一种新型β-内酰胺类抗生素合成酶的生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用特定的工程菌——转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA生产新型内酰胺类抗生素的方法，本发明方法以SEQIDNO：1所示的青霉素酰化酶氨基酸序列为基础，首先引入突变位点，然后反向设计出核苷酸序列并进行了优化，进而通过进行全基因合成、构建重组载体、构建出重组菌株；所构建的重组菌株经发酵、细胞破碎、分离、纯化、脱色、固定化步骤处理后，最终得到能够直接用于工业生产的新型内酰胺类抗生素固定化酶成品。本发明方法所制备的固定化酶酶活高、稳定性好、重复利用效果优良，并且能够催化多种内酰胺类抗生素抗生素的合成如阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛等。
【专利说明】一种新型β-内酰胺类抗生素合成酶的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵与酶的纯化固定化技术，具体的说是涉及一种新型β -内酰胺类抗生素合成酶的生产方法。
【背景技术】
[0002]β_内酰胺类抗生素是一类非常重要和常用的抗生素，其疗效高而毒性小，是目前治疗感染性疾病的主要药物，在抗生素使用中所占比例很大，也是在抗菌药物中开发品种最多的一类抗生素，主要包括青霉素类、头孢菌素类、青霉稀类、单环内酰胺类和β_内酰胺酶抑制剂，其中又以青霉素类、头孢菌素类为典型代表。
[0003]传统半合成抗生素主要以化学法合成，青霉素类如阿莫西林，头孢菌素类如头孢氨苄等，其在化学合成过程经过混酐、缩合、水解和结晶等工序，由于需要基团保护、工艺路线长，所用部分试剂毒性较大，污染严重，其中部分有害物质易在药物中造成微量残留。近年来国内外都致力于酶法合成的研究，酶法合成头孢氨苄有着许多化学法无可比拟的优点，它具有反应条件温和、工艺操作简单、无需基团保护、清洁安全等优点。6-APA，7-ACA和7-ADCA的许多酸化衍生物均可用酶法合成(Park C B, Lee S B, Stabilization ofpenicillin V Acylase from streptomyces lavendula by covalent immobilization.J.Mol.Cataly.B: Enzyme, 2000,9: 275-2281)。
[0004]酶法合成内酰胺类抗生素研究的重点是合成用酶活性及稳定性的提高，以及能够，目前有关内酰胺类抗生素合成酶的研究主要倾向应用于半合成青霉素和头孢菌素类的工业生产中，用以催 化制备高效、广谱、适用于不同用途的新型β_内酰胺抗生素。该酶一方面可以催化青霉素或头孢霉素水解，得到半合成抗生素的重要中间体6-氨基青霉烷酸(6-ΑΡΑ)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA);另一方面可以催化酰化反应由6-ΑΡΑ合成新型青霉素或由7-ACA合成新型头孢菌素，其中应用较多的半合成抗生素有氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢唑林、头孢羟氨苄和头孢克洛。这些抗生素的合成应用最广的为青霉素酰化酶。
[0005]产青霉素酰化酶的微生物很多，可分为革兰氏阴性菌(G_)和革兰氏阳性菌(G+)两大类，前者有大肠杆菌，嗜柠檬酸克鲁沃尔氏菌，雷氏普罗威登斯菌，粪产碱杆菌与无色杆菌木糖氧化属等；后者有巨大芽孢杆菌与粘节杆菌等。G—菌产生的青霉素酰化酶通常定位于周质空间，G+菌产生的青霉素酰化酶则分泌于胞外。
[0006]内酰胺类抗生素合成酶生产的关键因素之一是高表达量菌株的获得。虽然以上已经提到的产青霉素酰化酶的微生物很多，但是这些原始菌株的表达量一般难以满足生产上的需求，并且很多需要在培养初期添加苯乙酸诱导表达，而苯乙酸对细菌的毒害比较明显。为提高菌株的表达量，人们将基因工程技术和大规模培养技术进行有机结合，使得原来无法获得的许多天然蛋白能够大量生产。目前，众多研究者多选用大肠杆菌作为宿主菌，其原因是大肠杆菌结构简单、遗传学背景清晰、生长周期短、生长条件清楚，已被广泛应用于重组蛋白，以及非蛋白的生物分子，如氨基酸等的生产。
[0007]如，杨志建等将粪产碱杆菌青霉素G酰化酶构建重组表达质粒pKKFPGA，pKKFPGA再转化宿主菌DH5 α，所得重组菌不需诱导便能高效表达青霉素G酰化酶，表达量达2590u/L，比野生型粪产碱杆菌表达量高432倍。(杨志建，蔡谨，孙健，袁中一，生物工程学报，2004
(5), 736-740)。由于酶活偏低，无法进行大规模生产应用。
[0008]任立华以产生青霉素G酰化酶的大肠工程菌株LRN075为研究对象，通过优化培养条件与不同比例的培养基成分，使得菌株在培养36h酶活最高达到22800u/L(任立华，青霉素G酰化酶工程菌培养条件的研究，齐鲁药事，2010(11)，651-654)。该酶主要应用在水解头孢菌素G到7-氨基脱乙酰头孢烷酸(7-ADCA)，酶活为水解活性，未涉及合成活性。
