潜在的危害。而大肠杆菌主要以包涵体的形式表达hIL-10，是无生物学活性的蛋白复合物，且变复性过程复杂，回收率低，严重影响了 hIL-10的研究和应用。本发明前，一些研究人员用invitrogen公司购买的常用毕赤酵母表达载体，如pPIC9K(刘立藏，马辉文等. 人白细胞介素10(hIL10)在毕赤酵母中的表达.武汉大学学报，2004，50(2)和井申荣，邹全明等.重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定.中华微生物学和免疫学杂志，2005，25 (9))，pPICZ α A(陈富超，孙万邦等.重组hIL-10在毕赤酵母X-33的表达及其生物活性鉴定.中国免疫学杂志，2011,27(8))等，转化毕赤酵母表达菌株(如GS115, X-33等)，参照invitrogen公司推荐的毕赤酵母表达菌株的常规筛选方法。由于这些常规的的毕赤酵母表达载体获得高拷贝菌株的几率很低，而用PA0815载体(井申荣，邹全明等.白细胞介素-10基因多拷贝表达盒的构建及在毕赤酵母中的表达.中国生物制品学杂志，2007,20(2))的方法虽然也能获得高拷贝菌株，但这种方法十分费时费力，且结果不佳和不容易实现。同时，常规的筛选高效表达菌株是在温度为28-30°C下进行的，忽略了酵母分泌机制可能对重组蛋白表达的不利影响，导致外源表达蛋白在细胞内储留并造成酵母细胞生存力影响。因此，利用常规的筛选方法未能获得hIL-10的高效表达菌株。
发明内容
1.本发明的技术方案
本发明一方面提供一种适用于酵母高效表达外源重组蛋白的方法，以及用于该方法的表达载体的构建方法。本发明另一方面提供一种hIL-10的酵母表达方法，以及用于所述方法的载体的构建方法。具体而言，本发明一方面提供用于在酵母中表达外源蛋白的方法，其包括下述步骤:I)构建表达载体，所述表达载体包含rDNA非编码区，抗生素抗性基因，分泌信号肽和外源蛋白的编码序列；2)逐步增加抗生素的浓度，从而扩增所述表达载体的拷贝数，构建含有不同拷贝数的克隆的库；3)选择表达克隆，表达并回收外源蛋白。在本发明的一个实施方案中，所表达的外源蛋白优选地是人白细胞介素-10。在本发明这一方面，利用rDNA在毕赤酵母基因组中的多拷贝特性，设计以rDNA的非编码区为整合 位点，可以在同一个克隆中同时转入多个表达载体，从而有利于获得外源基因的高效表达；同时，发明人发现，通过逐步增加抗生素的浓度，扩增所述表达载体的拷贝数，然后构建含有不同拷贝数的克隆的库，在此基础上选择表达克隆，可以容易地获得高拷贝菌株，进而表达和回收外源蛋白。优选地，发明人发现选择分散在酵母的4条染色体上的rDNA非编码区，可以在同一个克隆中同时转入多个表达载体，有利于获得外源基因的高效表达。更优选地，发明人发现使用序列为SEQ ID No:1的rDNA非编码区有利于高效地将外源基因的多个表达载体同时转入到一个克隆中，并且转化得到的高拷贝克隆稳定性好，可以容易地获得闻效表达的菌株。在本发明的一个实施方案中，所述方法进一步包括低温下甲醇诱导外源蛋白分泌表达。在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括比较酵母胞内外源蛋白的量与分泌到上清中的外源蛋白的量的相对比例关系，从而选择表达克隆，表达并回收外源蛋白。发明人发现通过低温(20°C)下比较酵母胞内滞留的hIL-10与分泌到上清中hIL-10的量的相对比例关系，非常有效地避免了大量错误折叠的hIL-10蛋白在酵母胞内滞留而引起内质网压力，保证了甲醇诱导下hIL-10表达菌株处于最佳活力状态，同时有效地防止了真正的hIL-10高效表达克隆的落选。发明人发现低温下甲醇诱导hIL-10分泌表达可以显著提高上清中hIL-10的表达比例。在本发明的一个实施方案中，低温下甲醇诱导hIL-10分泌表达获得的上清蛋白/胞内蛋白的比例为1.3倍。在本发明的一个实施方案中，低温下甲醇诱导hIL-10分泌表达获得的上清蛋白/胞内蛋白的比例为至少2倍，优选为至少3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍等等。在本发明的优选实施方案中，低温下甲醇诱导hIL-10分泌表达获得的上清蛋白/胞内蛋白的比例为至少6倍。在本发明的一个实施方案中，所用的外源蛋白的编码序列是未经密码子优化的序列。在本发明的另一个实施方案中，所用的外源蛋白的编码序列是经密码子优化的序列。对编码序列进行优化以利于在宿主细胞中表达的方法是本领域技术人员熟知的。