一种人工改造合成的dORF2^art基因及其编码的蛋白质的制作方法

专利名称：一种人工改造合成的dORF2^art基因及其编码的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种猪圆环病毒2型(PorcineCircovirus Type 2，PCV2)的除去核定位信号的经密码子修饰的d0RF2art基因，该基因编码的核衣壳 蛋白dCap，及核衣壳蛋白dCap在重组乳酸乳菌球中的表达。
背景技术：
据有关部门统计，我国养猪业每年因各种疾病造成的直接经济损失总计达上百亿 元，直接导致生产成本上升。另外，因疾病所造成的病原污染及治疗药物残留的食物安全问 题对人类健康也构成一定的威胁。由此可见，目前影响我国养猪业的瓶颈已经不是猪种、饲 料和市场，而是各种疾病所带来的威胁。疾病的流行是制约我国养猪业可持续发展的主要 因素。因此，采取有效措施控制猪病，对促进养猪业的健康发展和提高动物源性食品安全性 具有重要的意义。猪免疫抑制性疫病已成为全球规模化养猪所面临的一大问题。原因之一是猪群被 猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2，PCV2)感染，导致群体免疫力和健康水平下 降，使猪群对疾病的易感性增高。同时研究表明，PCV2感染可引起继发性免疫缺陷，发病或 感染猪至少存在短暂的不能激发有效的免疫应答现象。猪圆环病毒(PorcineCircovirus, PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆 环病毒属(Circovirus)，其基因组是一种环状、单链DNA，长约1760bp左右，分子量为 0. 58X 106Da。PCV对外环境抵抗力较强，在酸性环境及氯仿中可以存活较长时间。根据PCV 的致病性、抗原性及核苷酸序列差异可将其分为PCV1和PCV2两型。PCV1无致病性，而PCV2 是引发猪断奶后多系统衰弱综合症(Post WeaningMultisystemic Wasting Syndrome, PMWS)的主要病原。该病主要以患畜生长迟缓、进行性消瘦和多系统病理损伤为特征。此外， PCV2还与猪皮炎与肾病综合症(Porcine Dermatitis And Nephropathy Syndrome，PDNS)、 新生仔猪先天性脑阵颤、增生性坏死肺炎以及怀孕母猪的繁殖障碍等疾病有关。PCV2已给 全球养猪业造成巨大的经济损失。因此，近几年来有效预防和治疗PCV2感染受到了业界的 普遍关注。迄今为止，对PCV2感染尚无有效防治措施。在国内，疫苗研究仍处于实验室研究 阶段，尚无商品化疫苗问世。在国外，尽管有报道已成功研制出PCV2注射疫苗，正在我国进 行申报，但我们估计其价格不菲，我国养猪业能否承受如此代价仍是未知数。另一方面，传 统的注射疫苗在使用过程中存在严重的免疫应激，常导致猪只发热、采食量明显下降、以及 生长放缓等副作用，因此，如何减少免疫应激也是业界一直关注的问题。再者，传统的DNA 疫苗虽然制备简单、成本低廉、可诱导体液免疫和细胞免疫，但是，质粒DNA导入细胞/机体 的效率低下，外源基因表达水平低，DNA在宿主细胞内持续表达可能诱发免疫耐受、自身免 疫、过敏反应和超免疫性，并可能诱导抗DNA抗体，而且存在整合到宿主染色体上的风险。 这些局限促使研究者寻找一种更为安全、表达水平更高、免疫效果更好的免疫调节剂，如由 病毒囊膜蛋白或核衣壳蛋白制备的口服(滴眼或鼻拭、喷)疫苗，通过粘膜免疫以获得免疫保护。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是一种无入侵性，无病原性的食品安全级 (GRAS)微生物，被认为是粘膜水平上投递抗原和药物分子的良好载体。相对于乳杆酸 (Lactobacillus)，乳酸乳球菌因其不定植于动物肠道中，不会引起动物的抗药性等特点而 受到广泛的认可和运用。通过免疫刺激动物的口腔、呼吸道、生殖道以及眼角膜等，乳酸乳 球菌可将抗原有效地递逞到粘膜免疫系统。乳链球菌素诱导的表达系统(Nisin Control Expression System，NICE系统) 是目前广泛研究和使用的乳酸乳球菌表达系统，该菌属于革兰氏阳性菌，以乳链球菌素 (Nisin)为诱导剂。Nisin是FDA批准可用于食品生产加工中的食品级防腐剂。