专利名称：：一种鉴定春兰品种的方法
技术领域：
：本发明属植物品种鉴定方法，涉及植物遗传标记和品种鉴定方法，是一种基于基因组SSR遗传分析技术的春兰品种分子鉴定方法。
背景技术：
：春兰(Cymbidiumgoeringii)属多年生草本植物，为传统国兰之一，原产中国，有着悠久和栽培和选育历史，春兰至少包括约200个传统品种。在中国它是最昂贵的盆栽花卉之一，具有极高观赏价值和文化价值。在品种的遗传改良过程中，正确地划分品种群，明晰品种间的亲缘关系，对亲本的选择和选配具有指导意义，也是育种工作成败的关键之一。关于春兰品种的传统分类是以瓣型如萼片和花瓣的形态和颜色划分为主。用传统方法对品种分类鉴定具有直观简便等优点，但这种表现型鉴定易受环境影响，准确性不够，性状多态性也不够，是遗传标记的初始阶段，具有很大的局限性。随着人们对品种资源遗传特性认识的不断深化和分子生物学的发展，分子标记技术广泛应用于对物种的遗传分析。对春兰品种遗传多态性研究国内已有报道，但品种数量较少，且多采用随机引物，特异性相对较差。已有的研究表明，不同物种基因组DNA多态性的程度因物种及检测方法而异。本发明基于蝴蝶兰EST序列成功开发了春兰的SSR标记。春兰基因组DNA的多态性为100%，平均每个引物扩增的DNA条带数为8.77条。
发明内容本发明的目的是提供一种鉴定春兰品种的方法。是基于简单重复序列基因组SSR分析的春兰品种分子鉴定方法，通过优化春兰简单重复序列(SSR)分析的技术体系，明晰春兰品种的遗传关系。本发明通过以下步骤实现(1)提取已知的现有112个春兰品种基因组DNA；(2)对所提取的春兰品种基因组DNA分别进行聚合酶链式反应(PCR反应)，得到简单重复序列(SSR)产物；(3)以6%变性聚丙烯酰胺凝胶为介质对简单重复序列(SSR)产物进行电泳分离，总上样量为5iiL，其中4iiL为扩增产物，另加liiLLoadingBuffer，在60W下恒功率电泳至marker跑至胶板2/3处；(4)电泳结束后，经Bassam银染方法在数码相机下照相，分别得到SSR标准图谱；(5)选择清晰SSR图谱，采用“0-1”系统记录谱带，将有带的赋值为1，无带的赋值为0，读取春兰每个品种材料在不同引物扩增的产物的电泳谱带的数据，建立数据库；(6)基于Dice系数按非加权配对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析，得到系统聚类树；(7)将所需鉴定的春兰品种按上述步骤(1)-(5)，得到所需要鉴定春兰品种的序列图谱，将此序列图谱与标准图谱进行比较判定，得到分析鉴定结果。其中聚合酶链式反应的反应体系如下20iiL反应体系，正向反向引物均为10pmol(0.4iiL)，TaqDNA聚合酶0.5U(0.2uL),dNTP0.2mM1.6uL,1XPCRbuffer(包括lOmMTris-HCl(pH8.3)50mMKC1)(2uL),模板DNA(50ng)1uL，超纯水14.4uL0聚合酶链式反应所述的引物参见表1。所述春兰基因组DNA的聚合酶链式反应中Taq酶的用量为0.5U。所述春兰基因组DNA的聚合酶链式反应中引物的浓度为0.5umol/L。所述春兰基因组DNA的聚合酶链式反应中引物的退火温度见表1。本发明能有效扩增春兰品种基因组DNA模版，使其扩增产物多态性比率达到100%，平均每条带出现的品种次数为26.96个(变幅1-108)，频率为0.23(变幅为0.01-0.92)，其变异系数115.56%。本发明创立了有效解决春兰遗传关系的技术方法。本发明的鉴定品种方法直接检测品种的DNA序列差异，既具有遗传稳定性，又具有信息多样性，可以明确区分和判别春兰的不同品种，实现准确、快速鉴定品种，从而为品种鉴定、种苗市场管理、品种保护及良种繁育等提供可靠技术。本发明优化春兰基因组DNA的SSR技术体系，使春兰品种分子鉴定速度快、时间短、多态性多，能够在交易前解决兰苗真实性检验等问题，避免造成生产者或购买者的损失。本方法运用1个及以上有效引物可以区分和鉴定所有春兰品种，实现春兰品种的DNA指纹鉴定。图1为SSR扩增产物电泳图(左为引物CY16，右为引物CY34)。图2为聚类分析得到的系统树(包括112个春兰标准品种及1个春兰验证测试品种)。