专利名称：工业废水处理中的功能菌群特异性分子检测方法
技术领域：
本发明涉及的是一种废水处理技术领域的方法，具体是一种工业废水处理中的功能菌群(Thauera属)特异性分子检测方法。
背景技术：
复杂多样的微生物群落是生物废水处理装置中核心成分，它的组成和结构往往决定了这个系统处理效果的好坏，而其中的某些特定类型的微生物群落又扮演了特别重要的角色，如Thauera属这一类群的细菌。先前的研究结果表明，Thauera属这类菌群在反硝化以及降解有机物，特别是芳香族化合物的降解过程中起了非常重要的作用(Liu et al.，FEMS Microbiol Ecol，2006，55274-286)。而且这类菌在反硝化类型的废水处理装置中含有极高的比例(约56％)，因此这一类型的细菌被认为是在废水处理过程中起非常重要作用的功能菌群。但是目前广泛使用的分离培养的方法不仅耗时耗力，而且难以获得这类菌群的主要信息。因此发展快捷方便的分子方法来特异性的研究这类菌群是十分有必要的。
经对现有技术的文献检索发现，对废水处理中的重要功能菌群-Thauera属的研究主要都基于分离培养得到的纯菌。Microarry和Real Time PCR等技术也开始在Thauera的研究中应用，但是这些方法只说明它是否存在或者是量的多少，没有说明它的组成。然而，不是每一种存在的Thuaera都是起作用的或起同等作用的，因此了解一个废水处理装置中这类菌群的组成，利用它来专一性研究废水处理系统中的Thauera的组成，不仅能够快速的检测废水处理装置的运行状态，还能够预测系统的发展、防止系统恶化。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种工业废水处理中的功能菌群特异性分子检测方法。使其能够快速、高通量检测废水处理装置中重要菌群的分子。
本发明采用在微生物生态学领域广泛使用的PCR-DGGE技术结合主成分分析(PCA)，从重要功能菌群组成的角度来监测一个废水处理装置的运行状态，并预报它的发展趋势。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明的具体步骤如下①.从废水处理装置中采集生物膜样品，并提取基因组DNA；提取样品的基因组DNA，具体为从废水处理装置中采集生物膜样品经过预处理，然后提取基因组DNA。
②.使用Thauera特异性引物进行PCR扩增，并使用16s rDNA v3区通用引物进行嵌套PCR扩增；所述的Thauera特异性PCR扩增使用的是特异性引物Thau832与通用引物P0，然后以此PCR扩增产物，再用16s rDNA v3区通用引物P2和P3进行扩增以得到能用于DGGE分析的DNA片段。
所述的PCR扩增，是指进行嵌套PCR进行扩增，具体为先用Thauera特异性PCR，其体系包括特异性引物Thau832(5’-TGCATTGCTGCTCCGAAC-3’)和16srDNA通用引物P0(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)进行第一轮PCR扩增。第一轮PCR产物稀释后作为16S rDNA v3扩增的模板，进行V3区PCR扩增，采用引物2(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和引物3(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)，获得Thauera属专一性的16S rDNA的V3区DNA扩增产物。
③.使用DGGE对扩增产物进行分离；所述的使用DGGE对扩增产物分离，是指变性剂梯度为40-58％的聚丙烯酰胺胶(浓度为8％)被用于对这些属于Thauera的克隆v3片段及A2样品的Thauera特异性PCR的产物进行分析。
④.构建16s rDNA全长克隆文库，来确证本方法的可靠性；所述的16s rDNA全长克隆文库，通过16s rDNA全长克隆文库的办法，证实这种检测废水处理系统中的重要菌群Thauera的种群特异性PCR-DGGE方法。
⑤.结合主成分PCA分析来监测工业废水处理装置的运行情况。
所述的PCA分析，利用Image J对DGGE胶进行数字化，获得条带的位置及其亮度的信息后，使用Matlab 7.01对这些数据做PCA分析。
本发明通过16s rDNA全长克隆文库的办法，证实了这种检测废水处理系统中的重要菌群Thauera的种群特异性PCR-DGGE方法是可靠而高效的。该模型可用于追踪监测废水处理系统中的重要功能菌群Thauera的组成，并由此来迅速判断装置的运行情况，并且利用PCA建立的分析模型来预测装置的发展趋势，以预防系统走向崩溃。
