绿僵菌破坏素合成相关基因及其应用的制作方法

专利名称：绿僵菌破坏素合成相关基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及绿僵菌破坏素合成相关基因及其应用。
背景技术：
病原真菌与昆虫的互作是昆虫疾病预防和治疗的重要领域。昆虫病原真菌能够产生大量的具有不同生物活性的次级代谢产物，其中包括29种环状的六脂肽类的破坏素(destruxins, dtxs)。破坏素包括一个轻基异己酸(HIC)和五个氨基酸残基(图1)。已知的破坏素可以分为六大类，即dtx A-F及其衍生物。目前还没有一个真菌物种或菌株能够产生所有的破坏素种类。绿僵菌属是主要的破坏素产生菌，绿僵菌属有十几个种，包括寄主广谱的罗伯特绿僵菌和蝗虫专化的蝗绿僵菌。其中，罗伯特绿僵菌能够产生大部分的破坏素成份。此夕卜，白僵菌Beauveria felina,长抱轮枝菌Lecanicillium 1ngisporum和座壳孢类真菌也能一些破坏素，植物病原真菌芸苔链格孢Alternaria brassicae和Ophiosphaerella herpotricha报道能够产生破坏素B(即dtxB)及其衍生物。有研究报道绿僵菌产破坏素的能力与其寄主专化性有关。破坏素能够引起昆虫的细胞毒性，引发昆虫肌肉瘫痪和痉挛，引发的细胞毒性主要原理在于，破坏素作用于钙离子通道及液泡型的ATP酶。除了具有杀虫活性外，破坏素也具有医药功能，对于癌症、骨质疏松症、老年痴呆和乙型肝炎均不同程度的治疗活性。虽然具有杀虫活性的破坏素已于1961年获得鉴定，但负责dtx合成的基因一直不清楚。全人工化学合成破坏素已经有所报道，但是由于破坏素的结构复杂，人工合成的效率极低，且产率很低。综上所述，本领域迫切需要研究绿僵菌破坏素合成相关基因，以便改进破坏素的生产方法。

发明内容
本发明的目的就是提供绿僵菌破坏素生物合成的相关基因。本发明的另一目的是提供所述基因的功能和应用。在本发明的第一方面，提供了一种对宿主细胞进行改造的方法，包括步骤:(a)测定所述宿主细胞中属于破坏素合成基因簇的各相关基因的表达和/或活性；(b)根据测定结果，向所述宿主细胞中导入破坏素合成基因簇的相关基因，从而提高/恢复所述宿主细胞产生破坏素的能力，其中，所述的基因族的相关基因包括一种或多种以下基因:dtxSl基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在另一优选例中，所述的宿主细胞是绿僵菌。在另一优选例中，所述的宿主细胞包括罗伯特绿僵菌、蝗绿僵菌，较佳地，所述的罗伯特绿僵菌是所述破坏素合成基因簇的某一个或多个基因失活、或活性下降的罗伯特绿僵菌。在另一优选例中，当所述基因簇的dtxS4基因失活或活性下降时，还包括步骤:向培养体系中添加β -丙氨酸，以促进破坏素的形成。在本发明的第二方面，提供了一种提高罗伯特绿僵菌产生破坏素的能力的方法，包括步骤:向所述的罗伯特绿僵菌中导入破坏素合成基因簇的相关基因，从而提高所述罗伯特绿僵菌广生破坏素的能力，其中，所述的基因族的相关基因包括一种或多种以下基因:dtxSl基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在本发明的第三方面，提供了一种制备破坏素方法，包括步骤:(i)在适合培养的条件并且在添加丙氨酸的情况下，培养产生破坏素的宿主细胞，从而产生破坏素；和(ii)分离或纯化出所述的破坏素。在另一优选例中，所述的宿主细胞是罗伯特绿僵菌。在另一优选例中，所述的罗伯特绿僵菌是野生型罗伯特绿僵菌、或dtxS4基因失活或活性下降的罗伯特绿僵菌。在另一优选例中，所述的宿主细胞是导入外源破坏素合成相关基因的罗伯特绿僵菌，其中所述的基因选自下组:dtxSl基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在本发明的第四方面，提供了一种选自破坏素合成基因簇的相关基因被缺失的罗伯特绿僵菌，其中所述的基因包括一种或多种以下基因:dtxSl基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在另一优选例中，所述的罗伯特绿僵菌缺失了所述破坏素合成基因簇的1、2、3或4个基因。在另一优选例中，所述的罗伯特绿僵菌仅缺失dtxS2基因，但不缺失dtxSl基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在本发明的第五方面，提供了一种产生B类破坏素的方法，在适合培养的条件下，培养罗伯特绿僵菌，从而产生B类破坏素，其中所述的罗伯特绿僵菌仅缺失dtxS2基因，但不缺失dtxSl基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在另一优选例中，所述的罗伯特绿僵菌是通过对野生型罗伯特绿僵菌进行dtxS2基因敲除而产生的工程菌。