以Nisin 为诱导剂的NICE系统，避免了如大肠杆菌、酵母菌等表达系统以IPTG、甲醇等有毒物质为 诱导剂，在诱导剂层面保证了安全；同时该系统为紧密型表达系统，具有不含包涵体、含有 较少的蛋白酶、下游操作简单，以及便于大规模发酵等优点。因此NICE系统是制备粘膜免 疫疫苗的理想表达系统。密码子偏好性是制约外源基因在NICE表达系统中获得高效表达的主要因素之 一。随着生物信息学和基因化学合成的发展，在不改变氨基酸序列的前提下，根据宿主的 密码子偏好性对外源基因进行密码子修饰并进行化学合成经修饰的基因已成为可能。该技 术使得更多的外源基因可在乳酸乳球菌表达系统中进行表达，同时许多研究表明经密码子 修饰的基因其编码的蛋白质具有同样的生物功能，即基因密码子修饰对蛋白质功能并无影 响。

发明内容
针对以上问题，本发明旨在构建含PCV2的d0RF2art基因的重组乳酸乳球菌表达系 统，在重组乳酸乳球菌中表达由其编码的dCap衣壳蛋白。本发明的第一个目的在于提供一种人工改造合成的d0RF2art基因，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO 1 所示。本发明的第二个目的在于提供一种含有权利要求1所述(101^2"1基因的原核表达 载体。本发明的第三个目的在于提供一种用d0RF2art基因原核表达载体转化的重组乳酸 乳球菌(Lactococcus lactis NZ9000)，并表达 dCap 蛋白。本发明的第四个目的在于提供一种构建d0RF2art基因原核表达载体的方法，包括 以下步骤1)根据乳酸乳球菌密码子偏好性设计并人工合成d0RF2art基因；2)首先利用限制性内切酶将步骤1)人工合成的d0RF2art基因进行酶切，再通 过连接酶将该基因插入至原核表达载体(PNZ8048)，得到d0RF2art基因原核表达载体 (pNZ8048-d0RF2art)。本发明的技术路线为1)根据乳酸乳球菌密码子偏好性设计d0RF2art基因；2)按照步骤1)所设计的核苷酸序列人工合成d0RF2art基因；3)构建 d0RF2art 基因原核表达载体 pNZ8048-d0RF2art ；
4) pNZ8048-d0RF2art 转化乳酸乳球菌；5)乳酸乳球菌转化子(Lactococcus lactis NZ9000)诱导表达dCap蛋白。本发明所述d0RF2art基因针对表达宿主菌_乳酸乳球菌的密码子偏好性，通过生 物信息学方法对野生型的d0RF2基因(d0RF2rt)进行密码子偏好性修饰，以提高其在宿主中 表达量。经密码子修饰的d0RF2art基因，相对于野生型基因，579个碱基中共有142个碱基 进行了修饰，其中72个碱基进行了转换(同类嘌呤或嘧啶间相互转化)，70个碱基进行了 颠换(嘌呤嘧啶间相互转化)。密码子修饰后d0RF2art基因经DNAstar软件验证后证实其 所编码的氨基酸序列与野生型的相同。本发明采用乳酸乳球菌作为表达宿主，由于该菌为益生菌，所以其表达过程中产 生的外源蛋白无需分离、纯化，就可以作为口服疫苗直接饲喂动物；同时该菌可调节动物胃 肠道的非特异性免疫功能，从而赋予了普通微生态制剂特异性免疫调节的功能。


图 1 是重组表达载体 pNZ8048-d0RF2art 的酶切图，M :DNA markerDL5000,1 5 pNZ8048-d0RF2art Nco I.Sac I 酶切产物；图 2 是本发明 dCap 蛋白 SDS-PAGE 电泳分析图，M :proteinmarker，1 3 :Nisin 诱导浓度依次为 30ng/ml，20ng/ml，10ng/ml ；图3是本发明d0RF2art原核达载体pNZ8048_d0RF2art的构建流程图。图4是人工改造dORFart与野生型d0RF2wt编码的氨基酸序列的同源性比较图， Query代表d0RF2wt基因序列即野生型d0RF2基因；Optimised代表d0RF2art基因序列即修饰型d0RF2基因；*代表颠换(嘧啶一嘌呤 /嘌呤一嘧啶)代表转换(嘧啶一嘧啶/嘌呤一嘌呤)。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。材料与来源限制性内切酶Ncol、SacI、T4DNA连接酶均购自宝生物(大连)公司，E. coli MC1061、乳酸乳球菌载体pNZ8048及乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000购买自荷兰 NIZ0 Food Research, NL。