多发性内分泌腺瘤ii型基因突变检测的新方法

专利名称：：多发性内分泌腺瘤ii型基因突变检测的新方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，本发明涉及一种获得RET基因扩增产物的方法，所述的扩增产物无需测序即可用于检测RET基因变异。
背景技术：
：多发性内分泌腺瘤2型(MEN2)的发病率约在1/30，000左右，分为MEN2A、MEN2B和家族性甲状腺髓样癌(FMTC)。几乎所有的MEN2A病人均有甲状腺髓样癌(MTC，一种从分泌降钙素的C细胞而来的恶性肿瘤)或C细胞增生。嗜铬细胞瘤和甲状旁腺增生在MEN2A病人中分别占大约50%和15-30%。MEN2B患者除患有MTC以外，50%表现为嗜铬细胞瘤，更少的一部分表现为肠道的神经节瘤，角膜神经的粗大和马方体征。MTC是FMTC患者唯一的表型。很多的MEN2疾病的发生是由RET基因突变引起的，小鼠模型发现，RET对于交感、副交感神经及肠道神经系统和肾脏的发育有关键作用。所以在人类中，RET基因的突变引起了MEN等遗传病的发生。RET(RearrangedDuringTransfection)原癌基因位于IO号染色体长臂，长60kb，含21个外显子，编码一组约1，IOO个氨基酸的酪氨酸激酶受体(RTK)超家族的RET蛋白。酪氨酸激酶受体(RTK)和很多基因导致的疾病相关。它们是一组跨膜的受体，分为胞外区，跨膜区和胞内区。它的胞外部分包含4个类黏附素的重复片段，一个钙结合区和一个富含半胱胺酸的结构区。胞内区是一个含有酪氨酸激酶的结构区。胞内区所含的酪氨酸残基在受体与配体结合后能自动磷酸化，激活下游信号途径。RET蛋白是多分子的复合物，能结合胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)家族(GFL)。GDNF包含4种成员GDNF、neuroturin(NRTN)、artemin(ARTN)和pers印hin(PSPN)。正常情况下，RET配体先与共同受体结合，然后再结合并激活RET受体。其共同受体(GFRa)是一组通过糖磷脂酰肌醇(GPI)连接定位于细胞膜表面的蛋白家族，包括GFRa-1、GFRa-2、GFRa-3及GFRa-4四种成员。配体先与共同受体结合形成GFL/GFRa复合物，然后受体二聚化使两个RET相互靠近的结构域并置，使酪氨酸残基磷酸化，触发细胞内的信号传导。磷酸化的酪氨酸通过结合胞内带有Src同形异构体2和磷酸化酪氨酸结合区的蛋白把信号传导下去。这样，配体激活的RTK就引发了细胞内的信号级联反应，最终起到调控基因表达和生物效应的作用。RET基因的突变在多方面增强了RET酪氨酸激酶信号传导的功能，也就是说，它们促使了激酶的活化和原癌基因的转化。促使MEN2中原癌基因发生转化的机制是由于氨基酸位点的变化。RET胞外区半胱氨酸的突变阻止了分子间二硫键的形成，使游离的半胱氨酸残基形成分子间键，形成了RET共价二聚体，自发启动胞内酪氨酸残基磷酸化，激活下游信号途径。下游信号的激活启动了一系列级联反应，使细胞过度增殖分化，形成肿瘤。PI3K/AKT通路中的AKT能介导多种细胞的应答，比如BAD的活化。因此，PI3K/AKT通路的活化对于RET介导的反应过程是必须的。较之MEN2A而言，AKT和JNK的磷酸化能显著提高MEN2B的转化力。近来，Marshall等人报导JNK通路对MEN2B的转移也有作用。这些说明AKT和JNK的高水平的活化可能是导致MEN2B的强侵袭力的原因。尽管人们已知RET基因的突变是MEN2发病的原因，然而，目前现有技术中报道的RET基因的突变位点有很多种，包括氨基酸密码子第609、611、618、620、634、635、637、790、791、804、806、883、891、918位等位点。并且对于不同的区域、不同的人类群体、不同的人类种族而言，RET基因的突变位点均不相同，且差异较大。特别是在中国，由于MEN2发病机率低、收集和总结需要付出大量的工作和时间，目前还没有中国人群中RET基因突变状况的研究报导。并且，目前现有技术中一般对于检测RET基因的MEN2发病相关位点的变异的过程非常复杂且位点针对性不明确，检査时间通常需要持续几天，这方面也需要进行改进。