在另一优选例中，所述的B类破坏素包括:dtxB、CltxB2、去甲基B。在本发明的第六方面，提供了一种绿僵菌，所述的绿僵菌含有导入的、外源的选自破坏素合成基因族的相关基因，其中所述的基因族的相关基因包括一种或多种以下基因:dtxSl基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在另一优选例中，所述的绿僵菌是罗伯特绿僵菌。在另一优选例中，所述的绿僵菌是可产生破坏素的野生型罗伯特绿僵菌。在另一优选例中，所述的罗伯特绿僵菌含有导入的1、2、3或4个选自所述破坏素合成基因族的基因。在本发明的第七方面，提供了一种产生破坏素的方法，在适合培养的条件下，培养本发明的第六方面所述的绿僵菌从而产生破坏素。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1显示了破坏素的结构。图2显示了罗伯特绿僵菌和幢绿僵菌的非核糖体多肽合成酶(nonrobiosomalpeptide synthetase, NRPS)蛋白聚类分析结果，图2A为采用腺苷结构域序列分析罗伯特绿僵菌(基因标记为MAA)和蝗绿僵菌(基因标记为MAC)结果，用黑体标注的结构域对应的基因只存在一种绿僵菌中，即在一种绿僵菌存在则在另一种绿僵菌中不存在；图2B为聚类分析DtxSl的腺苷化A结构域；图2C为聚类分析DtxSl的缩合C结构域。图3显示罗伯特绿僵菌野生型和各种突变型菌株发酵成分分析结果，其中，将作为目标基因进行基因敲除，野生菌株ARSEF 23在萨氏培养中培养一周后，能产生dtx A, dtxB及dtx E等8种破坏素(图3A和图3A’) ；dtxSl为非核糖体多肽合成酶(NRPS)，基因缺失突变株丧失了合成不同破坏素的能力(图3B和图3B’)；dtxS2为细胞色素P450单加氧酶，基因缺失后只产生dtxB等(图3·C和图3C’)；dtxS3为醛酮还原酶，基因敲除后绿僵菌不能合成任何破坏素，但当在其培养基中添加一个轻基异己酸(hydroxyisocaproic acid,HIC)时，突变菌株恢复产生破坏素(图3D和图3D’)；MAA_10046为谷氨酸脱羧酶，即dtxS4，负责将谷氨酸脱基得到β -丙氨酸，为破坏合成的最后一个非正常氨基酸，dtxS4基因敲除后绿僵菌不合成任何破坏素，但当在其培养基中添加β -丙氨酸时，突变菌株恢复产生破坏素(图3Ε和图3Ε’)。注:E-diol为:dtxE 二醇；DtxE为破坏素E ;DtxC为破坏素C ;DtxD为破坏素D ;DtxA为破坏素A ;DtxB2为破坏素B2 ;Desmethyl_DtxB为去甲基破坏素B ；DtxB为破坏素B ；HIC为轻基异己酸；β -Ala为β -丙氨酸。图4显示敲除罗伯特绿僵菌dtxSl上游基因MMA_10034-MAA_10042发酵成分分析结果，表明这些基因不参与破坏素的生物合成或修饰。图5显示罗伯特绿僵菌破坏素合成基因簇(图5A)及DTXSl非核糖体多肽合成酶、DTXS2细胞色素P450单加氧酶、DTXS3醛酮还原酶和DTXS4谷氨酸脱羧酶参与合成破坏素的生物途径(图5B)。注:缩写字母A表示NRPS中腺苷化结构域^表示硫醇化结构域；C表示缩合化结构域；E表示异构化结构域；NM表示N-甲基化结构域；NRPS为非核糖体多妝合成酶(nonrobiosomal peptide synthetase) ;Aldo_keto reductase 为醒酮还原酶；Aspartate-decarboxylase 为天冬氛酸脱竣酶；ct -hydroxyisocaproic acid 为轻基异己酸(HIC) ； a -Ketoisocaprioc acid 为 α-丽异乙酸；Amino acid 为氛基酸；Keto acid 为酮酸；transaminase为转氨酶；Leucine为亮氨酸；β -Alanine为β -丙氨酸。图6显示昆虫生物测定结果，其中，罗伯特绿僵菌野生菌株(WT)和突变株在察氏培养基中培养7天后，培养液过滤后用来注射家蚕5龄幼虫(50微升每头虫)，图6Α显示，野生菌株发酵液注射昆虫表现出立即的痉挛症状，几分钟后死亡，使用Λ dtxSl (图6B，I X IO6孢子/ml，每头10 μ I)和AdtxS2(图6C，I X IO6孢子/ml，每头10 μ I)发酵液注射的家蚕没有中毒症状；图6D为对照；图6E和图6F为破坏素的拒食作用结果，罗伯特绿僵菌野生菌株(WT)和不同基因突变株在察氏培养基中培养7天后，培养液涂布桑叶表面，dtxSl或dtxS2基因缺失突变株的发酵液涂布桑叶能够被家蚕大量取食(图6E)，而野生菌株发酵液涂布桑叶不被家蚕取食(图6F)。