包含抗-cd3构建体的双特异性不对称异二聚体的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年7月13日提交的美国申请序列号61/671,640和2013年7月 13日提交的美国申请序列号61/845, 948的权益，所述申请在此以引用的方式整体并入。
技术领域
[0003] 本发明的领域是合理设计包含CD3结合结构域的多特异性支架以用于生物治疗 剂的定制研发。
【背景技术】
[0004] 在治疗性蛋白的领域中，具有其多价靶结合特征的抗体是用于设计药物候选物的 优异支架。进ー步推进这些特征，设计的双特异性抗体和其它特融合的多特异性治疗剂表 现出双重或多重靶特异性和产生具有新颖的作用模式的药物的机会。这类具有有利的药物 代谢动力学和功能活性的多价和多特异性治疗性蛋白的研发一直是挑战。
[0005] 人和动物两者的免疫系统包括两种主要类别的淋巴细胞：衍生自胸腺的细胞（T 细胞）和衍生自细胞的骨髓（B细胞）。T细胞表现出免疫特异性并且直接參与细胞介导的 免疫应答（如移植物排斥）。T细胞针对或响应于多种外来结构（抗原）作用。在许多情 况下，这些外来抗原由于感染而在宿主细胞上表达。然而，外来抗原还可以来自己被瘤形成 或感染改变的宿主。
[0006]T细胞活化是依赖于在应答T细胞群体上表达的多种细胞表面分子的參与的复杂 的现象。例如，抗原特异性T细胞受体（TcR)由二硫键连接的异二聚体组成，所述异二聚体 含有与低分子量不变蛋白质的复合物（通常被指定为CD3)非共价缔合的两个同源分布的 整合膜糖蛋白链a和0 (a和0 )或Y和S(Y和S)。
[0007] 发明概述
[0008] 本文提供包含CD3结合结构域的多特异性异多聚体。在一个实施方案中提供ー种 包含抗-CD3构建体的双特异性不对称异二聚体。
[0009] 本文提供包含以下各项的分离的多特异性异多聚体构建体：第一多肽构建体，其 包含第一重链多肽和结合至少ー种表达CD3的细胞上的CD3复合物的CD3结合多肽构建 体；第二多肽构建体，其包含与所述第一重链多肽不同的第二重链多肽和结合至少ー种B 细胞上的靶抗原的抗原结合多肽构建体；其中：所述CD3结合多肽构建体和所述抗原结合 多肽构建体中的至少ー个包含单链Fv区；其中所述多特异性异多聚体构建体同时接合所 述至少ー种B细胞和所述至少一种表达CD3的细胞，以使得所述表达CD3的细胞被活化，从 而诱导所述B细胞的杀伤；并且所述第一和第二重链多肽形成包含变体免疫球蛋白CH3区 的异二聚体Fc区，所述变体免疫球蛋白CH3区包含促进所述异二聚体Fc的形成的至少ー 个氨基酸突变，所述异二聚体Fc具有至少比得上天然同二聚体Fc的稳定性并且具有純度， 所述纯度使得当所述多特异性异多聚体构建体由稳定哺乳动物细胞共表达于表达产物中 时，所述表达产物包含至少约70 %的所述多特异性异多聚体和小于10 %的所述第一或第 二多肽构建体的单体或同二聚体。在某些实施方案中，所述稳定哺乳动物细胞用呈1:1的 预定比例的编码所述第一多肽构建体的至少ー个第一DNA序列和编码所述第二多肽构建 体的至少ー个第二DNA序列转染。在某些实施方案中，所述第一或第二多肽构建体缺乏免 疫球蛋白轻链和免疫球蛋白第一恒定（CHl)区中的至少ー个。
[0010] 在某些实施方案中是本文所描述的分离的异多聚体构建体，其中所述异二聚体Fc 区包含变体CH2结构域或铰链，所述变体CH2结构域或铰链包含阻止与所有FeY受体的功 能有效结合的氨基酸修饰。在一些实施方案中提供本文所描述的分离的多特异性异多聚 体，其中所述变体CH2结构域或铰链包含还阻止与补体蛋白（Clq复合物）的功能有效结合 的氨基酸修饰。在一个实施方案中是本文所描述的分离的多特异性异多聚体，其中所述异 二聚体Fc区包含变体CH2结构域或铰链，所述变体CH2结构域或铰链包含增强与FeYRIIb 受体的结合的氨基酸修饰。