发明内容本发明人在研究中发现，中国人群的RET基因突变导致的MEN2A都是RET蛋白的634位氨基酸的变化，而MEN2B都是RET蛋白的918位氨基酸的变化。因此，本发明的目的在于提供中国人RET基因的单核苷酸多态性。本发明的另一目的在于提供一种检测RET基因突变的方法。本发明的另一目的还在于提供一种获得RET基因扩増产物的方法,转录本、，存在RET在本发明的第一方面，提供一种体外确定样品中是否存在RET基因、转录本、和/或蛋白变异的方法，所述的方法包括检测样品中RET基因、转录本、和/或蛋白，并与正常的RET基因和/或蛋白相比较，存在选自下组的一个或多个变异形式就表明该样品基因、转录本、和/或蛋白变异RET基因外显子ll，第634位氨基酸C—W，或其密码子TGC—TGG;RET基因外显子ll，第634位氨基酸C—Y，或其密码子TGC—TAC;RET基因外显子ll，第634位氨基酸C—R，或其密码子TGC—CGC;RET基因外显子ll，第634位氨基酸C—F，或其密码子TGC—TTC;RET基因外显子ll，第634位氨基酸C—S，或其密码子TGC—TCC;或RET基因外显子16,第918位氨基酸M—T，或其密码子ATG—ACG;其中，氨基酸位置编号基于GenBank登录号NP_066124。在本发明的另一优选例中，检测的是RET基因的核苷酸序列，并与正常RET基因的核苷酸序列比较差异。在本发明的第二方面，提供一种体外确定核酸样品中是否存在RET基因变异的试剂盒，它包括(i)特异性扩增RET基因外显子11的引物，所述的引物扩增出的扩增产物含有对应于RET基因外显子ll，第634位氨基酸的密码子；以及(ii)特异性扩增RET基因外显子16的引物，所述的引物扩增出的扩增产物含有对应于RET基因外显子16，第918位氨基酸的密码子。在本发明的另一优选例中，所述的特异性扩增RET基因外显子11的引物的序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；和/或所述的特异性扩增RET基因外显子16的引物的序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒还包括虾碱酶SAP和外切酶ExonI。在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒用于检测多发性内分泌腺瘤2型。在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒还包括针对RET基因外显子ll、第634位氨基酸密码子和针对RET基因外显子16、第918位氨基酸密码子的单碱基延伸反应的引物。在本发明的另一优选例中，所述的单碱基延伸反应的引物的序列如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。在本发明的另一优选例中，所述的RET多核苷酸的第634位和/或第918位的密码子选自下组RET基因外显子ll，第634位氨基酸密码子TGC—TGG;RET基因外显子ll，第634位氨基酸密码子TGC—TAC;RET基因外显子ll，第634位氨基酸密码子TGC—CGC;RET基因外显子ll，第634位氨基酸密码子TGC—TTC;RET基因外显子ll，第634位氨基酸密码子TGC—TCC;或RET基因外显子16，第918位氨基酸密码子ATG—ACG;其中，氨基酸位置编号基于GenBank登录号NP—066124。在本发明的第三方面，提供一种RET多核苷酸的用途，其中所述的RET多核苷酸的第634位和/或第918位的密码子不同于野生型RET基因，用于制备检测多发性内分泌腺瘤2型的试剂盒。在本发明的第四方面，提供一种获得RET基因扩增产物的方法，所述的方法包括(1)以DNA样品为模板，PCR扩增RET基因序列，获得第一扩增产物；禾口(2)以步骤(l)获得的第一扩增产物为模板，进行单碱基延伸反应，获得第二扩增产物。在本发明的另一优选例中，所述的DNA样品为基因组DNA。在本发明的另一优选例中，所述的RET基因序列是RET基因外显子11和RET基因外显子16的全部或部分序列。在本发明的另一优选例中，所述的单碱基延伸反应采用CEQSNP-PnraerExtensionKit进行。在本发明的另一优选例中，在步骤(l)中，采用以下引物对进行PCR扩增SEQIDNO:l和SEQIDNO:2所示的引物对，和SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物对。在本发明的另一优选例中，所述的引物对的退火温度均控制在58土rC。在本发明的另一优选例中，在步骤(2)中，采用以下引物进行单碱基延伸反应SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8。在本发明的另一优选例中，在步骤(1)中，还包括采用虫下碱酶SAP和外切酶ExonI来纯化所述的第一扩增产物。在本发明的另一优选例中，在步骤(2)中，还包括采用虾碱酶SAP来纯化所述的第二扩增产物。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1显示了MEN2致病位点筛査的流程示意图。图2显示了采用CEQ8800仪器对受试者进行RET突变位点检测的结果，结果显示RET基因没有发生突变。