图7显示用罗伯特绿僵菌野生菌株(WT)和突变株注射蝗虫和家蚕，昆虫的死亡曲线，图7A为使用WT、AdtxSl和AdtxS2以及对照(无菌水)注射蝗虫后，蝗虫的死亡曲线；图7B为使用WT、Δ dtxSl和Λ dtxS2以及对照(无菌水)注射家蚕后，家蚕的死亡曲线。图8显示实时观察野生菌株和基因缺失突变株在昆虫体内的发育与宿主昆虫的免疫反应结果，其中，图8A显示，注射16小时后，野生菌株孢子(箭头所指)萌发并很快逃避血细胞的包囊作用；图88显示，AdtxSl菌株被严重黑化，大多萌发孢子(箭头所指)会受到血细胞的持续攻击，图8B'显示AdtxS2菌株表现出类似的特征；图8C显示，注射36小时后，与突变株相比，野生菌株能够在昆虫血腔中大量繁殖，以酵母出芽方式生成虫菌体(HB);图80显示，注射48小时后，血球计数板统计虫菌体和血细胞的数量结果；图8E显示，与未处理的昆虫相比(4.2 X IO7血细胞/μ I)，野生菌株和AdtxSl处理昆虫的血细胞数理下降了 4倍，而Λ dtxS2处理昆虫的血细胞下降了 3倍；图8F显示，收集此时的血淋巴，80%野生菌株感染昆虫的血淋巴不能变黑，如刚收集的新鲜血淋巴；但约75% AdtxSl和约70% Δ dtxS2处理昆虫的血淋巴均能够被黑化。注:HE为昆虫血细胞，HB为虫菌体。图9显示破坏素合成与绿僵菌的进化关系，图9A显示，高效液相色谱分析不同绿僵菌菌种及菌株产生破坏素的情况结果，菌株及菌种所图标所示；图9B显示用PCR法检测不同绿僵菌菌种及菌株中的dtxS I基因存在结果。注:M-robertsii为罗伯特绿僵菌；M.acridum为幢绿僵菌；M.anisopliae为金龟子绿僵菌；M.guizhouense为贵州绿僵菌；M.pingshaense为平沙绿僵菌；M.majus为大孢绿僵菌；M.brunneum为棕色绿僵菌；M.album为白色绿僵菌；M.frigidum为低温绿僵菌。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次公开了一个破坏素合成基因簇(genecluster),所述基因簇包括dtxSl (非核糖体多肽合成酶)、dtxS2 (细胞色素P450单加氧酶)、dtxS3(醛酮还原酶)和dtxS4(谷氨酸脱羧酶)等相关基因。本发明还公开了对宿主细胞进行改造的方法、提高罗伯特绿僵菌产生破坏素能力的方法、和产生B类破坏素的方法等应用。在此基础上完成了本发明。破坏素合成相关基因及蛋白如本文所用，本发明公开了一种破坏素合成基因簇(gene cluster),所述基因簇包括:dtxSl基因，dtxS2基因，dtxS3基因，和dtxS4基因。其中，dtxSl基因编码非核糖体多肽合成酶，且dtxSl基因至少具有选自下组的一个或多个特征:⑴编码如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；(ii)编码如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的由(i)衍生的多肽；(iii)具有如SEQ ID NO:6所示的多核苷酸序列；(iv)具有与SEQ ID NO:6所示序列互补的多核苷酸。
dtxS2基因编码细胞色素P450单加氧酶，且dtxS2基因至少具有选自下组的一个或多个特征:⑴编码如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；(ii)编码如SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的由(i)衍生的多肽；(iii)具有如SEQ ID NO:8所示的多核苷酸序列；(iv)具有与SEQ ID NO:8所示序列互补的多核苷酸。dtxS3基因编码醛酮还原酶，且dtxS3基因至少具有选自下组的一个或多个特征:(i)编码如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；(ii)编码如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的由(i)衍生的多肽；(iii)具有如SEQ ID NO: 10所示的多核苷酸序列；(iv)具有与SEQ IDNO:10所示序列互补的多核苷酸。