[0009]黄艳红等从巨大芽孢杆菌CA4098的基因组中，通过PCR方法扩增青霉素酰化酶基因，克隆到PKK223-3质粒中，在E.coli HBlOl中得到表达，每克菌体(湿重)酶活为61.8u(黄艳红，张颖，储瑞蔼，吴祥甫，王应睐，袁中一，巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达，生物化学与生物物理学报，1998 (2)，107-113)。
[0010]除此之外，β -内酰胺类抗生素合成酶生产的另一个关键因素是酶的分离纯化与固定化过程，这个过程的第一步是细胞破碎。正如大多数情况大肠杆菌的表达系统，外源蛋白质表达后被输送到周质空间再进行修饰后成为一个全功能的酶，青霉素酰化酶同样在表达后存在于大肠杆菌的周质空间，因此需要利用选择性破坏细胞的方法得到目的蛋白酶。
[0011]进行细胞破碎有多种方法可以选择，如超声波破碎法、渗透压冲击法、有机溶剂法、高压均质机法、溶菌酶法等。采用渗透压冲击法提取大肠杆菌青霉素酰化酶，得到了高比活的粗酶液(武金霞，张贺迎，青霉素酰化酶的分离和纯化，中国医药工业杂质，2002, 33
(4)，161-163);德莱昂等在报告了使用各种有机溶剂从大肠杆菌中提取青霉素G酰化酶(德莱昂、加西亚等，生物化学过程，39:301-305，2003)，并能够提升蛋白的产量和纯度；据报道酵素生物技术有限公司(印度)用SDS配合氯纺使用可以较好的对大肠杆菌(BL21CCM7394)进行破壁提取表达产物。经过5小时处理提取物收率可达到111%(专利CN 101802212 B)。目前工业上常用的主要有高压均质机法、溶菌酶法及超声波破碎法，高压均质机法相对简单，但对设备及操作条件要求较高，相`对耗能；采用超声破碎法全破碎细胞，细胞内容物全部释放，加之超声波产生大量热能易使酶失活，得到的粗酶液比活很低，这就需要加入更多的纯化步骤，使得收率很低。
[0012]进行细胞破碎后，需要对细胞破碎物进行固液分离、抽提、纯化、固定化等处理，其核心问题是高效固定化青霉素酰化酶的制备技术，而载体材料的选择与固定化的方法是固定化技术的关键所在。从载体材料的选择上看，与无机材料相比，有机载体易成型结合酶量高。高分子载体材料键合酶蛋白能力强；从固定化方法上看，包埋法工艺简便条件温和，酶活回收高，共价结合法酶分子与载体共价结合牢固，稳定性良好，适宜重复使用。
[0013]共价结合型载体有主要有氨基型和环氧型两种。环氧基具有很高的反应活性和可塑性，载体上的环氧基可直接与酶分子上的-NH2, -SH等非活性基团反应进行共价固定，也可以通过乙二胺、戊二醛等双官能团化合物作为交联剂进行连接。固定化可提高酶的重复使用率和催化稳定性，共价固定法通过偶联剂使酶蛋白与载体功能基团高密度连接，但酶活通常与连接数成反比，连接量过多会降低酶蛋白的弹性，影响活性和稳定性。
[0014]以上，虽然人们通过基因工程和大规模培养技术获得了高表达量的各种工程菌，但是所产酶却由于活性偏低或合成活性较弱等原因，不能满足工业生产的需求。另外，在固定化酶尤其是对于特定的固定化酶，人们一直在探索如何才能既保证一定的固定化的连接数，又保证酶活的收率保持在比较高的水平。
【发明内容】
[0015]本发明的目的是通过构建重组菌株——转化体BL21 (DE3) /PET28-ASPGA，并通过菌株的发酵、细胞破碎、分离纯化、脱色、固定化，从而得到能够用于工业生产的新型β_内酰胺类抗生素合成酶固定化酶成品。
[0016]本发明的目的是按如下的技术方案实现的:一种新型内酰胺类抗生素合成酶的生产方法，它包括如下步骤，
[0017]a)根据SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列反向设计出核苷酸序列，并进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示；将SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列进行全基因合成后构建重组载体，然后将所述重组载体转化到宿主菌中，得到重组菌株；
[0018]b)将所得重组菌株进行发酵，然后依次经细胞破碎、分离、纯化、脱色后，得到用于固定化的酶液；
[0019]c)在所得酶液中加入磷酸盐溶解使其终浓度为0.4M，并调整酶液的PH为6.0~
8.0，然后加入到活化好的环氧基型载体中，在25°C、150rpm条件下搅拌固定化24h，然后真空抽滤收集滤饼；
[0020]d)所得滤饼用去离子水冲洗干净，加入到浓度I~2M、PH5.8~9.0的赖氨酸溶液中反应24h,即得固定化酶。
[0021]本发明所述的新型β -内酰胺类抗生素合成酶的生产方法，
`[0022]b)步所述的细胞破碎具体是:发酵完毕后，在所得发酵液中按体积比加入0.1~0.5%的表面活性剂，然后加热至40~60°C、搅拌处理30min，得浊液；所述表面活性剂选自Triton χ-100 或 CTAB ；