图3显示了采用CEQ8800仪器对受试者进行RET突变位点检测的结果，结果显示RET基因发生了第634位氨基酸的突变。图4显示了采用CEQ8800仪器对受试者进行RET突变位点检测的结果，结果显示RET基因发生了第918位氨基酸的突变。具体实施方式本发明人针对中国20个多发性内分泌腺瘤2型(MEN2)的发病家系的深入研究首次发现，中国人群RET基因突变导致的MEN2A疾病都是634位氨基酸的变化引起的，而MEN2B疾病都是918位氨基酸的变化引起的。并且，发明人还设计了一种检测该两个位点的突变的方法，所述方法操作简单、耗时短且成本低。基于此完成了本发明。因此，基于本发明人的新发现，可以利用RET基因或其蛋白(i)针对中国人群进行MEN2疾病的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)早期评估相关人群MEN2患病风险，早期监测早期预防。RET(RearrangedDuringTransfection)原癌基因位于10号染色体长臂，长60kb，含21个外显子，其基本序列在GenBank上的登录号为NM—020975，编码一条1114个氨基酸的酪氨酸激酶受体(RTK)超家族的RET蛋白。具体可参见网址http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/。本发明中，RET核苷酸位置编号基于GenBank登录号NM—020975，RET蛋白的位置编号基于Genbank登录号NP—066124。本发明人通过对于来自中国不同地区(包括上海、浙江、江苏、福建、广东、江西、山东、陕西、四川、辽宁等地)的20个家系(100多人)的MEN2病例进行了深入的研究，并与正常对照进行比较，证实中国人群RET基因突变导致的MEN2A疾病都是634位氨基酸的变化引起的，而MEN2B疾病都是918位氨基酸的变化引起的。野生型的RET蛋白序列如下(SEQIDNO:17):MAKATSGAAGLRLLLLLLLPLLGKVALGLYFSRDAYWEKLYVDQAAGTPLLYVHALRDAPEEVPSFRLGQHLYGTYRTRLHENNWICIQEDTGLLYLNRSLDHSSWEKLSVRNRGFPLLTVYLKVFLSPTSLREGECQWPGCARVYFSFFNTSFPACSSLKPRELCFPETRPSFRIRENRPPGTFHQFRLLPVQFLCPNISVAYRLLEGEGLPFRCAPDSLEVSTRWALD卿REKYELVAVC雨AGAREEVVMVPFPVTVYDEDDSAPTFPAGVDTASAVVEFKRKEDTVVATLRVFDADWPASGELVRRYTSTLLPGDTWAQQTFRVEHWPNETSVQANGSFVRATVHDYRLVLNRNLSISENRTMQLAVLVNDSDFQGPGAGVLLLHFNVSVLPVSLHLPSTYSLSVSRRARRFAQIGKVCVENCQAFSGINVQYKLHSSGANCSTLGWTSAEDTSGILFV離KALRRPKCAELHYMVVATDQQTSRQAQAQLLVTVEGSYVAEEAGCPLSCAVSKRRLECEECGGLGSPTGRCEWRQGDGKGITRNFSTCSPSTKTCPDGHCDVVETQDINICPQDCLRGSIVGGHEPGEPRGIKAGYGTCNCFPEEEKCFCEPEDIQDPLCDELSRTVIAAAVLFSFIVSVLLSAFCIHCY服FAHKPPISSAEMTFRRPAQAFPVSYSSSGARRPSLDSMENQVSVDAFKILEDPKWEFPRKNLVLGKTLGEGEFGKVVKATAFHLKGRAGYTTVAVKMLKENASPSELRPDERALTMGDLISFAWQISQGMQYLAEMKLVHRDLAARNILVAEGRKMKISDFGLSRDVYEEDSYVKRSQGRIPVK，IESLFDHIYTTQSDVWSFGVLLWEIVTLGGNPYPGIPPERLFNLLKTG服MERPDNCSEEMYRLMLQCWKQEPDKRPVFADISKDLEKMMVKRRDYLDLAASTPSDSLIYDDGLSEEETPLVDCNNAPLPRALPSTWIENKLYGMSDPNWPGESPVPLTRADGTNTGFPRYPNDSVYANWMLSPSAAKLMDTFDS上述序列中，下划线所标示分别为第634位和第918位两个中国人群MEN2疾病相关位点。因此，基于上述这种相关性可进行MEN2患者的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析。更进一步地，从RET基因表达异常的MEN2人群中分离出具有不同RET基因SNP位点的患者，从而可实现更精确的治疗。