具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例一(1)提取现有112个春兰品种叶片基因组DNA;(2)以所提取的春兰品种基因组DNA分别进行聚合酶链式反应(PCR反应)，得到简单重复序列产物；(3)用6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行简单重复序列产物电泳分离，总上样量为5yL，其中4yL为扩增产物，另加1yLLoadingBuffer,在60W下恒功率电泳至marker跑至胶板2/3处；电泳结束后，经Bassam银染方法在数码相机下照相，分别得到简单重复序列标准图谱；(4)选择清晰简单重复序列图谱，采用“0-1”系统记录谱带，将有带的赋值为1，无带的赋值为0;(5)读取每个春兰品种材料在不同引物扩增的产物的电泳谱带的数据，建立数据库；(6)基于DICE系数按非加权配对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析，得到系统聚类树；(7)将所需鉴定的春兰品种按上述步骤进行分析，得到所需要鉴定春兰品种的简单重复序列图谱，将简单重复序列图谱与标准图谱进行比较，得到分析鉴定结果。其中聚合酶链式反应的反应体系如下:20iiL反应体系，正向反向引物均为lOpmoKO.4uL),TaqDNA聚合酶0.5U(0.2yL)，dNTP0.2mM1.6uL,1XPCRbuffer(包括lOmMTris-HCl(pH8.3)50mMKC1)(2yL)，模板DNA(50ng)1uL,超纯水14.4uL0其中聚合酶链式反应的引物参见表1。所述春兰基因组DNA的聚合酶链式反应中Taq酶的用量为0.5U。所述春兰基因组DNA的聚合酶链式反应中引物的浓度为0.5umol/L。所述春兰基因组DNA的聚合酶链式反应中引物的退火温度见表1。本发明具体提取112个春兰品种叶片基因组DNA，运用SSR技术进行春兰品种遗传关系和分子鉴定研究。从13个SSR引物中所获结果如表3所示，共得到114条扩增带，均为多态性带，多态性比率为100%，平均每个引物扩增条带为8.77条。平均每品种显示多态性扩增带27.45条(变幅为8-43)，其变异系数为24.07%；平均每条带出现的品种次数为26.96个(变幅1-108)，频率为0.23(变幅为0.01-0.92)，其变异系数115.56%(参见表4)。可见品种间SSR扩增的数目有区别，其位点变异更大，这说明供试的品种间DNA序列存在不同程度差异，根据每个品种形成的DNA指纹可以有效地判别出品种间的遗传差异，给品种的分子鉴定提供了技术保证。采用的13对简单重复序列引物，分别得到了112个春兰品种叶片基因组简单重复序列的电泳图谱。共检测出9条特征带，分布在8个引物中，分别为‘四喜蝶’的扩增产物中有1条(CY8-G)，‘文漪’的扩增产物中有1条(CY11-A)，‘罗翠隆梅’的扩增产物中有2条(CY14-A，CY15-A)，‘奎字’的扩增产物中有1条(CY14-B)，‘盖荷’的扩增产物中有1条(CY16-D)，‘张荷素’的扩增产物中有1条(CY-24A)，‘文俊蝶’的扩增产物中有1条(CY26-F)，‘蝴蝶龙，的扩增产物中有1条(CY34-N)。其引物分布是CY8、CY11、CY15、CY16、CY24、CY26各1条，CY14有2条(参见表2)。图1分别为引物CY16和CY34的简单重复序列的扩增产物电泳图。通过SSR扩增带的信息对春兰品种亲缘关系进行UPGMA聚类分析，得到其DNA分子系统树图。可将春兰中分为3个品种群，S卩品种群A(含18个春兰标准品种)；品种群B(含90个春兰标准品种及1个验证测试品种)和品种群C(含4个春兰标准品种)。品种群B又可分为2个品种亚群(参见图2)。品种群A内有共有带3条，多态性条带百分率为95%。品种群B内未发现共有带，多态性条带的百分率为100%。品种群C内有共有带7条，多态性条带的百分率为81.58%(参加表5)。实施例二利用已经建立的数据库图谱对‘老龙字’品种(图2中代号为LLZ)进行鉴定，通过13对引物的组合，结合计算相似系数，将其纳入标准图谱数据库进行聚类分析，发现其与‘龙字’品种(图2中代号为LZ)紧密结合。对LZ和LLZ的指纹图谱进行统计检验，列联表配对卡方检验P值为1，显示两个品种具有相同的指纹图谱。Kappa检验的P值为0，因此拒绝无效假说而认为两个品种具有品种一致性，结合Kappa指数为0.958，可以认为它们之间具有极高的一致性。最终可以将其判定为‘龙字’品种。总之，运用1个及以上有效引物可以区分和鉴定标准库里的所有春兰品种，不断扩大标准库里春兰品种的数量，将最终完全实现对春兰品种的DNA分子指纹鉴定。无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可应用本发明对春兰品种进行遗传分析，对品种进行鉴定。