pNZ8048是一种具有广泛宿主范围的载体，可在L. lactis和E. coli中复制，带有 氯霉素(Cm)抗性筛选标记；L. lactis NZ9000由泛素缺陷型菌株MG1363衍生而来，其染色 体上整合有nisK和nisR基因；E. coliMC1061用于重组载体的克隆和大量DNA制备。实施例1设计d0RF2art基因核苷酸序列以GenBank发布的d0RF2[gi 147883260]为基础，截去前123个碱基，针对表达宿 主乳酸乳球菌的密码子偏好性，用OPTIMIZER(http://genomes.urv. es/0PTIMIZER/)对其 进行密码子修饰，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。实施例2化学合成经密码子修饰的基因在经设计的d0RF2art基因两端加上Ncol，SacI酶切位点序列，并委托宝生生物工 程(大连)公司进行化学合成并克隆至pMD19-T-sample，得到pMD 19_d0RF2art。
实施例3 pNZ8048-d0RF2art原核表达载体的构建构建过程参阅图3，Ncol和SacI分别双酶切pMD19_d0RF2art和pNZ8048原核表达 质粒，凝胶回收。16°C连接过夜，再转化E. coliMC1061，氯霉素抗性筛选，挑6个阳性菌落， 分别进行PCR和Nco I, Sac I双酶切鉴定，鉴定结果参阅图1。符合预期结果的菌株编号 为MC1061-dCap，送往上海英骏生物技术有限公司进行测序，所得结果与GenBank的Blastn 比对，分析d0RF2art与野生型d0RF2wt之间编码的氨基酸序列的同源性，参阅图4，比对结果 证明d0RF2art与d0RF2wt编码的氨基酸序列完全相同实施例4 dCap蛋白的诱导表达将鉴定正确的携有(101^2心基因的原核表达载体电击转化至乳酸乳球菌 Lactococcus lactis NZ9000中。挑取单菌落接种到含氯霉素(5 ii g/ml)的GM17液体培养 基中，30°C，静置培养过夜。次日，按2%的接种量接种到含氯霉素(5i!g/ml)的GM17液体 培养基中；当0D600 ^0.4时，加入10mg/ml的Nisin至其终浓度为10ng/ml，30°C下诱导 5h后收菌，12% SDS-PAGE进行分析，证实有dCap蛋白的表达，分子量约为22kD，与预期结 果相符合。结果参阅图2。GM17培养基配方及配置方法胰蛋白胨5. 0g ；大豆胨5. 0g ；牛肉膏5. 0g ；酵母膏 2. 5g ；抗坏血酸 0. 5g ;MgS04. 7H20 0. 25g ；磷酸甘油二钠 19. 0g ；蒸馏水 1000ml。pH 6.9。 121°C灭菌冷却之后再加入预先已灭菌的20% (w/v)葡萄糖溶液至终浓度为0.5% (w/v)
权利要求
一种人工改造合成的dORF2art基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.含有权利要求1所述d0RF2art基因的原核表达载体。
3.用权利要求2所述原核表达载体转化的乳酸乳球菌。
4.一种构建d0RF2art基因原核表达载体的方法，包括以下步骤1)根据乳酸乳球菌密码子偏好性设计并人工合成d0RF2art基因；2)将步骤1)人工合成的d0RF2art基因，首先通过限制性内切酶进行酶切，再通过连接 酶将该基因插入至原核表达载体，得到d0RF2art基因原核表达载体。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，公开了一种猪圆环病毒2型(PorcineCircovirus Type 2，PCV2)的除去核定位信号的经密码子修饰的dORF2art基因，该基因编码的核衣壳蛋白dCap，及核衣壳蛋白dCap在重组乳酸乳菌球NZ9000(Lactococcus lactis NZ9000)中的表达。所述dORF2art基因可在重组乳酸乳球菌NZ9000中表达PCV2囊膜蛋白，为制成抗PCV2粘膜免疫苗打下了良好的基础。
文档编号C12N1/21GK101875941SQ20101012116
公开日2010年11月3日 申请日期2010年3月9日 优先权日2010年3月9日
发明者李适云, 李雪玲, 梁关海, 罗奇, 罗文华, 胡文锋, 胡斌, 陈晓鹏 申请人:胡文锋