基于上述的相关性以及甲MEN2的分型，还可针对性地评估相关人群的MEN2治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法，从而避免盲目给药或盲目治疗。基于上述的相关性以及RET基因的单核苷酸多态性位点，可早期评估相关人群MEN2患病风险，从而可实现早期监测、早期预防。基于上述发现，可采用各种技术来检测MEN2相关的RET基因或蛋白变异位点，这些技术均包含在本发明中。例如，对RET的蛋白或基因进行序列测定，从而判断是否发生变异。此外，用RET蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增，也可检测RET蛋白的转录产物。在检测RET基因变异时，检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。可用己有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northera印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。针对目前检测RET基因突变过程烦琐复杂、耗费时间长的缺点，本发明人提供了一种过程简单且快速的获得RET基因扩增产物的方法，所述方法获得的扩增产物无需测序和烦琐的序列比对，通过核酸序列分析仪(如CEQ8800遗传分析仪)等检测仪器即可获得RET基因是否发生变异的检测结果。所述的方法根据前己述及的中国人群RET基因突变情况而设计，精确且简易。所述的方法包括(1)以DNA样品为模板，PCR扩增RET基因，获得第一扩增产物；和(2)以步骤(l)获得的第一扩增产物为模板，进行单碱基延伸反应，获得第二扩增产物。所述的第二扩增产物即是直接可用于检测RET基因变异的RET扩增产物。单碱基延伸技术，其原理是设计一条引物，位于待测SNP位点的上游，并且该引物的3'端距离SNP位点一个碱基。加入不同荧光标记的ddNTP进行反应，只有当加入的ddNTP与SNP位点碱基互补时，引物才得以延伸。接着，通过检测延伸碱基所发出的荧光来判断SNP的类型。更优选的，所述的方法还包括在获得扩增产物后，采用虫下碱酶和外切酶纯化所述的扩增产物。在进行纯化时，本发明人比较了许多种类的纯化试剂或试剂盒产品，结果发现，采用虾碱酶(SAP)&外切酶(ExonI)纯化优于采用其它的产品，采用虾碱酶和外切酶纯化的优点是稳定、快速，不需要最终的浓度检测。而使用其它的纯化试剂或试剂盒，虽然也可以达到纯化的目的，但是当需要进行检测的标本数量很多时，需要进行反复的离心、加样，耗费很多人力和时间。此外，采用纯化试剂盒，对于最终纯化产品的检测依然需要电泳或者分光光度计的检测，比之虾碱酶&外切酶纯化方法，过程繁琐了许多。更优选的，采用以下引物对进行PCR扩增引物对l:5，〉ATGAGGCAGAGCATACGCA〈3，，5'〉GGAGTAGCTGACCGGGAA<3，；禾口引物对2:5，>AGGGATAGGGCCTGGGCTTC<3，，5'>TAACCTCCACCCCAAGAGAG<3，；并且，本发明人将两对引物的退火温度都控制在58士rc。一般情况下，在两对引物采用不同的退火温度时，'要占用两台扩增仪器进行反应。而将引物的退火温度控制同一温度，简化了操作步骤，在设备基础一定的情况下，可以进行更多的扩增反应，加快了获得扩增产物的速度。更优选的，设计的单碱基延伸反应的引物为5，>cccacagatccactgtgcgacgagctg<3，；5，〉acccccacccacagatccactgtgcgacgagctgt<3，；5，>agacgatgaaggagaagaggacagcggctgcgatcaccgtgcg<3，；禾口5'>cacgacgttgtaaaacgacttctctttagggtcggattccag"tteiaatgga<3，。本发明还提供了用于在分析物中检测含有RET基因变异的试剂盒，该试剂盒包括装在适当容器中的、用于特异性扩增RET基因或转录本的引物，并且用所述引物扩增出的扩增产物含有本发明所鉴别出的变异部位，和/或还包括使用说明。因此，本发明提供了可用于检测MEN2疾病的试剂盒，所述的试剂盒中可包括特异性扩增RET基因的引物。优选的，所述的试剂盒中包括特异性扩增RET基因外显子11的引物，更优选的为扩增外显子11第634位氨基酸密码子及其附近的序列的引物；以及特异性扩增RET基因外显子16的引物，更优选的为扩增外显子16第918位氨基酸密码子及其附近的序列的引物。优选的，它还含有选自下组的试剂(a)与RET基因的突变部位结合的探针；或(b)识别RET基因的突变位点的限制性内切酶。更优选的，所述的探针为与RET基因外显子ll，第634位氨基酸密码子变异部位结合的探针；以及与RET基因外显子16，第918位氨基酸密码子变异部位结合的探针。