[0023]b)步所述的分离具体是:所得浊液中按质量体积比加入I~5%的磷酸氢二钾，然后用氯化钙溶液调节PH至4.0~6.0，然后按质量体积比再加入2~8%的助滤剂，真空抽滤，得清液；
[0024]b)步所述的纯化及脱色具体是:向所得清液中加入磷酸氢二钾调节PH至6.0~
7.0以上，然后过滤收集滤液，向所得滤液中加入固体硫酸铵搅拌溶液，盐析产生沉淀，然后过滤收集滤饼；将所得滤饼用所述清液1/4~1/2体积的去离子水溶解，然后真空过滤，收集滤液，调节滤液的PH至7.0~9.0，然后加入活性炭脱色，再过滤分离出活性炭，收集得到酶液。
[0025]本发明所述的新型β -内酰胺类抗生素合成酶的生产方法，b)步所述发酵，在该发酵4~12h时添加IPTG进行诱导，所述IPTG的浓度为0.01mM~0.1mM。
[0026]本发明所述的新型β -内酰胺类抗生素合成酶的生产方法，b)步所述的细胞破碎是在所得发酵液中按体积比加入0.1~0.2%的Triton χ-100。
[0027]本发明所述的新型β -内酰胺类抗生素合成酶的生产方法，c)步所用氯化钙溶液为饱和溶液。
[0028]本发明所述的新型β -内酰胺类抗生素合成酶的生产方法，c)步所述磷酸盐为磷
酸二氢钾或磷酸氢二钾。
[0029]本发明所述步骤a)中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列是按如下的方案获得的:[0030]根据Genebank提供的无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶的氨基酸序列(SEQ IDNO:l,Genebank:AY919310.1)，在该序列中引入3个突变位点(将330位的苯丙氨酸替换为丙氨酸、将415位的赖氨酸替换为精氨酸、将770位的亮氨酸替换为苯丙氨酸)，得到如SEQID NO:2所示氨基酸序列。
[0031]本发明所述步骤a)中SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列具体是按如下的技术方案获得的: [0032]根据SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列，使用在线设计工具Jcat反向设计出核苷酸序列，然后根据宿主大肠杆菌内基因高效表达所需的优选密码子和G+C碱基含量，对设计出的核苷酸序列进行优化，优化后的核苷酸序列(如SEQ ID顯:3所示)与无色杆菌属0114824青霉素酰化酶的核苷酸序列(如SEQ ID N0:4所示)相比，SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列中稀有密码子的数量从55个降低到了 2个，G+C碱基含量从68.75%下降到了 57.25% ;同时SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列去除了原有序列中间的BamHI酶切位点。
[0033]本发明所述步骤a)中重组载体的构建具体是按如下的技术方案进行的:
[0034]I)将SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列进行全基因合成，获得ASPGA基因；
[0035]2)将PET28质粒和所述ASPGA基因分别使用BamH I和Hind III双酶切体系进行酶切，分别得到ASPGA基因片段和PET28质粒片段；
[0036]3)使用T4连接酶对ASPGA基因片段和PET28质粒片段进行连接，将连接后的产物转化到宿主菌中，然后涂布到LB培养抗性平板，然后挑取生长出的阳性克隆接种到LB液体培养基培养后，提取质粒即得到所构建的重组载体——表达载体PET28-ASPGA。
[0037]本发明步骤a)所述重组菌株具体是按如下的技术方案获得的:
[0038]在E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入所述重组载体混匀，然后经过冷却、热激、冷却、复苏等步骤，完成转化，吸取转化后的细胞涂布加有卡那霉素抗生素的平板，倒置培养，生长出的菌株即为重组菌株——转化体BL21(DE3) / PET28-ASPGA。
[0039]按本发明方法所构建的重组菌株以及利用该菌株进行发酵，并进一步按本发明的方法生产的内酰胺类抗生素合成酶固定化酶，具有较高的酶活及较好的稳定性，并能够多次重复利用，数据表明本发明的固定化酶在重复使用10批次之后，合成酶活保持稳定，底物转化率稳定，未见明显衰减，证明本发明固定化酶具有很好的工业应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1是Bradford法蛋白含量标准曲线。
【具体实施方式】
[0041]以下实施例1~3给出了本发明特定工程菌——转化体BL21 (DE3) /PET28-ASPGA的构建过程。
