专利名称：牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗及生产方法
技术领域：
本发明属于兽药技术或生物技术领域，具体涉及牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫 苗产品及制备方法。
背景技术：
牛病毒性腹泻病毒呈世界性分布，易感动物较多，如鹿、牛、猪、羊等，且它们间可 相互传染。该病毒引起的疾病全年均可发生。牛病毒性腹泻病毒可导致动物的病毒性腹泻、 粘膜病、流产、死胎、弱胎、畸形胎、持续性感染、免疫耐受、血小板减少和出血性综合症等多 种临床症状，还可导致非典型性猪瘟，给鹿业和奶牛业及养猪业造成极大的危害；尤其是在 人用的疫苗中发现了该病毒，这对人类是一个潜在的威胁。牛病毒性腹泻病是全球性传染 病，具有较高的感染率，流行的范围在不断扩大，阳性率在逐年增高。该病的发生和流行给 养殖业造成了重大的经济损失。由于灭活苗，核酸疫苗，亚单位疫苗免疫原性差、保护力低， 而活毒疫苗不安全等原因，至今尚无很好的疫苗可供使用，亦无治疗的特效药，因此急需研 制有效的疫苗和治疗的特效药。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗，用于动物牛病毒性 腹泻病防治，克服现有的灭活苗，核酸疫苗免疫原性差、保护力低，活毒疫苗使用不安全的 缺点。本发明是将牛病毒性腹泻病毒保护性抗原基因在可食性的抗病毒的药用植物黄 芪宿主中表达得到的疫苗产品。本发明的牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗是先以牛病毒性腹泻病毒RNA为模 板用反转录_聚合酶链式反应法获得Etl基因，再构建牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表 达载体，然后采用花粉管通道法，将牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表达载体溶液滴注 在处于半开放的黄芪花的柱头上，待黄芪种子成熟时收获种子，种植所收获的种子得到再 生苗，对再生苗分别进行聚合酶链式反应鉴定和反转录-聚合酶链式反应法鉴定及蛋白质 电泳法鉴定，得到牛病毒性腹泻病毒Etl基因转化黄芪，再通过蛋白质印迹法和酶联免疫吸 附法筛选具有免疫源性的牛病毒性腹泻病毒基因Etl转化的黄芪，所得到的疫苗产品。本发明药用植物疫苗的表达宿主还可以选用人参、鱼腥草、莪术、防风、刺五加。本发明疫苗的制备方法包括以下步骤1、牛病毒性腹泻病毒基因Etl基因的获得以提取RNA常规方法提取的牛病毒性腹泻病毒基因组RNA为模板，用反转录-聚 合酶链式反应法扩增Etl基因。扩增所用的引物序列如下上游5‘ -CCGGATCCACCATGGAAAA CATAACACAGTGG-3‘；下游5' -GCGAGCTCTTAAGCGTATGCTCCAAACCACGT-3‘。反转录-聚合 酶链式反应产物经琼脂糖凝胶电泳后，按维特洁DNA回收试剂盒说明书操作，回收目的基 因E0
2、牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表达载体构建分别用DNA限制性内切酶双酶切经凝胶纯化的目的基因Etl及植物表达载体DNA， 用T4 DNA连接酶16°C条件下连接16h，取5μ 1连接产物转化感受态大肠杆菌工程菌，挑取 转化菌单菌落抽提质粒，经聚合酶链式反应鉴定和DNA限制性内切酶双酶切鉴定及序列分 析筛选牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表达载体转化的重组工程菌，3、牛病毒性腹泻病毒基因Etl花粉管通道法转化黄芪大量培养重组工程菌，用碱裂解法大量制备牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表 达载体。选取花多、大而整齐的黄芪，用注射器将l-2ng/y 1牛病毒性腹泻病毒基因Etl重 组植物表达载体溶液滴注于半开放的、颜色鲜艳的花的柱头之上，去除已经开放、花色暗淡 的花朵以及还未开放的花朵，待种子成熟时收获种子，室温保存。对收获种子种植制备再生 苗，对再生苗分别进行聚合酶链式反应鉴定和反转录-聚合酶链式反应法鉴定及蛋白质电 泳法鉴定，筛选出牛病毒性腹泻病毒基因Etl转化的黄芪。4、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗的筛选对牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪，通过蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法筛选具有 免疫源性的牛病毒性腹泻病毒基因Etl转化的黄芪，得本发明疫苗产品，见表1。将牛病毒性 腹泻病毒转基因黄芪疫苗，移植大田进行扩繁，九月份收获转基因黄芪。表1酶联免疫吸附法筛选牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗
组别牛病毒性腹泻病毒转 基因黄芪牛病毒性腹泻病 毒对照黄芪对照OD值0. 42±0. 0210. 43±0. 0240. 22±0. 018※不同字母间表示差异显著(P <0.05)，相同字母间表示差异不显著(P> 0. 05)。本发明是基于1、黄芪，为豆科多年生草本植物膜荚黄芪和蒙古黄芪的干燥根。始载于《神农本草 经》，味甘性温，入脾、肺二经，有补气升阳、固表止汗、托毒排脓、利水消肿和生肌等功效。含 有多种皂苷类、多糖、黄酮、氨基酸、微量元素等化学物质，具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫、 抗衰老、抗氧化、抗辐射和抗应激药理作用。黄芪可提高体液免疫功能，慢性感染性疾病患 者注射黄芪20d后，血液中免疫球蛋白IgG、IgA及IgM的含量明显升高，还可使肝炎患者的 总补体CH50和分补体C3明显升高。黄芪可提高细胞免疫功能，黄芪多糖对T淋巴细胞体和 B淋巴细胞体外增殖均有有明显的促进作用，黄芪多糖还有增强巨噬细胞的吞噬作用，提高 自然杀伤细胞NK的活性。本发明充分运用了黄芪抗病毒和免疫增强佐剂的特性。2、牛病毒性腹泻病毒的结构蛋白Etl和E2均可诱导机体产生保护反应，但E2蛋白 保守性较低，抗原性变异较大，是导致病毒逃逸率高、疫苗保护率低和持续性感染的主要原 因，而Etl蛋白保守性较高，又具有抗原性，更适合研制基因工程苗。3、植物易于转化并能提供廉价的蛋白质源，并且具有使用安全、生产简单、可直接 口服等优点，因此植物疫苗在动物疾病防控方面将有极大的发展空间。花粉管通道法的优 点是不依赖组织培养而人工再生植株，操作简单，单胚珠和多胚珠的单双子叶植物均可应
4用，育种时间短，基因纯合速度快，可直接获得转基因植株，导入的DNA分子整合效率较高， 可直接运用到常规育种。本发明的有益效果是将牛病毒性腹泻病毒Etl基因在黄芪中表达，既产生保护性 抗原又产生增强免疫作用佐剂物质，提高了黄芪抗病毒的作用和疫苗的免疫效果。本发明 为疫苗和药用植物联合应用，为研制新型基因疫苗打下坚实的理论基础和提供新的研究思 路。与牛病毒性腹泻病毒活毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗相比，本发明的牛病毒性腹泻病 毒转基因黄芪疫苗还具有容易生产、使用方便、稳定性强、安全，没有负作用的优点。本发明 对更有效地控制牛病毒性腹泻病的传播和流行，繁荣畜牧业具有重要的理论意义和应用价 值。本发明的疫苗的用法和用量1、预防用法与用量使用对象为鹿、牛、猪，饲喂时添加牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗(鹿20克/ 日.只，牛30克/日.只，猪10克/日.只)，连喂3天，隔10天后再同法饲喂3天。2、治疗用法与用量使用对象为鹿、牛、猪，饲喂时添加牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗(鹿40克/ 日.只，牛60克/日.只，猪20克/日.只)，连喂3天。
图1牛病毒性腹泻病毒Etl基因反转录_聚合酶链式反应电泳图。图2牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表达载体聚合酶链式反应电泳图。图3牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表达载体的酶切鉴定电泳图。图4牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪聚合酶链式反应鉴定电泳5牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪的反转录_聚合酶链式反应鉴定电泳6牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪蛋白质电泳检测图7牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪蛋白质印迹法检测1、本发明动物实验例实验例1，牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗对鹿的免疫作用1、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗对鹿的免疫选24头1月龄健康仔鹿随机分成三组，每组8只，第1组为牛病毒性腹泻病毒转 基因黄芪疫苗免疫组，饲喂时添加牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗20克/日.只。第2 组为黄芪黄芪对照组，饲喂时添加黄芪20克/日.只。第3组为玉米秸粉对照组，饲喂时 添加20克/日.只。连喂3天，隔10天后加强免疫一次，分别再饲喂3天。于初次免疫前 当日和末次饲喂后第4周经颈静脉取血，分离血清和淋巴细胞。酶联免疫吸附法检测鹿的 特异性体液免疫应答，淋巴细胞转化实验检测细胞免疫水平。2、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗对鹿的体液特异性免疫应答将纯化牛病毒性腹泻病毒可溶性全病毒抗原，用pH8. 0包被液稀释，每孔加入 ΙΟΟμΙ，包被酶标板4°C过夜。弃去液体，用缓冲液3X3洗涤。用含10%马血清37°C封闭 2h。缓冲液洗涤同上。加入200倍稀释的待检鹿血清100μ 1，37°C感作lh。缓冲液洗涤同 上。加入5000倍稀释的兔抗鹿酶标二抗感作lh。缓冲液洗涤同上，加入底物37°C显色反应15min。每孔加50μ1 2Μ H2SO4，终止反应，测定OD49tl值。结果用光密度(OD)的比率来 表示，即一个实验样品的OD49tl和0天样品OD49tl间的比率。OD比值> 2时显示为阳性。OD 比值在1. 5-1. 9之间的样品被记为弱阳性。OD比值< 1. 5时为阴性。实验结果表明，初次 饲喂前当日，各组均为牛病毒性腹泻病毒抗体阴性。牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗组 在末次免疫4周后产生显著的IgG应答，而饲喂黄芪组和对照组没有检察到牛病毒性腹泻 病毒抗体效价。见表2。表2牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗诱导鹿体液特异性免疫(0D值)