利用基因探针技术进行特异性检测的方法是本领域熟知的。在本发明的另一种优选方式中，所述的试剂盒中可包括特异性与RET基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。更优选的，所述试剂盒中还包括常规的可用于检测抗原抗体结合状况的试剂。本发明的主要优点在于(1)首次大规模对中国人MEN2A发病情况进行研究，发现并证实中国人群RET基因突变导致的MEN2A疾病都是634位氨基酸的变化引起的，而MEN2B疾病都是918位氨基酸的变化引起的。(2)首次开发一种获得RET基因扩增产物的方法，所获得的扩增产物特别适用于对中国人群的MEN2疾病进行检测，并且所述方法精确、简便、快速、稳定，无需进行烦琐的测序即可获得检测结果，将以往需要至少3天获得的工作减少到在1天内(8小时)完成。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1MEN2A的RET基因突变研究1.对象2002年1月至2006年2月期间共收集MEN2A先证者病例15例，这些病例来自于不同地区，包括上海、浙江、江苏、福建、广东、江西、山东、陕西、四川、辽宁等地。并对各先证者家系成员进行临床病史调查、血生化及DNA标本采集。共采集标本119例。2先证者及家系成员的RET原癌基因检测2.1外周血基因组DNA的抽提(酚-氯仿抽提法)。采集先证者及家族成员共119人的前臂正中静脉全血5ml，置于含1mlACD抗凝剂的15ml容积的离心管内，上下颠倒数次使血液与抗凝剂充分混匀。具体步骤(1)向上述离心管中加入8ml冰预冷的溶血试剂，颠倒5-10次，4。C下3500rpm离心15分钟，弃上清。(2)再次向该离心管中加入8ml冰预冷的溶血试剂，颠倒5-10次，4°C下3500rpm离心15分钟，弃上清。(3)加入2ml核悬液，轻轻摇匀。(4)加入20ul5(TC预热的10%SDS，再加入14ul蛋白酶K(20mg/ml)，于5(TC下100次/分钟轻轻震荡4小时。(5)在上述离心管中各加入等体积的酚，轻轻混匀使之呈乳白状，4°CT3，500rpm离心IO分钟，静置片刻，将上清液移入另一15ml离心管中。(6)向上述含上清液的离心管中加入与该上清液等体积的新鲜配制的苯酚二氯仿(10:IO)混合液，颠倒3-4次，混匀。4。C下3，500rpm离心IO分钟，将上清液再次移入另一15ml离心管中。(7)向各管上清液中加入200u1(1/10体积)的3M的醋酸钠溶液及6ml(2倍体积)的-2(TC预冷的无水乙醇，上下颠倒至析出絮状沉淀。(8)等絮状沉淀析出30-60分钟后，用1ultip头挑出沉淀，放入已事先加入无水乙醇的1.5ml的Epperldoff管中，在台式离心机上以13,OOOrpra离心20分钟，弃乙醇，让沉淀自然干燥。待完全干燥后，加入300ulTE溶解。(9)在37X:恒温箱内放置3天以使DNA充分溶解。2.2外周血DNA的聚合酶链反应(PCR)对RET原癌基因8、10、11、13、14、15和16外显子进行PCR扩增(各引物序列见表1，引物由上海生工生物技术有限公司合成)。PCR总反应体积20ul:基因组DNA2ul，dNTPs(各2.5mM)0.4ul，20uM的上下游引物各lul，TaqDNA聚合酶O.2ul，IOX缓冲液(含Mg2+)2ul，余下用水补足到20ii1。PCR扩增条件如下95"C预变性5min，94。C变性30S，5564。C退火45S(各引物具体退火温度可见表l，72'C延伸45S，30个循环，最后72'C延伸5min。每次反应均设正常人基因组DNA为阳性对照，同时设空白对照。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.3PCR产物检测A.制胶(1)取IOXTBE液IOml于三角烧杯中，加蒸馏水90ml，摇匀。(2)称取琼脂糖1.214g，加入上述烧杯中摇匀。(3)将上述液体加热、溶解，静置待冷却。(4)将溴乙锭5ul加入上述冷却液内，轻轻摇匀，倒入用胶带封好、插有齿梳的电泳槽内。静置1小时后，液体凝固，1.2%琼脂糖凝胶制备完成。B.电泳取3u1的PCR产物，加入2ul的上样缓冲液溴酚兰，混匀后各加入凝胶的点样孔内，并予Marker(DL2000)3u1加入点样孔对照。将凝胶放入电泳仪中，在lOOMy的电压下跑电泳20分钟。电泳结束后，经溴化乙锭染色的凝胶在紫外灯下观察，可见所需碱基长度的单一条带。2.4PCR产物的DNA测序A.PCR产物纯化PCR反应结束后，经1.2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，可见单一特异条带，符合所测各外显子长度片段，故用PCR产物纯化试剂盒PCRPurificationMineKit(华舜生物工程有限公司)对PCR产物进行纯化。