专利名称：一种利用细胞工厂制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗的方法
一种利用细胞工厂制备冻千甲型肝炎减毒活疫苗的方法 技术领域-
本发明涉及一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗制备方法，尤其是公开了一种利用细胞 工厂制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗的方法，属于生物制药技术领域。
背景技术：
传统的病毒性疫苗制备，关键是为病毒提供适宜其增殖的细胞基质，通常采用贴 壁培养的生长方式。贴壁培养系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。 转瓶培养一般用于小量培养到大规模培养的过度方式，或作为生物反应器接种细胞的 准备途径。其特点是结构简单、投资少、技术成熟、重复性好、容易扩大等等，同时 也存在着细胞生长密度低、单瓶细胞有生长差异、劳动强度大，占地空间大的等缺点。 是目前国内疫苗生产厂家普遍采用的细胞培养方式。反应器贴壁培养通常采用片状载 体和篮式搅拌系统，可以提供较高的细胞密度， 一般适于多次收获培养产物，国内一 些科研人员曾尝试釆用反应器培养细胞来制备甲肝疫苗，效果均不理想。其原因在于 肝炎病毒在细胞内增殖周期较长，且只能收获一次。
本发明涉及的"细胞工厂"是丹麦NUNC公司出品的CELL FACTORIES和美国 CORNING公司出品的Cell STACK,英文直译分别为细胞工厂或细胞培养室，其培养 原理基本相同，外观尺寸略有差异。使用过程中的关键问题是l.解决了 2BS细胞在 细胞工厂中的生长适应性；2.确定了使用细胞工厂培养L-A-1减毒株的增值高峰期；3. 确定了科学的洗换方法，提高了细胞收获率和细胞工厂连续使用率。
发明内容
本发明公开一种利用细胞工厂制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗的方法，适用于工业 化生产。
本发明的技术解决方案如下
在无菌条件下，采用单层感染法或同时感染法在细胞工厂中将甲型肝炎减毒株
(L-A-l)感染2BS细胞后，分别进行35天或28天左右的连续培养，期间需进行2-3 次更换维持液，最终得到甲型肝炎病毒收获液；再经离心收集细胞沉淀、氯仿抽提、 稀释合并后，成为甲型肝炎疫苗原液；原液检定合格后配制成为甲型肝炎疫苗半成品，经分装、冻干、检定合格后，成为冻干甲型肝炎减毒活疫苗。
本发明的细胞工厂制备的冻干甲型肝炎减毒活疫苗，每支成品(复溶后体积lml) 含以下组分及含量-
甲型肝炎减毒活疫苗 0.755毫升
明胶-蔗糖保护剂 0.245毫升
复溶后甲型肝炎病毒滴度不低于6.50 lg CCIDWml。
本发明所述疫苗的具体制备工艺步骤
(1) 2BS细胞制备
取出冻存的工作细胞库中的细胞管，复苏后混合培养，成单层后，用0.25%胰蛋白 酶消化，于37°C ±0. 5'C静止或旋转培养；
(2) 感染2BS细胞。
在制备好的细胞中加入毒种稀释液(0.01 0.05MOD，感染细胞，有两种感染方 法单层感染法和悬浮感染法。
(3) 更换维持液
弃去细胞工厂内液体，加维持液200 250ml/层，置35t:士0.5'C继续培养，7 10 天换液一次，待病毒增殖高峰时收获；
(4) 洗换、收获
逐层认真检査细胞工厂，确认无污染，根据荧光情况，确定疫苗液加量，用Hank's 液清洗细胞表面，200 300ml/层，充分振摇后排空洗液；加入EDTA-胰蛋白酶混合消 化液，50ml/层，待细胞面呈疏松状，加入199综合培养液，150 200ml/层，振摇至细 胞脱落，无菌收集，分至离心杯中；使用灭菌注射用水(含100单位/ml卡那霉素)冲 洗细胞工厂，备下次使用。
(5) 离心、抽提
于2 8'C、 3000rpm离心30分钟；离心后弃上清液，收集离心沉淀进行无菌检查， 无菌检査合格后的沉淀液合并，进行细胞破碎处理；细胞破碎条件匀浆，28000rpm/ 分钟，l分钟；
细胞匀浆液加入1/3体积的三氯甲烷混合后提纯病毒，3000rpm离心30分钟，连 续抽提病毒液三次；
(6) 原液合并、保存、检定
同一细胞批生产病毒收获液，经提纯后在无菌条件下合并为一批原液，取样做原液检定。原液放置于-6(TC以下保存3个月； (7)半成品配制及分装