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。表1设计的正向反向引物_6正向序列(5'—3')引物CY2CY8CY11CY13CY14CY15CY16CY17CY24CY26CY32反向序列(5'—3')CCCAAGACGCATAAAGATTGCCCAGATGGTGGTAGGTATGTGTGAGAGGGTGCCAATTAGTCACATCCATAAACGATTTATGTAGCCGACCCCCCTGCTCCACTCACCTGTTAAAGTGACAGGGTAAGAGTGAGGCGAAGATGTTGTTGAACATGCTCACTTTTACTGCACCACTCACCCTCCACCCTCGTCTTAGAATGGGAGCACTTTGGGCGTCTTTGTGGTGGACT退火温度CC)50.450.460.64950.550.5AGCAACGATGGAGCAAGAGCTGACCACGCTAACCTCTGAATCACATCTCAAGGGTTAGAAGGTAGCCGAGTCATAGGTCCCGAGCCTCACATAAAAAGCAGTTCCATAAAGATTGTTATGAATCACAACCCAATGCTCTTCTGTTTCTATGTCCCTCCCTCGTTGTAGCCTCCTGCTCCTCCCGATTTCTTCGTTCACAATGCTTGGACCTC56.351.953.44953.4CY33TTCGCTTGCTAACTACCACTACACCCACCATCCCAAAATCCY344951.9表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表313个SSR引物序列及其序列扩增情况引物正向序列(5反向序列(5‘3')GC%扩增总条多态性条多态性条带带数带数百分数(％)CY2CY8CY11CY13CY14CY15CCCAAGACGCATAAAGAT44.44TGCCCAGATGGTGGTAGG61.11TATGTGTGAGAGGGTGC52.94CAATTAGTCACATCCATAAAC33.33GATTTATGTAGCCGACCCC52.63CCTGCTCCACTCACCTGTT57.89AAAGTGACAGGGTAAGAGTGA42.86GGCGAAGATGTTGTTGAA44.44CATGCTCACTTTTACTGCACCAC45.83TCACCCTCCACCCTCGTCT60.00TAGAATGGGAGCACTTTGG47.37GCGTCTTTGTGGTGGACT55.5611CY16AGCAACGATGGAGCAAGA50.00GCTGACCACGCTAACCTC61.11CY17TGAATCACATCTCAAGGGTT40.00AGAAGGTAGCCGAGTCATAG50.00CY24GTCCCGAGCCTCACATAA55.56AAAGCAGTTCCATAAAGATTG33.33CY26TTATGAATCACAACCCAATG33.33CTCTTCTGTTTCTATGTCCCT40.91CY32CCCTCGTTGTAGCCTCCT57.89GCTCCTCCCGATTTCTTC52.63CY33GTTCACAATGCTTGGACCTC47.62TTCGCTTGCTAACTACCACTAC45.45CY34ACCCACCATCCCAAAATC50.00AGGGCAATCACTGTATCACTCT45.45平均总计11111111.__81111114100100100100100100100100100100100100100表413个SSR引物扩增的条带、品种分布次数和频率统计表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表53个品种群内13个SSR引物扩增结果统计表品种群A品种群B品种群C—扩增总带数6010938共有带307多态性带数5710931多态性条带百分率(％)_95_100_81.58权利要求一种鉴定春兰品种的方法，通过以下步骤实现(1)提取已知112个春兰品种基因组DNA；(2)对所提取的春兰品种基因组DNA分别进行聚合酶链式反应，得到简单重复序列产物；(3)以6％变性聚丙烯酰胺凝胶为介质对简单重复序列产物进行电泳分离，总上样量为5μL，其中4μL为扩增产物，另加1μLLoadingBuffer，在60W下恒功率电泳至marker跑至胶板2/3处；(4)电泳结束后，经Bassam银染方法在数码相机下照相，分别得到简单重复序列标准图谱；(5)选择清晰简单重复序列图谱，采用“0-1”系统记录谱带，将有带的赋值为1，无带的赋值为0，读取春兰每个品种材料在不同引物扩增的产物的电泳谱带的数据，建立数据库；(6)基于Dice系数按非加权配对算术平均法进行聚类分析，得到系统聚类树；(7)将所需鉴定的春兰品种按上述步骤(1)-(5)，得到所需要鉴定春兰品种的序列图谱，将此序列图谱与标准图谱进行比较判定，得到分析鉴定结果。