纯化步骤(1)PCR反应体系小于50ul，用TE或ddH20补足到50ul。(2)加入5倍体积的PB联接液(华舜生物工程有限公司)250ul，混合均匀。(3)全部液体转入吸附柱中，离心8000rpm，15秒，保留收集管，弃去流出液。(4)加入400ulPB联接液，静置1分钟，离新8000rpm，15秒，弃去流出液。(5)加入500ul加入乙醇的Wl洗脱液(华舜生物工程有限公司)，离心8000rpm，15秒，弃去流出液。(6)再次加入500ul加入乙醇的Wl洗脱液，静置1分钟，离心8000rpm，15秒，弃去流出液。(7)12000rpm离心2分钟。(8)将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，在空气中放置5min左右以待乙醇气味消退，同时预热将用于洗脱的ddH20。(9)将适量的ddH2020-50ul滴到吸附柱的膜中央，室温放置3分钟。(10)12000rpm离心3分钟，弃去吸附柱，DNA溶液保存在-20°C冰箱中。B.DNA测序分析所有样本应用ABIPRISMTM377测序仪进行直接基因测序。样本均经双向测序，结果完全一致。3.数据分析运用SPSSforWindows11.5统计分析软件对所有数据结果进行统计分析。P〈0.05认为有统计学意义。结果本实施例共收集了互不相关的MEN2A先证者15例及其家系成员共119名的临床资料和血DNA标本。15个MEN2A家系的15例先证者RET原癌基因突变的检测结果见表2。表2编号突变碱基类型基因型突变氨基酸类型1TGC—TGGC634WCys—Trp2TGC—TACC634YCys—Tyr3TGC—CGCC634RCys—Arg4TGC—TACC634YCys—Tyr5TGC—TTCC634FCys—Phe6TGC—TACC634YCys—Tyr7TGC—TACC634YCys—Tyr8TGC—TGGC634WCys—Trp9TGC—CGCC634RCys—Arg10TGC—TACiC634YCys—Tyr11TGC—TACC634YCys—Tyr12TGC—TCCC634SCys—Ser13TGC—CGCC634RCys—Arg14TGC—TACC634YCys—Tyr15TGC—CGCC634RCys—Arg15个MEN2A家系的总119名家系成员的基因测序结果显示，存在RET原癌基因突变者共49例，其中33人因出现颈部肿块就诊，诊断为MTC，4人因高血压就诊，诊断为嗜铬细胞瘤。余12例为无任何临床相关症状，为RET原癌基因突变的携带者，其中9人作了基础降钙素的测定，8人测值增高(基础降钙素水平升高是怀疑有颈部淋巴结转移的征象)，但临床还未发现甲状腺病变及颈部淋巴结转移，可定位高危对象。在这49例RET原癌基因突变者中，均为第11外显子的634位点的突变，突变的类型有以下五种C634W，C634Y，C634R，C634F，C634S;其对应的编码核酸的突变分别如下TGC—TGG，TGC—TAC，TGC—CGC，TGC—TTC，TGC—TCC。实施例2MEN2B的RET基因突变研究1.对象2002年4月至ij2005年9月期间共收集来自全国各地的MEN2B家系5例，包括先证者5名，他们的家族成员23名。2RET原癌基因检测2.1外周血基因组DNA的抽提采集先证者及家族成员的外周抗凝血5ral，使用U-geneBloodDNAKit进行血液基因组DNA的抽提，具体步骤(1)在1.5ml离心管中加入250ul全血样品。(2)加入250ul的XY缓冲液(U-gene)，振荡混合均匀。(3)再加入20ul的蛋白酶K(10mg/ml)，剧烈振荡混合均匀。(4)56t:温浴过夜，颜色将变为墨绿色。(5)加入260ii1的无水乙醇，振荡混合，12000rpm离心1分钟，使溶液中的固体沉淀物甩至管底。(6)将DNA分离柱置于一个2ml的收集管中，将上步得到溶液倒入柱子中，8000rpm离心lmin，弃去该收集试管和流出液。(7)分离柱放于另一新的收集管，加入700ul的乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液(U-gene)洗涤，8000rmp离心lmin，保留该收集管，弃去流出液。(8)重复(7)—次。(9)使用同上的收集管，用12000rmp离心2min以甩干柱子。(10)将分离柱置于新的1.5ml离心管中，在空气中放置5min左右以待乙醇气味消退，同时预热DNA洗脱液(U-gene)以备用。(11)将200ix1的DNA洗脱液加入柱子中，并在室温中放置3min，12000rpm离心3min。(12)重复(ll)一次。(13)弃去分离柱，保留400ulDNA洗脱液于-20。