将检定合格的甲肝疫苗原液与明胶-蔗糖保护剂按比例(3.08: 1)混合均匀后，按 要求进行分装，分装量1.0mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥。
(8) 冻干
将步骤(7)中的分装品冷冻干燥，步骤为-35°。预冻2小时，制品-4(TC冷冻3 4 小时，逐渐升温真空干燥10~12小时，30 35i:恒温真空干燥5 6小时，全过程累计 20 24小时，制备出冻干甲肝减毒活疫苗成品。
(9) 成品检定
根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。 本发明通过细胞工厂制备出冻干甲肝减毒活疫苗，在有限的空间内利用了最大限 度的培养表面，从而节省了大量的厂房空间,并可节省贵重的培养液。更重要的是，它 可有效地保证操作的无菌性，从而避免因污染而带来的原料、劳务和时间损失；特别 适合于贴壁细胞，也可用于悬浮培养，在从实验室规模进行放大时不会改变细胞生长 的动力学条件，规格放大变得简单易行，培养表面经测试保证最有利于细胞贴附和生 长。
本发明优点在于工艺可控性好，不易污染，适于工业化、规模化生产；培养空间利用率提高3倍以上，使细胞生长密度达到4.0 5.0Xl()S个/m1,保证了病毒的增殖 空间，同时还通过无菌冲洗、离心处理等方法有效解决了细胞工厂消化后的细胞残留 问题，从而可以连续使用细胞工厂进行细胞培养，提高了细胞工厂的重复使用率。
具体实施例方式
下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背 离本发明的精神和原则的前提下，对本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变 都将落入本发明的待批权利要求范围之内。
实施例1 :
选用丹麦NUNC公司出品的CELL FACTORIES 10层，36块，采用单层感染法制 备冻干甲肝减毒活疫苗的制备工艺。 1.2BS细胞制备
将选好的细胞中用Hank's液清洗细胞表面，再用0.25%胰酶消化细胞，将消化后 的细胞与含10。/。小牛血清的MEM培养液混合，制成细胞悬液，按适宜比例分种(1:5)，无菌加入细胞工厂中，200ml/层，放置37。C士0. 5。C培养7天。
2. 单层感染
认真检査细胞，确认细胞单层且无污染，弃旧液，用Hank's液轻轻洗细胞面后控 净，加入毒种稀释液(0.03MOI)，置于35。C土0.5。C培养3.5小时，补加维持液(含2% 小牛血清的MEM培养液)至200ml/层，置35。C士0.5。C培养7天后换液。
3. 更换维持液
弃去细胞工厂内液体，加维持液200ml/层，置35t:士0.5t:继续培养，间隔7天换液 一次，共换液两次，待病毒增殖高峰时收获。
4. 洗换、收获
逐层认真检査细胞工厂，确认无污染，根据荧光情况，确定疫苗液加量，用Hank's 液清洗细胞表面，250ml/层，充分振摇后排空洗液；加入EDTA-胰蛋白酶混合消化液， 50ml/层，待细胞面呈疏松状，加入199综合培养液，150ml/层，振摇至细胞脱落，无 菌收集，分至离心杯中；使用灭菌注射用水(含100单位/ml卡那霉素)冲洗细胞工厂， 备下次使用。
5. 离心、抽提
于2 『C、 3000rpm离心30分钟；离心后弃上清液，收集离心沉淀进行无菌检査， 无菌检査合格后的沉淀液合并，进行细胞破碎处理；细胞破碎条件匀浆，28000rpm/ 分钟，l分钟；
细胞匀浆液加入l/3体积的三氯甲垸混合后提纯病毒，3000rpm离心30分钟，连 续抽提病毒液三次；
6. 原液合并、保存
经提纯后在无菌条件下合并为一批原液，计7.2L，于-6(TC以下保存
7. 半成品配制及分装、冻干
将检定合格的甲肝疫苗原液与明胶-蔗糖保护剂按比例(3.08: 1)混合均匀后，按 要求进行分装，分装量1.0mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥。
8.成品检定根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。
实施例2:
选用美国CORNING公司出品的Cell STACK, 10层，36块，采用单层感染法制备 冻干甲肝减毒活疫苗的制备工艺。 1.2BS细胞制备将选好的细胞中用Hank's液清洗细胞表面，再用0.25%胰酶消化细胞，将消化后 的细胞与含10%小牛血清的MEM培养液混合，制成细胞悬液，按适宜比例分种(1: 5)，无菌加入细胞工厂中，200ml/层，放置37。C士0. 5。C培养7天。
2. 单层感染
确认细胞单层且无污染，弃旧液，用Hank's液轻轻洗细胞面后控净，加入毒种稀 释液(0.04MOI)，置于35'C士0.5。C培养3.5小时，补加维持液(含2。/。小牛血清的MEM 培养液)至200ml/层，置35'Ci0.5。C培养7天后换液。
3. 更换维持液
弃去细胞工厂内液体，加维持液200ml/层，置35"Ci0.5'C继续培养，间隔7天换液 一次，共换液两次，待病毒增殖高峰时收获。
4. 洗换、收获
逐层认真检査细胞工厂，确认无污染，根据荧光情况，确定疫苗液加量，用Hank's 液清洗细胞表面，250ml/层，充分振摇后排空洗液；加入EDTA-胰蛋白酶混合消化液， 50ml/层，待细胞面呈疏松状，加入199综合培养液，150ml/层，振摇至细胞脱落，无 菌收集，分至离心杯中；使用灭菌注射用水(含100单位/ml卡那霉素)冲洗细胞工厂， 备下次使用。
5. 离心、抽提
于2 8'C、 3000rpm离心30分钟；离心后弃上清液，收集离心沉淀进行无菌检查， 无菌检查合格后的沉淀液合并，进行细胞破碎处理；细胞破碎条件匀浆，28000rpm/ 分钟，l分钟；
细胞匀浆液加入l/3体积的三氯甲垸混合后提纯病毒，3000rpm离心30分钟，连 续抽提病毒液三次。
6. 原液合并、保存
经提纯后在无菌条件下合并为一批原液，计7.0L，于-6(TC以下保存
7. 半成品配制及分装、冻干
将检定合格的甲肝疫苗原液与明胶-蔗糖保护剂按比例(3.08: 1)混合均匀后，按 要求进行分装，分装量1.0mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥。
8.成品检定根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。
实施例3:
选用NUNC公司出品的CELLFACTORIES, 10层12块，美国CORNING公司出品的Cell STACK, 40层6块，采用悬浮感染法制备冻干甲肝减毒活疫苗的制备工艺。
1. 悬浮感染
挑选好细胞种，弃去细胞工厂中的培养液，用Hank，s液轻轻洗细胞面后控净，加 消化液消化，待细胞面呈疏松状，加入细胞、毒种混合悬液(0.0 5MOI)，按适宜比 例分种(1: 5)，置35。C土0.5'C吸附2.5小时补加生长液(含15。/。小牛血清的MEM培养 液)至220ml/层，置35。Ci0.5。C培养，7天后换液。
2. 更换维持液
弃去细胞工厂内液体，加维持液220ml/层，置35'Ci0.5'C继续培养，间隔7天换液 一次，共换液两次。待病毒增殖高峰时收获。
3. 洗换、收获
逐层认真检査细胞工厂，确认无污染，根据荧光情况，确定疫苗液加量，用Hank's 液清洗细胞表面，250ml/层，充分振摇后排空洗液；加入EDTA-胰蛋白酶混合消化液， 50ml/层，待细胞面呈疏松状，加入199综合培养液，150ml/层，振摇至细胞脱落，无 菌收集，分至离心杯中；使用灭菌注射用水(含100单位/ml卡那霉素)冲洗细胞工厂， 备下次使用。
4. 离心、抽提
于2 8°C、 3000rpm离心30分钟；离心后弃上清液，收集离心沉淀进行无菌检查， 无菌检查合格后的沉淀液合并，进行细胞破碎处理；细胞破碎条件匀桨，28000rpm/ 分钟，l分钟；
细胞匀浆液加入l/3体积的三氯甲烷混合后提纯病毒，3000rpm离心30分钟，连 续抽提病毒液三次；
5. 原液合并、保存
经提纯后在无菌条件下合并为一批原液，计6.5L，于-60'C以下保存
6. 半成品配制及分装、冻干
将检定合格的甲肝疫苗原液与明胶-蔗糖保护剂按比例(3.08: 1)混合均匀后，按 要求进行分装，分装量1.0mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥。
7.成品检定根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。
权利要求