[0042]实施例1:基因设计及基因合成
[0043](I)基因设计:
[0044](1.1)根据Genebank中无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶氨基酸序列(SEQ IDNO:1，Genebank:AY919310.1 )，将其第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸，第415位赖氨酸替换为精氨酸，第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸，这些位点引入突变位点，得到如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，然后利用在线设计工具Jcat (http://www.jcat.de/)反向设计出引入突变位点后的核苷酸序列；
[0045](1.2)根据宿主大肠杆菌基因表达所需的优选密码子和基因高效表达所需的G +C碱基含量,优化上述反向设计出的核苷酸序列,优化后的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，该序列与无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶核苷酸序列(如SEQ ID NO: 4所示)相比:①大肠杆菌稀有密码子从55个降低到了 2个；②G + C碱基含量由68.75%下降到57.25%;③优化设计过程中去除了序列中间出现的BamH I酶切位点，有利后期基因操作。通过上述优化设计后，有利于宿主菌大肠杆菌闻效表达该基因。
[0046](2)基因合成:根据SEQ ID NO:3所示基因序列进行全基因合成(由生工生物工程(上海)有限公司完成)，获得ASPGA基因。
[0047]实施例2:表达载体PET28-ASPGA (即重组载体)的构建
[0048](I)对实施例1获得的ASPGA基因使用BamH I和Hind III双酶切，酶切体系如下:
[0049]
【权利要求】
1.一种新型β-内酰胺类抗生素合成酶的生产方法，其特征是它包括如下步骤， a)根据SEQID NO:2所示的氨基酸序列反向设计出核苷酸序列，并进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示；将SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列进行全基因合成后构建重组载体，然后将所述重组载体转化到宿主菌中，得到重组菌株； b)将所得重组菌株进行发酵，然后依次经细胞破碎、分离、纯化、脱色后，得到用于固定化的酶液； c)在所得酶液中加入磷酸盐溶解使其终浓度为0.4M，并调整酶液的PH为6.0-8.0，然后加入到活化好的环氧基型载体中，在25°C、150rpm条件下搅拌固定化24h，然后真空抽滤收集滤饼； d)所得滤饼用去离子水冲洗干净,加入到浓度2M、PH5.8^9.0的赖氨酸溶液中反应24h，即得固定化酶。
2.根据权利要求1所述的新型内酰胺类抗生素合成酶的生产方法，其特征是， b)步所述的细胞破碎具体是:发酵完毕后，在所得发酵液中按体积比加入0.1~0.5%的表面活性剂，然后加热至4(T6(TC、搅拌处理30min，得浊液；所述表面活性剂选自Tritonx-100 或 CTAB ； b)步所述的分离具体是:所得浊液中按质量体积比加入f 5%的磷酸氢二钾，然后用氯化钙溶液调节PH至4.0-6.0，然后按质量体积比再加入2~8%的助滤剂，真空抽滤，得清液； b)步所述的纯化及脱色具体是:向所得清液中加入磷酸氢二钾调节PH至6.0-7.0以上，然后过滤收集滤液，向所得滤液中加入固体硫酸铵搅拌溶液，盐析产生沉淀，然后过滤收集滤饼；将所得滤饼用所述清液1/1~1/2体积的去离子水溶解，然后真空过滤，收集滤液，调节滤液的PH至7.(T9.0，然后加入活性炭脱色，再过滤分离出活性炭，收集得到酶液。
3.根据权利要求1或2所述的新型β-内酰胺类抗生素合成酶的生产方法，其特征是，b)步所述发酵，在该发酵4~12h时添加IPTG进行诱导，所述IPTG的浓度为0.01mlT0.1mM。
4.根据权利要求2所述的新型β-内酰胺类抗生素合成酶的生产方法，其特征是，b)步所述的细胞破碎是在所得发酵液中按体积比加入0.1 "0.2%的Triton x_100。
5.根据权利要求2所述的新型β-内酰胺类抗生素合成酶的生产方法，其特征是，c)步所用氯化钙溶液为饱和溶液。
【文档编号】C12N9/84GK103695405SQ201310557791
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】刘力强, 石晨光, 范俊辉, 王召业, 王欢, 武芳, 贾娟娟, 牛昆, 吕娜, 杨丽萍, 邸胜苗, 刘 东 申请人:华北制药河北华民药业有限责任公司