2.根据权利要求1所述的一种鉴定春兰品种的方法，其特征在于，其中聚合酶链式反应的反应体系如下20iiL反应体系，正向反向引物均为10pmol(0.4iiL)，TaqDNA聚合酶0.5U(0.2iiL)，dNTP0.2mM1.6uL,1XPCRbuffer2iiL，模板DNA(50ng)1iiL，超纯水14.4iiL，所述1XPCRbuffer包括pH8.3的lOmMTris_HCl、50mMKC1。3.根据权利要求1所述的一种鉴定春兰品种的方法，其特征在于，聚合酶链式反应所述的引物及退火温度为(1)CY2正向序列(5'反向序列(5'退火温度50.4°C(2)CY8正向序列(5'反向序列(5'退火温度50.4°C(3)CY11正向序列(5'反向序列(5'退火温度60.6°C(4)CY13正向序列(5'反向序列(5'退火温度49°C(5)CY14正向序列(5'反向序列(5'退火温度50.5°C(6)CY15正向序列(5'反向序列(5'退火温度50.5°C(7)CY16正向序列(5'3‘)CCCAAGACGCATAAAGAT3‘)TGCCCAGATGGTGGTAGG3‘)TATGTGTGAGAGGGTGC3‘)CAATTAGTCACATCCATAAAC-3')GATTTATGTAGCCGACCCC-3')CCTGCTCCACTCACCTGTT-3')AAAGTGACAGGGTAAGAGTGA-3')GGCGAAGATGTTGTTGAA-3')CATGCTCACTTTTACTGCACCAC-3')TCACCCTCCACCCTCGTCT-3')GTAGAATGGGAGCACTTTG-3')GCGTCTTTGTGGTGGACT-3')AGCAACGATGGAGCAAGA，3‘)GCTGACCACGCTAACCTC反向序列(5'退火温度56.3°C(8)CY17正向序列(5'—3'反向序列(5'—3'退火温度51.9°C(9)CY24正向序列(5'—3'反向序列(5'—3'退火温度53.4°C(10)CY26正向序列(5'—3'反向序列(5'—3'退火温度49°C(11)CY32正向序列(5'—3'反向序列(5'—3'退火温度53.4°C(12)CY33正向序列(5'—3'反向序列(5'—3'退火温度49°C(13)CY34正向序列(5—3'反向序列(5'—3退火温度51.9°C。4.根据权利要求1所述的一种鉴定春兰品种的方法，其特征在于，所述春兰基因组DNA的聚合酶链式反应中引物的浓度为0.5iimol/L。5.根据权利要求1所述的一种鉴定春兰品种的方法在鉴定春兰品种中应用。)TGAATCACATCTCAAGGGTT)AGAAGGTAGCCGAGTCATAG)GTCCCGAGCCTCACATAA)AAAGCAGTTCCATAAAGATTG)TTATGAATCACAACCCAATG)CTCTTCTGTTTCTATGTCCCT)CCCTCGTTGTAGCCTCCT)GCTCCTCCCGATTTCTTC)GTTCACAATGCTTGGACCTC)TTCGCTTGCTAACTACCACTAC)ACCCACCATCCCAAAATC)AGGGCAATCACTGTATCACTCT全文摘要本发明提供一种春兰品种分子鉴定方法，是基于简单重复序列基因组分析的春兰品种分子鉴定方法，通过优化春兰简单重复序列(SSR)分析的技术体系，明晰春兰品种的遗传关系。本发明直接检测品种的DNA序列差异，既具有遗传稳定性，又具有信息多样性，可以明确区分和判别春兰的不同品种，实现准确、快速鉴定品种，从而为品种鉴定、种苗市场管理、品种保护及良种繁育等提供可靠技术。本发明优化春兰基因组DNA的SSR技术体系，使春兰品种分子鉴定速度快、时间短、多态性多，能够在交易前解决兰苗真实性检验等问题，避免造成生产者或购买者的损失。本方法运用1个及以上有效引物可以区分和鉴定所有春兰品种，实现春兰品种的DNA指纹鉴定。文档编号C12Q1/68GK101818199SQ201010120719公开日2010年9月1日申请日期2010年3月9日优先权日2010年3月9日发明者夏宜平,李方,陈昆松,黄焱申请人:浙江大学