在本发明的方法中可以使用本领域技术人员熟知的各种合适的分泌信号肽，其包括但不限于α-因子、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、血清白蛋白分泌信号肽。在本发明的一个优选的实施方案中，所述分泌信号肽是α -因子分泌信号肽。本发明还一方面涉及在本发明所述的方法中构建的表达载体。本发明再一方面涉及包含本发明的表达载体的酵母菌株。本发明又一方面涉及本发明的表达载体和本发明的酵母菌株用于表达人白细胞介素-10的用途。本发明的技术方案示例性地说明如下。2.本发明的技术方案的示例性说明2.1)以pPICZca A载体为框架，再整合进毕赤酵母基因组中的rDNA-非编码区片段，构建出PUCZ9K载体。2.2)分别将α -交配因子-pre-pro序列与hIL_10编码序列的N端融合，同时在hIL-10的C端引入His-tag,并将融合好的蛋白编码序列插入pUCZ9K载体中，最后构建了以α -交配因子-pre-pro序列为分泌信号肽的hIL-10-His高效表达载体。再利用PUCZ9K载体中的rDNA-非编码区片段为整合位点，并通过逐步增加Zeocin的浓度(0.1mg/ml, 0.5mg/ml, 1.0mg/ml, 2.0mg/ml, 3.0mg/ml, 5.0mg/ml)来进行表达载体拷贝数的扩增，最终实现快速地获得含有不同拷贝数的单克隆的库。用Realtime PCR的方法鉴定单克隆库中的不同克隆的拷贝数。再用低温(20°C )下的甲醇诱导hIL-10表达，并以表达上清和菌体胞内的hIL-10蛋白的相对量为评价标准，从不同拷贝数的克隆的库中筛选出具有产业化价值的hIL-10高效表达菌 株。其中，酵母菌种可以采用X-33等常规毕赤酵母菌株。IL-10基因编码序列可以采用未经密码子优化或密码子优化后的序列。IL-10的分泌信号肽可以采用最为常用的α -交配因子，也可以选择α -淀粉酶，葡糖淀粉酶，血清白蛋白等常规信号肽。3.本发明的技术效果采用rDNA的非编码区为插入位点；用逐步增加Zeocin的浓度(0.lmg/ml,0.5mg/ml, 1.0mg/ml, 2.0mg/ml, 3.0mg/ml, 5.0mg/ml)来扩增阳性克隆中hIL-10表达载体的拷贝数；利用低温(20°C )下甲醇诱导hIL-10分泌表达来进行高效表达菌株的筛选，这些是本发明特有的区别特征。与已有技术相比，本发明的优点是利用rDNA在毕赤酵母基因组中的多拷贝特性，设计了以rDNA的非编码区为整合位点，大大增加了同一个克隆中同时转入多个表达载体的几率，同时这种重复的rDNA非编码区分散在毕赤酵母的4条染色体上，使转化得到的高拷贝克隆具有稳定性好的特性。同时，对这些阳性克隆用Zeocin的加压进一步扩增拷贝数的方法，非常方便的获得了一个含有不同拷贝数的克隆的库。此外，采用低温下甲醇诱导hIL-10蛋白表达的方式，比较酵母胞内滞留的hIL-10与分泌到上清中hIL-10的量的相对比例关系，非常有效地避免了大量错误折叠的hIL-10蛋白在酵母胞内滞留而引起内质网压力，保证了甲醇诱导下hIL-10表达菌株处于最佳活力状态，同时有效地防止了真正的hIL-10高效表达克隆的落选，使筛选出来的克隆是真正的具有高效分泌表达hIL-10潜能的克隆，为下一步的发酵优化提供了良好的基础。
图1质粒pUCZ的构建流程图；图2rDNA非编码区片段的PCR产物电泳结果图；图35’ A0X-MCS-3’ AOX与rDNA非编码区片段的重叠延伸PCR产物电泳结果图；图4毕赤酵母高效表达载体PUCZ9K的构建流程图；图5毕赤酵母高效表达载体PUCZ9K的质粒图谱；图6hIL_10/pUCZ9K的构建流程·
图7Zeocin加压扩增表达载体的方法；图8酵母基因组抽提后的电泳结果图；图9还原条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳后的Western Blot结果,3个阳性转化克隆在20度和30度下同时诱导表达，并同时检测毕赤酵母胞内和分泌上清中的hL-10。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的所有弓I物合成均由上海生工完成。实施例1、毕赤酵母高效表达载体PUCZ9K的构建，具体过程包括以下步骤:1.UpUCZ质粒的构建以pUC19质粒(购自宝生物工程)为模板进行PCR扩增多克隆位点(MCS)，并在其两端各引入I个BglII位点JfpPICZaA质粒用BamHI和BglII双酶切回收TEF1-EM7-Zeoc in-CYC I TT-pUC or i片段，与用Bgl II酶切回收后的MCS片段连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5ci (购自宝生物工程)，筛选阳性重组子。