C冰箱。2.2对RET原癌基因8、10、11、13、14、15、16外显子进行PCR扩增(各引物序列见表2)。PCR总反应体积20y1:基因组DNA2ixl，dNTPs(各2.5mM)0.4u1，20uM的上下引物各lul，TaqDNA聚合酶0.2ul，10X缓冲液(含Mg2+)2w1，余下用水补足到20y1。PCR扩增条件95。C预变性30s，55-64。C退火45°C(各引物退火温度见表2)，72。C延伸45s，40个循环，最后72°C延伸5min。PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。每次反应均设正常人基因组DNA为阳性对照，同时设空白对照。然后用PCR产物纯化试剂盒(华舜生物工程有限公司)对其PCR产物进行纯化。PCR产物纯化后，应用ABI377测序仪进行直接基因测序。样本均经双向测序，结果完全一致。结果5例先证者男4例(80%)，女1例(20%)，平均年龄26.8±11.7岁(13-40岁)，均有典型MEN2B的临床表现。5例先证者均因发现单侧颈前包块就诊，术后确诊为MTC。初诊时平均年龄为20.0±8.1岁(11-29岁)，MTC的发生率为100%。5例先证者均可见口唇粗厚、舌尖或舌1/3处散在粉红色半圆形结节，均经唇、舌黏膜活检病理证实为黏膜神经瘤；先证者中3例自幼儿起即有腹泻/便秘症状，持续至今；其中2例在儿童期曾拟诊巨结肠症。所有先证者均有眼睑增厚，其中4例视力下降；5例先证者均有类马凡体形。经测序发现，5例MEN2B先证者均有RET原癌基因第16外显子918位点突变，突变类型均为M918T，其对应的编码核酸的突变为ATG—ACG。23位家族成员的RET原癌基因检测均无突变。实施例3检测RET基因突变的方法由于采取前述实施例1或实施例2中所述的步骤进行RET基因突变非常烦琐，特别是需要进行测序，测序的缺点是耗费时间长(约需要3天)，并且过程复杂。因此，针对前述中国人群RET基因突变的情况，本发明人设计了用于检测该两个位点的一种精确且简易的方法。主要方法为利用单碱基延伸的方法，设计引物4条，用于针对第634、918位氨基酸位点的碱基检测。具体实验过程如图l所示。1.外周血基因组DNA的提取采集受试者的前臂正中静脉全血5ml，置于含lmlACD抗凝剂的15ml容积的离心管内，上下颠倒数次使血液与抗凝剂充分混匀。采用购自安徽优晶生物工程有限公司的DNA抽提试剂盒进行DNA提取，提取方法参考该试剂盒中内附的说明书。获得的抽提产物用于下一步的PCR实验，每管加样量为2ul。2.PCR扩增分别针对RET蛋白的634、918位两个氨基酸位点，设计如表3所示的两对引物对，对前述获得的DNA样品进行PCR扩增。针对634位点，该步扩增出来的是包含突变位点及其附近序列的266bp的片段；针对918位点，该步扩增出来的是包含突变位点及其附近序列的192bp的片段。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>PCR扩增的条件为三步法扩增，并且，采用博彩公司的Taq酶作为DNA聚合酶。并且，PCR的扩增条件如表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>共30个循环本发明人将两对引物的退火温度都控制在58'C。一般情况下，在两对引物采用不同的退火温度时，要占用两台PCR仪器进行反应。而本实施例将引物的退火温度均控制在58X:，简化了操作步骤，在设备基础一定的情况下，可以进行更多的PCR反应，加快了检测速度。通过上述方法，获得PCR扩增产物，即第一扩增产物。3.PCR扩增产物纯化在进行PCR纯化时，本发明人比较了QIAGEN、生工、华舜、博大等公司的PCR纯化试剂产品以及虾碱酶&外切酶纯化的方法，结果发现，采用虫下碱酶&外切酶纯化优于采用其它的产品，采用虾碱酶&外切酶纯化的优点是稳定、快速，不需要最终的浓度检测。采用虾碱酶(SAP)&外切酶(ExonI)纯化的具体方法为直接向6ul的PCR扩增产物中加入2ul的SAP(lU/ul)和0.lul的Exo1(10U/ul)，37。C处理l小时，75"C处理15分钟。此外，本发明人还尝试了使用QIAGEN、生工、华舜、博大等公司的PCR纯化试剂盒产品。上述公司的PCR纯化试剂盒虽然根据说明书介绍也可以达到纯化的目的，但是考虑到当需要进行检测的标本数量很多时，需要进行反复的离心、加样，耗费很多人力和时间。此外，釆用纯化试剂盒，对于最终纯化产品的检测依然需要电泳或者分光光度计的检测，比之虾碱酶&外切酶纯化方法，过程繁琐了许多。4.单碱基位点延伸反应除非另外说明，该步骤中使用的试剂获自CEQSNP-PrimerExtensionKit中(Beckman&Coulter公司)。以前述扩增和纯化后的DNA片段作为模板，设计的引物如表5。