[0011] 在一个实施方案中提供ー种包含以下各项的分离的多特异性异多聚体构建体：第 一多肽构建体，其包含第一重链多肽和结合至少ー种表达CD3的细胞上的CD3复合物的CD3 结合多肽构建体；第二多肽构建体，其包含与所述第一重链多肽不同的第二重链多肽和结 合至少ー种B细胞上的靶抗原的抗原结合多肽构建体；其中：所述CD3结合多肽构建体和 所述抗原结合多肽构建体中的至少ー个任选地包含单链Fv区；所述第一和第二重链多肽 形成包含变体免疫球蛋白CH3区的异二聚体Fc区，所述变体免疫球蛋白CH3区包含促进所 述异二聚体Fc的形成的至少ー个氨基酸突变，其中：所述异二聚体Fc被形成为具有至少比 得上天然同二聚体Fc的稳定性，并且所述异二聚体Fc被形成为具有纯度，所述纯度使得当 所述多特异性异多聚体构建体由哺乳动物细胞共表达于表达产物中时，所述表达产物包含 大于70%的所述多特异性异多聚体和小于10%的所述第一或第二多肽构建体的单体或同 二聚体；并且所述多特异性异多聚体构建体以大于一的效价结合所述至少ー种B细胞，并 且所述多特异性异多聚体同时接合所述至少ー种B细胞和所述至少ー种表达⑶3的细胞， 以使得所述表达CD3的细胞被活化，从而诱导所述B细胞的杀伤。在某些实施方案中，所述 多特异性异多聚体构建体以二效价结合所述至少ー种B细胞。
[0012] 本文提供ー种包含以下各项的分离的多特异性异多聚体构建体：第一多肽构建 体，其包含第一重链多肽和结合至少ー种表达CD3的细胞上的CD3复合物的CD3结合多肽 构建体；第二多肽构建体，其包含与所述第一重链多肽不同的第二重链多肽和表现出可忽 略不计的受体结合的空间调节剂构建体；其中：所述多特异性异多聚体构建体同时接合至 少ー种B细胞和所述至少一种表达CD3的细胞，以使得所述表达CD3的细胞被活化，从而诱 导所述B细胞的杀伤；并且所述第一和第二重链多肽形成包含变体免疫球蛋白CH3区的异 二聚体Fc区，所述变体免疫球蛋白CH3区包含促进所述异二聚体Fc的形成的至少ー个氨 基酸突变，其中：所述异二聚体Fc被形成为具有至少比得上天然同二聚体Fc的稳定性，并 且所述异二聚体Fc被形成为具有纯度，所述纯度使得当所述多特异性异多聚体构建体由 稳定哺乳动物细胞共表达于表达产物中时，所述表达产物包含至少约75%的所述多特异性 异多聚体和小于10%的所述第一或第二多肽构建体的单体或同二聚体。
[0013] 提供ー种包含以下各项的分离的多特异性异多聚体构建体：第一多肽构建体，其 包含第一重链多肽和结合至少ー种表达CD3的细胞上的CD3复合物的CD3结合多肽构建 体；第二多肽构建体，其包含与所述第一重链多肽不同的第二重链多肽，并且其中所述第二 多肽构建体不包含抗原结合多肽构建体；其中：所述多特异性异多聚体构建体同时接合至 少ー种B细胞和所述至少一种表达CD3的细胞，以使得所述表达CD3的细胞被活化，从而诱 导所述B细胞的杀伤；并且所述第一和第二重链多肽形成包含变体免疫球蛋白CH3区的异 二聚体Fc区，所述变体免疫球蛋白CH3区包含促进所述异二聚体Fc的形成的至少ー个氨 基酸突变，其中：所述异二聚体Fc被形成为具有至少比得上天然同二聚体Fc的稳定性，并 且所述异二聚体Fc被形成为具有纯度，所述纯度使得当所述多特异性异多聚体构建体由 稳定哺乳动物细胞共表达于表达产物中时，所述表达产物包含至少约75%的所述多特异性 异多聚体和小于10%的所述第一或第二多肽构建体的单体或同二聚体。