阳性重组质粒委托英俊公司测序，结果表明MCS片段与TEFl-EM7-Zeocin-CYClTT-pUCori序列正确连接且序列正确，并命名为pUCZ，构建流程见图1。1.2、pUCZ9K重组质粒的构建以提取的质粒pPIC9K(购自Invitrogen公司)为模板进行PCR扩增5’A0X-MCS-3’A0X片段，同时以GS115菌株(购自Invitrogen公司)的基因组为模板进行PCR扩增rDNA-非编码区SEQ ID No:1(见图2)，所用引物序列为:NTS-rDNA-Fw:5’ GTTTCGCTGGAAGGGGAACTTTAGA 3’ ；NTS-rDNA-Rv:5’ CAAAGACCAACCGAAAGCCGACGA 3’ ；rDNA 非编码区序列 SEQ ID No:l(1153bp):GTTTCGCTGGAAGGGGAACTTTAGATTACAGGGCAAACATGCAAATCCCAGGCGGGGAAAGCGCTGATTTCTGCGGTTCAGGCCCTGATCCGGAGTTTGAGAACCCCAACATCAGAATACACCAAAATGGGTTGAGGTGGTGAATGCTATGTAGTGAACGCTTATGTAAGTGAGCACTTATGTAAGCGGTTGACCATTATGTAAGCTTGTGGTTTACGTAAACTGTTATGTAAGCTTTGACCATTATGTAAGCTTGTGGTTTACGTAAACTGTTATGTAAGCTTTGACCATTATGTAAGCTTGTGGTTTACGTAAACTGTTATGTAAGCTTTGACCATTATGTAAGCTTGTGGTTTACGTAAACTGTTATGTAAGCTTT
GGCCATTATGTAAGCTTTAAACACTTATGTAAGCTCGAGCCCAGTATGTAAGCAGATTGACCCATTATGTAAGCTTTGAACACTTATGTAAGCTCGAAACCGGTTAGGTAAGCAGCTTTGTAAGCAATCTGGACAATTATGTAAGCGGGTTACGTAAACAGTTATGTAAGCAGAAAAATTTCAAACGACAAAACTTGGGGTCTACAGACACAGTAGCCAGAAGATTGCACTACCATTCGACTCCTCATGACCCACTCTTTCGATCCATGTAGTTAGGTTACCGTTTTTCCTAATATTTAAGGATGTTGAAAATTCATTTTCATTTTTTTCGTTTTTAAGATTTTCTCACAACTCTTCCAAAGATTACTAGTTGACTTTTCAAATATTTAGGGTATTTTTCTCACTTTTTCCTAGCAAACTCCAATTGGTGGGTTCAGTGCAATGGAGTATCACCTTGCAACCACAACGTAATAGCTAACTTGTGGCCACCATGTCTGGTTGTAGAGATAATTGGATTCTAATGTGGATCACATGACTACTCACGTGTCAAAAACCCAACCTGACTTGGCCCAGCTTAGCAAGAATATTTCGAATCCACTCTTGTGGCCTAGTGGACAACTGGGAA AGCTTGCGACGCAGTCGTTTTTGGCGATCCAGGCGTAGTACTAGGTTCGAGCCTGGTCATTCAGATGGCTCAGAACTTGAGGTTGACTGAGTTCCAGGTTCGAGTCCAGGACGGGTTGGTTGGTGTCGTCGGCTTTCGGTTGGTCTTTG再用重叠延伸PCR的方法把5’ A0X-MCS-3’ AOX与rDNA非编码区片段连接起来(见图3)，并在其两端分别引入XbaI和KpnI酶切位点。整个构建流程见图4，所用引物序列为:Ppic9k-5，AOX-Xbal-Fw:5，GCTCTAGAAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGG 3，Ppic9k-3，AOX-Rv:5，CCCTTCCAGCGAAACAAGCTTGCACAAACGAACTTCTCAC 3，NTS-rDNA-Fw:5 ’ CGTTTGTGCAAGCTTGTTTCGCTGGAAGGGGAACTTTAGA 3’NTS-rDNA-Kpnl-Rv:5’ GGGGTACCCAAAGACCAACCGAAAGCCGACGA 3’用Kpn I和Xba I双酶切5’ A0X-MCS-3’ AOXtDNA非编码区片段并回收，再与同样双酶切的pUCZ质粒的回收产物连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a，筛选阳性重组子。