1.一种采用细胞工厂制备的冻干甲型肝炎减毒活疫苗，其特征在于由以下组分组成每支成品(复溶后体积1ml)含以下组分及含量甲型肝炎减毒活疫苗 0.755毫升明胶-蔗糖保护剂0.245毫升复溶后甲型肝炎病毒滴度不低于6.50lg CCID50/ml。
2. 权利要求1所述的疫苗为冻干剂型。
3. 权利要求1所述的疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤(1) 2BS细胞制备取出冻存的工作细胞库中的细胞管，复苏后混合培养，成单层后，用 0. 25%胰蛋白酶消化，于37°C±0. 5。C静止或旋转培养；(2) 用细胞工厂制备甲肝疫苗收获液；(3) 更换维持液弃去细胞工厂内液体，加维持液200 250ml/层，置35'C士0.5t:继续培养，7 10天换液一次，待病毒增殖高峰时收获；(4) 洗换、收获逐层认真检査细胞工厂，确认无污染，根据荧光情况，确定疫苗液加 量，用Hank's液清洗细胞表面，200 300ml/层，充分振摇后排空洗液； 加入EDTA-胰蛋白酶混合消化液，50ml/层，待细胞面呈疏松状，加入199 综合培养液，150 200ml/层，振摇至细胞脱落，无菌收集，分至离心杯中；(5) 离心、抽提于2 8"C、 3000rpm离心30分钟；离心后弃上清液，收集离心沉淀 进行无菌检查，无菌检査合格后的沉淀液合并，进行细胞破碎处理；细胞 破碎条件匀浆，28000rpm/分钟，1分钟；细胞匀浆液加入1/3体积的三氯甲烷混合后提纯病毒，3000rpm离心 30分钟，连续抽提病毒液三次；(6) 原液合并、保存同一细胞批生产病毒收获液，经提纯后在无菌条件下合并为一批原 液，于-6(TC以下保存3个月；(7) 半成品配制及分装将检定合格的甲肝疫苗原液与明胶-蔗糖保护剂按比例(3.08: 1)混合 均匀后，按要求进行分装，分装量1.0mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干 燥。(8) 冻干将步骤(7)中的分装品冷冻干燥，步骤为-35°。预冻2小时，制品 -4(TC冷冻3 4小时，逐渐升温真空干燥10~12小时，30 35。C恒温真空干 燥5 6小时，全过程累计20~24小时，制备出冻干甲肝减毒活疫苗成品。
4、权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)用单层感染 法制备甲肝疫苗收获液挑选好细胞种，弃去细胞工厂中的旧液，用Hank，s液轻轻洗细胞面后 控净，加消化液消化，待细胞表面显疏松状，加入细胞悬液，按l: 5比例 分种，置37"C士0.5'C培养6 7天感染；确认细胞单层且无污染，弃旧液，用Hank's液轻轻洗细胞面后控净，按0.01 0.05MOI加入毒种稀释液，置于 35T:土0.5。C培养3.5 4小时，补加维持液(含2 5。/。小牛血清的MEM培养液) 至200ml/层，置35。C士0.5。C培养7 10天后换液。
5、权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤2用同时感染法制备甲肝疫苗收获液挑选好细胞种，弃去细胞工厂中的培养液，用Hank's液轻轻洗细胞面 后控净，加消化液消化，待细胞面呈疏松状，加入细胞、毒种混合悬液 (0.01 0.05MOI)，按l: 5比例分种，置35。C士0.5。C吸附2.5小时补加生 长液(含10 15。/。小牛血清的MEM培养液)至200ml/层，置35。C士0.5。C培养， 7 10天后换液。
全文摘要
本发明公开一种利用细胞工厂制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗的方法，工艺可控性好，不易污染，适于工业化、规模化生产；培养空间利用率提高3倍以上，使细胞生长密度达到4.0～5.0×10<sup>6</sup>个/ml，保证了病毒的增殖空间，同时还通过无菌冲洗、离心处理等方法有效解决了细胞工厂消化后的细胞残留问题，从而可以连续使用细胞工厂进行细胞培养，提高了细胞工厂的重复使用率。
文档编号A61K39/29GK101406699SQ20081005144
公开日2009年4月15日 申请日期2008年11月19日 优先权日2008年11月19日
发明者刘景晔, 占永生, 妍 周, 屈翠波, 王云霞, 谢宝生 申请人:长春长生生物科技股份有限公司