[0014] 在某些实施方案中是本文所描述的分离的多特异性异多聚体，其中所述异二聚体 Fc区包含变体CH2结构域，所述变体CH2结构域包含氨基酸修饰以促进FeY受体的选择 性结合。在一些实施方案中,变体CH2结构域选择性地结合FeYIIb受体大于结合野生型 CH2结构域。在某些实施方案中，变体CH2结构域选择性地结合FeYIIIa和FeYIIa受体 中的至少ー个大于结合野生型CH2结构域。
[0015] 在某些实施方案中是ー种本文所描述的分离的多特异性异多聚体构建体，其中所 述变体CH3结构域具有约73°C或更大的熔解温度（Tm)。在一些实施方案中，所述异二聚体 Fc区被形成为具有大于约90%的纯度。在某些实施方案中，所述异二聚体Fc区被形成为具 有约95%或更大的纯度并且Tm是至少约75で。在一些其他实施方案中，所述异二聚体Fc 区被形成为具有至少约90%的纯度并且Tm是约75°C。在一个实施方案中，所述第一重链 多肽的变体CH3序列包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，并且所述第二转运蛋白多肽的 变体CH3序列包含氨基酸修饰T366L、K392M和T394W。在另ー个实施方案中，所述第一重链 多肽的变体CH3序列包含氨基酸修饰L351Y、F405A和Y407V，并且所述第二重链多肽的变体 CH3序列包含氨基酸修饰T366L、K392L和T394W。在另ー个实施方案中，所述第一重链多肽 的变体CH3序列包含氨基酸修饰T350V、L351Y、F405A和Y407V，并且所述第二重链多肽的变 体CH3序列包含氨基酸修饰T350V、T366L、K392M和T394W。在一些实施方案中，所述第一 重链多肽的变体CH3序列包含氨基酸修饰T350V、L351Y、F405A和Y407V，并且所述第二重链 多肽的变体CH3序列包含氨基酸修饰T350V、T366L、K392L和T394W。在另ー个实施方案中， 所述第一重链多肽的变体CH3序列包含氨基酸修饰T366L、N390R、K392R和T394W，并且所述 第二重链多肽的变体CH3序列包含氨基酸修饰L351Y、S400E、F405A和Y407V。在一些实施 方案中，所述第一重链多肽的变体CH3序列包含氨基酸修饰T350V、T366L、N390R、K392R和 T394W，并且所述第二重链多肽的变体CH3序列包含氨基酸修饰T350V、L351Y、S400E、F405A 和Y407V。
[0016] 在某些实施方案中提供ー种本文所描述的分离的多特异性异多聚体，其中所述异 二聚体Fc是糖基化的。在一些实施方案中提供ー种本文所描述的分离的多特异性异多聚 体，其中所述异二聚体Fc是无岩藻糖基化的。在另ー个实施方案中提供ー种本文所描述的 分离的多特异性异多聚体，其中所述异二聚体Fc是无糖基化的。
[0017] 在一些实施方案中是本文所描述的分离的多特异性异多聚体，其中结合至少ー种 B细胞上的靶抗原的抗原结合多肽构建体包含衍生自抗体、纤连蛋白、亲和体（affibody)、 抗运载蛋白（anticalin)、半胱氨酸结蛋白、DARPin、avimer、Kunitz结构域或其变体或衍 生物的至少ー个靶抗原结合结构域。在一个实施方案是本文所描述的分离的多特异性异多 聚体，其中所述抗体是缺乏轻链的重链抗体。在其它实施方案中是本文所描述的分离的多 特异性异多聚体，其中所述抗原结合多肽构建体包含至少ー个CD19结合结构域。在某些实 施方案中是本文所描述的分离的多特异性异多聚体，其中所述抗原结合多肽构建体包含至 少ー个⑶20结合结构域。