阳性重组质粒委托英俊公司测序，结果表明5’ A0X-MCS-3’ AOX-rDNA非编码区片段正确插入PUCZ质粒且序列正确，并命名为PUCZ9K，质粒图谱见图5。5’ AOX-MCS-3’ AOX-rDNA 全长序列:TCTAGAAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCCACAGGTCCATTCTCACACATAAGTGCCAAACGCAACAGGAGGGGATACACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAACACCCACTTTTGCCATCGAAAAACCAGCCCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGCTCGCTCATTCCAATTCCTTCTATTAGGCTACTAACACCATGACTTTATTAGCCTGTCTATCCTGGCCCCCCTGGCGAGGTTCATGTTTGTTTATTTCCGAATGCAACAAGCTCCGCATTACACCCGAACATCACTCCAGATGAGGGCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAATAGTTTCATGTTCCCCAAATGGCCCAAAACTGACAGTTTAAACGCTGTCTTGGAACCTAATATGACAAAAGCGTGATCTCATCCAAGATGAA
权利要求
1.用于在酵母中表达外源蛋白的方法，其包括下述步骤: 1)构建表达载体，所述表达载体包含rDNA非编码区，抗生素抗性基因，分泌信号肽和外源蛋白的编码序列； 2)逐步增加抗生素的浓度，从而扩增所述表达载体的拷贝数，构建含有不同拷贝数的克隆的库； 3)选择表达克隆，表达并回收外源蛋白。
2.权利要求1所述的方法，其中所述rDNA非编码区在酵母基因组中具有多拷贝特性，分散在酵母的4条染色体上。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述rDNA非编码区序列为SEQID No:1。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其进一步包括低温下甲醇诱导外源蛋白分泌表达。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其还包括比较酵母胞内外源蛋白的量与分泌到上清中的外源蛋白的量的相对比例关系，从而选择表达克隆，表达并回收外源蛋白。
6.权利要 求1-5中任意一项所述的方法，其中所述外源蛋白的编码序列是未经密码子优化的序列或者是经密码子优化的序列，优选地所述外源蛋白是人白细胞介素-10。
7.权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中所述分泌信号肽包括α-因子、α -淀粉酶、葡糖淀粉酶、血清白蛋白分泌信号肽。
8.权利要求1-7中任意一项所述的方法中构建的表达载体。
9.包含权利要求8所述的表达载体的酵母菌株。
10.权利要求8所述的表达载体和权利要求9所述的酵母菌株用于表达人白细胞介素-10的用途。
全文摘要
本发明涉及人白细胞介素-10的高效表达方法。具体而言，本发明提供用于在酵母中表达外源蛋白的方法，其包括下述步骤1)构建表达载体，所述表达载体包含rDNA非编码区，抗生素抗性基因，分泌信号肽和外源蛋白的编码序列；2)逐步增加抗生素的浓度，从而扩增所述表达载体的拷贝数，构建含有不同拷贝数的克隆的库；3)选择表达克隆，表达并回收外源蛋白。所述外源蛋白优选为人白细胞介素-10。本发明还涉及用于本发明的方法的表达载体，包含本发明的表达载体的酵母菌株，以及本发明的表达载体和酵母菌株的用途。通过本发明的方法可以容易地获得具有产业化价值的hIL-10高效表达菌株，进而表达回收人白细胞介素-10。
文档编号C12R1/84GK103194480SQ20121000377
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者肖卫华, 钟永军, 田志刚, 郭雨刚, 李光伟, 沈翼, 张国英 申请人:中国科学技术大学