图1 Thauera特异性V3区PCR扩增产物和属于Thauera克隆的DGGE分析示意中A2A2池的Thauera特异性PCR产物；mThauera的13个克隆的混合物；1-13Thauera的13个不同的克隆图2焦化废水处理装置的COD去除率示意中1-6为采样时间点图3 6个采样时间点的Thauera特异性V3区PCR扩增产物的DGGE分析示意4 DGGE胶的主成分分析示意中1-6A2和O2池每周的六个采样时间点具体实施方式
下面通过实例进一步描述本发明。Thauera属的种群特异性PCR-DGGE方法的建立及其应用(1)样品采集及DNA提取生物膜样品采自上海某焦化厂废水处理装置的缺氧池和好氧池。样品采集后先进行预处理样品中加5倍体积的TENP缓冲液(50mM Tris，20mM EDTA，100mMNaCl 0.01g/ml PVP，pH10)，加玻璃珠充分旋涡5min。10000g，4℃离心5min，收集沉淀。加5倍体积的PBS缓冲液(8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，0.24g/L KH2PO4，pH7.4)，旋涡，收集沉淀(重复二次)。加PBS缓冲液悬浮，分装到10ml的离心管中，每管加4ml悬浮液和1ml甘油，旋涡均匀。然后再进行DNA提取，提取方法如下将前处理好的样品分装在离心管中，离心，收集50mg样品，加200μl提取缓冲液(100mM Tris，100mM EDTA，200mM NaCl，1％PVP，2％CTAB，pH 8.0)，加2粒玻璃珠，漩涡5min，使样品充分悬浮。加入200μl SDS缓冲液(2％SDS)，上下颠倒5min，放置冰上。样品进行13000g离心10min，用200μl的移液器将上清液转移到一个新的epp管内。加入400μl平衡酚，颠倒离心管混匀样品。然后进行13000g离心15min，用200μl的移液器小心将上清液转移到一个新的离心管内。同样方法用200μl平衡酚和200μl氯仿、400μl氯仿各抽提一次，加入0.6倍体积异丙醇，上下颠倒混匀。样品于-20℃沉淀过夜，14000g离心样品20min，倒掉上清液。用70％乙醇洗涤两次，冷冻干燥30分钟。用100μl ddH2O悬浮样品。加入1.5μl RNaseA(20mg/ml)37℃消化20min。得到的DNA使用V-Gene PCR Clean-up Kit进行纯化，并使用DNA浓度仪DyNA QuantTM200 fluorometer(Amersham Pharmacia Biotech，USA)测定浓度，并在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳检查其大小。
(2)Thauera特异性PCR扩增及嵌套的16s rDNA v3区扩增Thauera特异性PCR的(25μl)体系包括特异性引物Thau832(5’-TGCATTGCTGCTCCGAAC-3’)和16s rDNA通用引物P0(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)各10pmol，dNTP各5mM，模板DNA 20ng，Taq DNA聚合酶1U(Promrga，USA)以及配套的1×缓冲液及50mmol MgCl2。其PCR程序如下95℃4min；94℃ 1min变性，60℃复性1min，72℃延伸1min，共30个循环；然后再72℃延伸6min。对此PCR产物稀释后作为v3扩增的模板，进行嵌套PCR扩增，采用引物2(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和引物3(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGC CTACGGGAGGCAGCAG-3’)，PCR扩增体系及程序采用Muyzer等人的方法。50μL PCR反应体系中包含2.5mM的dNTPs 4μL，10′PCR反应缓冲液5μL，25pmol/μ L的引物各1μL，10ng的模板，1u的Taq DNA(TaKaRa公司)聚合酶，高纯水补足50μL。PCR采用thermocycler PCR系统(PCR Sprint，Thermo electron，Corp.，UK)反应的程序为94℃变性4min，然后94℃1min，55℃1min，72℃1min，共20个循环，最后72℃延伸6min。
(3)使用DGGE方法对v3序列进行分析变性梯度为40-58％的DGGE胶(浓度为8％)被用于对这些属于Thauera的克隆v3片段及A2样品的Thauera特异性PCR的产物进行比较分析。发现克隆文库中的13个不同v3序列在胶上分成了11条带，A2样品中出现了4条主要条带，而且在克隆文库中都有相同迁移率的条带(图1)。这说明虽然用这种特异性PCR-DGGE的办法监测到的条带相对克隆文库少，即它的灵敏度相对较低，但是它的特异性较高。因此它是一种可以信赖的，能够用于快速检测复杂细菌群落中的重要功能菌群-Thauera。