dtxS4基因编码谷氨酸脱羧酶；且dtxS4基因至少具有选自下组的一个或多个特征:⑴编码如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；(ii)编码如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的由(i)衍生的多肽；(iii)具有如SEQ ID NO:12所示的多核苷酸序列；(iv)具有与SEQID NO:12所示序列互补的多核苷酸。在得到了破坏素合成相关基因的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的雯库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的雯库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到核苷酸序列(或其片段，衍生物)的。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤:
(I).用多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员能使用熟知的方法构建表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法 :磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。材料与方法真菌菌株与培养条件野生型的罗伯特绿僵菌ARSEF 23为广谱性昆虫病原真菌，蝗绿僵菌CQMal02为蝗虫专化真菌，以上真菌在土豆培养上于25°C、黑暗培养到充分产孢后于4°C保存备用。非核糖体多肽合成酶基因分析与基因敲除对罗伯特绿僵菌ARSEF 23和蝗绿僵菌CQMa 102进行测序，获得测序的基因组数据，对该数据进行比较基因组分析，寻找非同源性的非核糖体多肽合成酶基因。为此，两种绿僵菌中的所有NRPS蛋白的腺苷化结构域被提取出来后，进行比对与进化分析。为了分析基因的功能，采用同源替换重组进行系列基因敲除。具体地，将不同目标基因的侧翼序列使用不同引物扩增后，链接到常规的二元载体中进行农杆菌转化，该载体中包含有草胺磷抗性标记。破坏素诱导
为了验证破坏素合成相关基因dtxS2、dtxS3和dtxS4的功能，底物dtxB，a -HIC和β-Ala被加入相应突变株中的培养液中，使其终浓度为10mM。在25°C、200rpm下培养7后，以醋酸乙酯提取破坏素，粗提物溶于Iml的甲醇后，使用0.22微米孔径的膜进行过滤，再用高效液相色谱和液质联用分析。整个实验重复两次，每个处理三个重复。为了检测感染虫体产生破坏素的情况，绿僵菌感染后的家蚕幼虫僵虫冷冻干燥后进行破坏素提取。色谱、质谱和核磁分析破坏素粗提物的色谱分析使用岛津公司的LC-20AD HPLC系统，包含反相的C18柱(孔径大小:5微米；长:4.6X250毫米)和一个SPD-20A的紫外/可见光检测器。流动相采用线性梯度:去离子水和甲醇的比例90: 102min,55: 452min，39: 6122min，5: 955min和90: 108min，每分钟0.1毫升的流速，在215纳米波长下进行检测。使用dtx A标准品(Sigma)、纯化的dtx B和dtx E生成标准曲线,量化分析不同菌株产生不同种类破坏素的含量。真菌感染僵虫内产生破坏素使用离子色谱进行分析。不同成份的分子量使用Agilent G6520A进行液质联用分析。为了验证dtxS2突变株的产物,使用BrukerARX 600spectrometer (600/150MHz)和 fcuker AM-400 (400/100MHz)仪器进行核磁分析。昆虫生物测定五龄家蚕幼虫和蝗虫成虫被分别用来进行生物测定。家蚕的每头幼虫，从第二腹足基部注射10微升的5 X IO5的孢子/微升的野生型和突变株孢子悬液；蝗虫从腹间膜注射10微升5X IO6的孢子/微升的野生型和突变株孢子悬液。每个处理3个重复、每重复10头昆虫,整个实验重复两次。每12小时记录一个昆虫死亡数据。额外的家蚕幼虫被注射后以用于观察真菌于昆虫体内的发育情况。致死中时LT5tl采用SPSS 17软件进行统计分析。不同绿僵菌中PCR检测dtxSl基因和系统进化分析为了检测不同绿僵菌基因组事的dtxSl基因存在与否，使用引物dtxF和dtxR对基因组DNA进行PCR扩增。