[0018] 本文提供一种分离的多特异性异多聚体构建体，其包含：第一多肽构建体，其包含 与至少ー种CD3结合多肽构建体融合的第一转运蛋白多肽，所述至少ー种CD3结合多肽构 建体结合至少ー种表达⑶3的细胞上的⑶3复合物；第二多肽构建体，其包含与至少ー种抗 原结合多肽构建体融合的、与所述第一转运蛋白多肽不同的第二转运蛋白多肽，所述至少 ー种抗原结合多肽构建体结合至少ー种B细胞上的靶抗原；其中所述第一和第二转运蛋白 多肽通过ー种蛋白质的节段化而衍生自所述蛋白质，每个转运蛋白多肽包含与所述蛋白质 的区段具有至少90%同一性的氨基酸序列，并且其中所述转运蛋白多肽自组装以形成所述 単体蛋白的准天然结构。
[0019] 在某些实施方案中，所述转运蛋白多肽不是衍生自抗体。在某些实施方案中，每个 转运蛋白多肽是白蛋白衍生物。在一些实施方案中，所述白蛋白是人血清白蛋白。在ー些 实施方案中，至少ー个转运蛋白多肽是异白蛋白衍生物。在某些实施方案中，每个转运蛋白 多肽衍生自不同的异白蛋白。
[0020] 本文提供分离的多特异性异多聚体构建体，其包含：第一多肽构建体，其包含与至 少ー种CD3结合多肽构建体融合的第一转运蛋白多肽，所述至少ー种CD3结合多肽构建体 结合至少ー种表达⑶3的细胞上的⑶3复合物；第二多肽构建体，其包含与至少ー种抗原结 合多肽构建体融合的、与所述第一转运蛋白多肽不同的第二转运蛋白多肽，所述至少ー种 抗原结合多肽构建体结合至少ー种B细胞上的靶抗原；其中所述第一和第二转运蛋白多肽 通过白蛋白的节段化而获得，并且每个转运蛋白多肽包含与白蛋白的区段具有至少90%同 一性的氨基酸序列，以使得所述转运蛋白多肽自组装以形成准天然白蛋白，并且其中所述 第一货物多肽不具有存在于所述第二货物多肽中的任何结合结构域。
[0021] 在某些实施方案中提供ー种本文所描述的异多聚体，其中所述多特异性异多聚体 构建体同时接合所述至少ー种B细胞和所述至少一种表达CD3的细胞，以使得所述表达CD3 的细胞被活化，从而诱导所述B细胞的杀伤。在一些实施方案中，所述结合至少ー种B细胞 上的靶抗原的抗原结合多肽构建体包含衍生自抗体、纤连蛋白、亲和体、抗运载蛋白、半胱 氨酸结蛋白、DARPin、avimer、Kunitz结构域或其变体或衍生物的至少ー个祀抗原结合结构 域。在某些实施方案中，所述抗原结合多肽构建体包含至少ー个CD19结合结构域。
[0022] 在某些实施方案中提供ー种本文所描述的多特异性异多聚体，其中所述抗原结合 多肽构建体包含至少ー个⑶20结合结构域。
[0023] 在某些实施方案中提供ー种本文所描述的多特异性异多聚体，其中所述至少ー种 ⑶3结合多肽构建体包含衍生自⑶3特异性抗体、纳米抗体、纤连蛋白、亲和体、抗运载蛋 白、半胱氨酸结蛋白、DARPin、avimer、Kunitz结构域或其变体或衍生物的至少ー个⑶3结 合结构域。在一些实施方案中，所述至少ー个CD3结合结构域包含至少ー个氨基酸修饰，所 述至少ー个氨基酸修饰与不包含所述修饰的对应CD3结合结构域相比降低免疫原性。在一 些实施方案中是本文所描述的分离的多特异性异多聚体，其中所述至少ー个CD3结合结构 域包含至少ー个氨基酸修饰，所述至少ー个氨基酸修饰与不包含所述修饰的对应⑶3结合 结构域相比増加其稳定性（如通过1"所测量）。在一些实施方案中，所述至少ー种⑶3结 合多肽构建体包含衍生自CD3特异性抗体的至少ー个CD3结合结构域，所述CD3特异性抗 体是缺乏轻链的重链抗体。在某些实施方案中，所述至少ー种⑶3结合多肽构建体包含衍 生自非抗体蛋白支架结构域的至少ー个CD3结合结构域。
[0024] 在一个实施方案中提供本文所描述的分离的异多聚体构建体，其中所述第一和第 二多肽构建体中的至少ー个还包含单链Fv多肽。在某些实施方案中提供本文所描述的分 离的异多聚体构建体，其中所述第一和第二多肽构建体中的至少ー个还包含单链Fab多 肽。
[0025] 在一些实施方案中是本文所描述的分离的异多聚体构建体，其中所述表达CD3的 细胞是T细胞。在某些实施方案中是本文所描述的分离的异多