(4)Thauera特异性PCR-DGGE方法在工业废水处理装置中的应用使用这个Thauera特异性PCR-DGGE的方法，我们对一个工业废水处理装置中的Thauera属的组成进行了6周的追踪监测。在第4周采样后，装置的回流泵被关闭，其COD去除效率开始下降(图2)。发现其组成比较简单，主要为4条条带，而且来自不同时间及缺氧池和好氧池样品间的差异很小(图3)。利用ImageJ对DGGE胶进行数字化，获得条带的位置及其亮度的信息后，使用matlab 7.01对这些数据做PCA分析。结果如图4所示。发现在运行状况不好，COD去处率明显下降的采样时间6时，它在PCA上的空间分布明显不同于正常时。这说明这种Thauera特异性PCR-DGGE能够快速而且正确的检测到废水处理装置中Thauera的组成的变化。
综上所述，使用这种Thauera特异性PCR-DGGE方法对废水处理装置检测的结果表明，这种方法能够快速的分析其中的重要功能菌群-Thauera属。以上结果证明，用本发明对废水处理装置中的Thauera属的组成进行监测，不仅是可行的，而且是准确可靠的，它的变化能够很好的体现一个废水处理装置的运行状态。
权利要求
1.一种工业废水处理中的功能菌群特异性分子检测方法，其特征在于，具体步骤如下①.从废水处理装置中采集生物膜样品，并提取基因组DNA；②.使用Thauera特异性引物进行PCR扩增，并使用16s rDNA v3区通用引物进行嵌套PCR扩增；③.使用DGGE对扩增产物进行分离；④.构建16s rDNA全长克隆文库，来确证本方法的可靠性；⑤.结合主成分PCA分析来监测工业废水处理装置的运行情况。
2.根据权利要求1所述的工业废水处理中的功能菌群特异性分子检测方法，其特征是，所述的提取基因组DNA，具体为从废水处理装置中采集生物膜样品经过预处理，然后提取基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的工业废水处理中的功能菌群特异性分子检测方法，其特征是，所述的Thauera特异性PCR扩增使用的是特异性引物Thau832与通用引物P0，然后以此PCR扩增产物，再用16s rDNA v3区通用引物P2和P3进行扩增以得到能用于DGGE分析的DNA片段。
4.根据权利要求1所述的工业废水处理中的功能菌群特异性分子检测方法，其特征是，所述的PCR扩增，是指进行嵌套PCR进行扩增，具体为先用Thauera特异性PCR，其体系包括特异性引物Thau832(5’-TGCATTGCTGCTCCGAAC-3’)和16s rDNA通用引物P0(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)进行第一轮PCR扩增。第一轮PCR产物稀释后作为16S rDNA v3扩增的模板，进行V3区PCR扩增，采用引物2(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和引物3(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)，获得Thauera属专一性的16S rDNA的V3区DNA扩增产物。
5.根据权利要求1所述的工业废水处理中的功能菌群特异性分子检测方法，其特征是，所述的使用DGGE对扩增产物分离，是指变性剂梯度为40-58％的聚丙烯酰胺胶(浓度为8％)被用于对这些属于Thauera的克隆v3片段及A2样品的Thauera特异性PCR的产物进行分析。
6.根据权利要求1所述的工业废水处理中的功能菌群特异性分子检测方法，其特征是，所述的16s rDNA全长克隆文库，通过16s rDNA全长克隆文库的办法，证实这种检测废水处理系统中的重要菌群Thauera的种群特异性PCR-DGGE方法。
7.根据权利要求1所述的工业废水处理中的功能菌群特异性分子检测方法，其特征是，所述的PCA分析，利用Image J对DGGE胶进行数字化，获得条带的位置及其亮度的信息后，使用Matlab 7.01对这些数据做PCA分析。
全文摘要
一种工业废水处理中的功能菌群特异性分子检测方法。具体步骤(1)从废水处理装置中采集生物膜样品，并提取基因组DNA；(2)使用Thauera特异性引物进行PCR扩增，并使用16s rDNA v3区通用引物进行嵌套PCR扩增；(3)使用DGGE对扩增产物进行分离；(4)构建16s rDNA全长克隆文库，来确证本方法的可靠性；(5)使用本方法结合主成分分析(PCA)来监测工业废水处理装置的运行情况。本发明可用于追踪监测废水处理系统中的重要功能菌群Thauera的组成，并由此迅速判断装置的运行情况。本发明还可以预测装置的发展趋势。
文档编号C12Q1/04GK1995389SQ200610116628
公开日2007年7月11日 申请日期2006年9月28日 优先权日2006年9月28日
发明者赵立平, 毛跃建, 张晓君, 严兴 申请人:上海交通大学