权利要求
牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗，其特征是将牛病毒性腹泻病毒保护性抗原基因在可食性的抗病毒的药用植物黄芪宿主中表达得到的疫苗产品。
2.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗，其特征是先以牛病毒 性腹泻病毒RNA为模板用反转录_聚合酶链式反应法获得Etl基因，再构建牛病毒性腹泻病 毒基因Etl重组植物表达载体，然后采用花粉管通道法，将牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植 物表达载体溶液滴注在处于半开放的黄芪花的柱头上，待黄芪种子成熟时收获种子，种植 所收获的种子得到再生苗，对再生苗分别进行聚合酶链式反应鉴定和反转录_聚合酶链式 反应法鉴定及蛋白质电泳法鉴定，得到牛病毒性腹泻病毒Etl基因转化黄芪，再通过蛋白质 印迹法和酶联免疫吸附法筛选具有免疫源性的牛病毒性腹泻病毒基因Etl转化的黄芪，所得 到的的疫苗产品。
3.牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗的生产方法，其特征是包括以下步骤(1)牛病毒性腹泻病毒基因Etl基因的获得以提取RNA常规方法提取的牛病毒性腹泻病毒基因组RNA为模板，用反转录_聚合酶 链式反应法扩增Etl基因，扩增所用的引物序列如下上游5 ‘ -CCGGATCCACCATGGAAAACATA ACACAGTGG-3 ‘；下游5 ‘ -GCGAGCTCTTAAGCGTATGCTCCAAACCACGT-3 ‘，反转录-聚合酶链 式反应产物经琼脂糖凝胶电泳后，按维特洁DNA回收试剂盒说明书操作，回收得到Etl基因；(2)牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表达载体构建将步骤⑴得到的目的基因分别用DNA限制性内切酶双酶切经凝胶纯化的目的基因产 物及植物表达载体DNA，用T4 DNA连接酶在16°C条件下连接16h，取适量连接产物转化感 受态大肠杆菌工程菌，挑取转化菌单菌落抽提质粒，经聚合酶链式反应鉴定和DNA限制性 内切酶双酶切鉴定后，进行牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表达载体序列分析，筛选得 到含牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表达载体转化的工程菌，大量培养重组菌株，用碱 裂解法大量制备牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表达载体，用缓冲液将其稀释成浓度为 l-2ng/yl的牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表达载体；(3)牛病毒性腹泻病毒基因Etl花粉管通道法转化黄芪大量培养重组工程菌，用碱裂解法大量制备牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表达 载体，7月中旬期间，选取花多、大而整齐的两年生膜荚黄芪，用注射器将步骤(2)得到的 l-2ng/y 1的牛病毒性腹泻病毒基因Etl重组植物表达载体溶液滴注于半开放的、颜色鲜艳 的花的柱头之上，去除已经开放、花色暗淡的花朵以及还未开放的花朵，待种子成熟时收获 种子，室温保存，对收获种子种植得再生苗，对再生苗分别进行聚合酶链式反应鉴定和反转 录-聚合酶链式反应法鉴定及蛋白质电泳法鉴定，筛选出牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪；(4)牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗的筛选对牛病毒性腹泻病毒转基因药用植物，通过蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法筛选具有 免疫源性的牛病毒性腹泻病毒基因Etl转化的黄芪，得本发明疫苗产品。
全文摘要
牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗及生产方法，用于动物牛病毒性腹泻病防治，克服现有的灭活苗，核酸疫苗免疫原性差、保护力低，活毒疫苗使用不安全的缺点。本发明是以牛病毒性腹泻病毒RNA为模板，用反转录-聚合酶链式反应法获得其E0基因，再构建其基因E0重组植物表达载体，然后采用花粉管通道法，得到牛病毒性腹泻病毒E0基因转化黄芪。通过蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法筛选具有免疫源性的牛病毒性腹泻病毒基因E0转化的黄芪，得疫苗产品。本发明的有益效果是将牛病毒性腹泻病毒E0基因在黄芪中表达，既产生保护性抗原又产生增强免疫作用的佐剂物质，提高了黄芪抗病毒的作用和疫苗的免疫效果。还有易生产、使用方便、稳定性强、无负作用的优点。
文档编号C12N15/83GK101934073SQ201010120759
公开日2011年1月5日 申请日期2010年3月6日 优先权日2010年3月6日
发明者于文影, 刘佳佳, 张连学, 李然, 李璠瑛, 杜锐, 王亚兴, 王全凯, 王南, 臧埔, 郜玉钢 申请人:吉林农业大学