专利名称：一种从酿酒酵母细胞中高效提取高分子量基因组的方法
技术领域：
本发明涉及微生物的分子生物学领域，特别提供了一种从酿酒酵母细胞中高效提取高分子量基因组的方法。通过该方法提取的基因组可以满足许多分子生物学分析的需要。
背景技术：
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为低等真核生物,与同属真核生物的动物和植物细胞在结构上有很多相似性。早在1996年酿酒酵母的基因组测序工作就已完成，是被人们了解最多的微生物之一。酿酒酵母具有易于培养且繁殖迅速的特点，经常被用来作为研究真核生物的工程菌。酿酒酵母被广泛应用于食品生产和基因工程领域。目前对酿酒酵母的研究已经上升到了分子水平，随着对其生理机制研究的深入，酿酒酵母的一些功能蛋白的基因经常被用来在其它工程菌中克隆、表达。研究中对于酿酒酵母基因组的需求，无论是在量或质上都大为提高。目前实验室提取酵母基因组DNA的方法主要有试剂盒法、液氮研磨法、化学试剂法。但这些方法往往只能适用于部分酵母，缺乏通用性，对于酿酒酵母基因组的提取，效果往往不够理想。由于缺乏专门针酿酒酵母这一特定酵母基因组的提取方法，本专利通过多次优化实验流程和试剂配方，总结出一种从酿酒酵母细胞中高效提取高分子量基因组的方法。
发明内容
为了解决现有酵母基因组提取方法的不足，本发明提供了一种从酿酒酵母细胞中高效提取高分子量基因组的方法，包括破壁、去除组蛋白和RNA、抽提、沉淀、溶解，具体工艺过程如下: 破壁:破解细胞壁与细胞膜是提取基因组DNA的基础，由于酿酒酵母细胞壁结构比细菌细胞壁更为坚固、厚实，一般的溶菌酶并不能有效的分解酿酒酵母的细胞壁，因此本专利使用Iyticase来破除细胞壁。用500 μ I的山梨醇缓冲液悬浮酿酒酵母,加入40 μ 1> 1000U/ml的Iyticase和I μ I β -巯基乙醇，混匀后37°C孵育3h。去除组蛋白和RNA:对破壁后的细胞使用蛋白酶k和RNase去除染色体上的组蛋白和不需要的RNA。8000r/min lmin离心弃上清(加速要慢)，加500 μ ITE缓冲液(ρΗ8.0),混勻后加 50 μ 1、10% SDS，加入 10μ l、200mg/ml 蛋白酶 k，再加入 10μ lU0g/ml RNase，37°C孵育lh。抽提:加入500 μ I平衡酹,颠倒混勻、静置5min, 8000r/min离心lmmin。移取上层加入250 μ I平衡酚和250 μ I氯仿:异戊醇(24: I)颠倒混匀、静置5min，加500 μ I氯仿，颠倒混勻、静置5min,8000r/min离心lmin,取上层水相。
沉淀:取上层水相，加入2倍体积无水乙醇，-20°c放置lh。12000r/min离心IOmin。溶解:弃上清并置于超净台吹干，加入50 μ I ddH20溶解DNA。所述山梨醇缓冲液为:lmol/L，pH 7.5 ；所述TE 缓冲液为:ImoI/LTris.Cl，pH 8.0,0.5mol/L EDTA，0.5mol/L 柠檬酸，力口水至 1000ml ；Lyticase (1000U/ml)蛋白酶 k (200mg/ml) RNase (10g/ml)。本发明从影响酿酒酵母基因组提取的质和量入手，将破壁和去除蛋白、RNA的过程分开，分别采用不同的缓冲液及添加还原剂来保证破壁的效率和除去杂质的效果。在工艺过程上进行了更细致的优化，增加了抽提的次数，使基因组更加完整并提高了纯度，能更好地满足分子生物学的需求。
图1:1、2、3为本方法提取的基因组；4为用蜗牛酶法；5为SDS反复冻融法；M为λ-HindIII digestDNA 分子量标准。
具体实施例方式实施例1:挑取酿酒酵母BY4742单菌落培养至OD ^ 3，收集湿重约Ig的新鲜菌体，山梨醇洗漆一次；加入500 μ I的山梨醇缓冲液悬浮酿酒酵母，加入40 μ lU000U/ml的Iyticase和I μ I β -巯基乙醇，混匀后37°C孵育3h ；8000r/min lmin离心弃上清(加速要慢)，加500 μ I TE缓冲液(ρΗ8.0),混勻后加 50 μ 1、10% SDS，加入 10μ l、200mg/ml 蛋白酶 k，再加入 10μ lUOg/ml RNase，37°C孵育Ih ；加入500 μ I平衡酹,颠倒混勻、静置5min, 8000r/min离心lmin。移取上层加入250 μ I平衡酚和250 μ I氯仿:异戊醇(24: I)颠倒混匀、静置5min，加500 μ I氯仿，颠倒混勻、静置5min,8000r/min离心lmin,取上层水相；加入2倍体积无水乙醇，-20°C放置lh。12000r/min离心IOmin ；弃上清并置于超净台吹干，加入50 μ I ddH20溶解DNA。
权利要求
1.一种从酿酒酵母细胞中高效提取高分子量基因组的方法，其特征在于:包括破壁、去除组蛋白和RNA、抽提、沉淀、溶解，具体工艺过程如下: 破壁:用500 μ I的山梨醇缓冲液悬浮酿酒酵母，加入40μ lU000U/ml的Iyticase和1 μ 1 β -巯基乙醇，混匀后37°C孵育3h。
去除组蛋白和RNA:8000r/min Imin离心弃上清(加速要慢)，加500 μ ITE缓冲液(ρΗ8.0)，混匀后加 50 μ 1、10% SDS，加入 10 μ l、200mg/ml 蛋白酶 k，再加入 10μ lU0g/mlRNase，37 °C 孵育 Ih。
抽提:加入500 μ 1平衡酹,颠倒混勻、静置5min,8000r/min离心lmin。移取上层加入。250 μ I平衡酚和250 μ 1氯仿:异戊醇(24: 1)颠倒混匀、静置5min，加500 μ I氯仿，颠倒混勻、静置5min,8000r/min离心lmin,取上层水相。
沉淀:加入2 倍体积无水乙醇，_20°C放置lh。12000r/min离心lOmin。
溶解: 弃上清并置于超净台吹干，加入50 μ 1 ddH20溶解DNA。
所述山梨醇缓冲液为:lmol/L, pH 7.5 ； 所述 TE 缓冲液为:lmol/LTris Cl, pH 8.0,0.5mol/L EDTA，0.5mol/L 柠檬酸，加水至1000ml。
全文摘要
一种从酿酒酵母细胞中高效提取高分子量基因组的方法，包括采用lyticase破壁、蛋白酶k与RNase除去组蛋白和RNA、氯仿抽提、沉淀、溶解。本发明从影响酿酒酵母基因组提取的质和量入手，将破壁和去除蛋白、RNA的过程分开，分别采用不同的缓冲液及添加还原剂来保证破壁的效率和除去杂质的效果。在工艺过程上进行了更细致的优化，增加了抽提的次数，使基因组更加完整并提高了纯度。
文档编号C12N15/10GK103194440SQ20121000395
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者张震宇, 顾春银, 徐灿, 李忠浩, 杨冬美 申请人:江南大学