用引物itsF和itsR扩增不同绿僵菌的rRNA基因的内转录间隙序列(ITS),以尖孢镰刀 菌(Fusarium graminearum)的ITS序列为对照,分别进行比对和使用MAGA 5.0进行进化聚类分析，推测不同绿僵菌的进化关系。引物信息如下:dtxF(SEQ ID NO:1)，序列为:AGATTTGCCGCAGCTACCTA ；dtxR(SEQ ID NO:2)，序列为:CACCAGATGCGAGTTCTCAA ；itsF(SEQ ID NO:3)，其序列为:TTACGTCCCTGCCCTTTGTA ；itsR(SEQ ID NO:4)，其序列为:ACCTCACCAAAAGCATCCTC。实施例1破坏素合成基因的预测1.罗伯特绿僵菌菌株ARSE 23在察氏培养中能够产生破坏素，而蝗绿僵菌菌株CQMa 102不能够产生。本实施例对两种真菌进行了比较基因组分析。结果表明，罗伯特绿僵菌与蝗绿僵菌的基因组结构存在良好的共线性关系，表明蝗绿僵菌不产生破坏素是由于其基因组中不含破坏素合成基因。2.将罗伯特绿僵菌和蝗绿僵菌基因组编码分别编码的15个及13个NRPS蛋白进行了聚类分析，结果见表I和图2。表I
权利要求
1.一种对宿主细胞进行改造的方法，其特征在于，包括步骤: (a)测定所述宿主细胞中属于破坏素合成基因簇的各相关基因的表达和/或活性； (b)根据测定结果，向所述宿主细胞中导入破坏素合成基因簇的相关基因，从而提高/恢复所述宿主细胞产生破坏素的能力， 其中，所述的基因族的相关基因包括一种或多种以下基因:dtxSl基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是绿僵菌。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述基因簇的dtxS4基因失活或活性下降时，还包括步骤:向培养体系中添加β -丙氨酸，以促进破坏素的形成。
4.一种提高罗伯特绿僵菌产生破坏素的能力的方法，其特征在于，包括步骤: 向所述的罗伯特绿僵菌中导入破坏素合成基因簇的相关基因，从而提高所述罗伯特绿僵菌广生破坏素的能力，其中，所述的基因族的相关基因包括一种或多种以下基因:dtxSl基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。
5.一种制备破坏素方法，其特征在于，包括步骤: (i)在适合培养的条件并且在添加丙氨酸的情况下，培养产生破坏素的宿主细胞，从而产生破坏素；和 ( )分离或纯化出所述的破坏素。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是导入外源破坏素合成相关基因的罗伯特绿僵菌，其中所述的基因包括一种或多种以下基因:dtxS I基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。
7.一种选自破坏素合成基因簇的相关基因被缺失的罗伯特绿僵菌，其特征在于，所述的基因族的相关基因包括一种或多种以下基因:dtxS I基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。
8.—种产生B类破坏素的方法，其特征在于，在适合培养的条件下，培养罗伯特绿僵菌，从而产生B类破坏素，其中所述的罗伯特绿僵菌仅缺失dtxS2基因，但不缺失dtxSl基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。
9.一种绿僵菌，其特征在于，所述的绿僵菌含有导入的、外源的选自破坏素合成基因簇的相关基因，其中所述的基因族的相关基因包括一种或多种以下基因:dtxSl基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。
10.一种产生破坏素的方法,其特征在于,在适合培养的条件下,培养权利要求9所述的绿僵菌，从而产生破坏素。
全文摘要
本发明涉及绿僵菌破坏素合成相关基因及其应用。具体地，本发明公开了绿僵菌的破坏素合成基因簇(gene cluster)，所述基因簇包括dtxS1(非核糖体多肽合成酶)、dtxS2(细胞色素P450单加氧酶)、dtxS3(醛酮还原酶)和dtxS4(谷氨酸脱羧酶)等相关基因。本发明还提供了所述破坏素合成相关基因的应用。
文档编号C12N15/60GK103194461SQ20121000412
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者王成树, 王兵, 卢玉珍, 张四维 申请人:中国科学院上海生命科学研究院