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>A.单碱基延伸的反应体系如表6。以下体系所用的试剂获自试剂盒CEQSNP-PrimerExtensionKit(Beckman&Coulter公司)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>B.反应条件如表7。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>共25个循环通过上述方法，获得单碱基延伸反应产物，即第二扩增产物。c.纯化反应向反应管中加入lul的SAP(lU/ul)，37°Cl小时，75°C15分钟。D.上样将纯化后的单碱基位点延伸产物各取O.lul加入到含有内标的上样缓冲液中，上样到CEQ8800仪器(购自美国BECKMAN公司)。E.结果采用上述的方法，对3位怀疑可能患有MEN2或携带RET突变的中国人进行检测。结果见图2-图4，红色的峰型(即图中峰A和峰B)是产物大小的标记物。其它的四个峰型，前三个峰(即图中的峰C、峰D和峰E)针对的是634位点，后一个峰(即图中的峰F)针对的是918位点。正常人峰C-峰F的峰型为单峰，如果发生疑似的改变，其中相应的峰的峰型会变成双峰。由测定结果可见，图2中的峰均为单峰，图3中峰E为双峰，图4中峰F为双峰。因此，图2证实受试者为没有发生突变的正常人、图3证实受试者为发生634位点突变的MEN2A患者或突变位点携带者；图4证实受试者为发生918位点突变的MEN2B患者或突变位点携带者进行检测。结果验证将前述测定中判断为634位和918位发生突变的人的RET基因再次进行测序验证。结果发现，两人的634位和918位缺失发生了突变，前者第634位的C变异为G;后者第918位的M变异为T。因此可见，采用本发明设计的方法在简化了程序的同时，所获得的扩增产物稳定、精确，非常适于核酸变异的检测。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。<110>上海交通大学医学院附属瑞金医院〈120〉检测RET基因突交的方法<130>065628<160〉16<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉19<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223>引物<400>1atgaggcagagcatacgca<210>2<211>18<212>DNA<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223>引物<400>2ggagtagctgaccgggaa<210>3<211〉20<212>DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223>引物<400>3agggatagggcctgggcttc<210〉4<211〉20〈212〉腿序列表1918<213>人工序列<220><221>misc一feature<223>引物<400〉4taacctccaccccaagagag20<210〉5<211〉27<212>DNA〈213〉人工序列<220><221〉misc一feature<223>引物<400〉5cccacagatccactgtgcgacgagctg27<210>6<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature<223>引物<400>6acccccacccacagatccactgtgcgacgagctgt35<210>7<211〉43<212>画<213>人工序列<220><221>inisc—feature<223〉引物<400>7agacgatgaaggagaag鄉acagcggctgcgatcaccgtgcg43〈210>8<211>51<212〉DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223〉引物<400〉8cacgacgttgtaaaacgacttctctttagggtcggattccagttaaatgga51<210>9<211>18<212〉DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<223>引物，<400>9ttgggcactagctggacg18<210〉10<211〉19<212>腿<213〉人工序列<220〉<221>misc一feature<223>引物<400>10accttcccaagtccagagt19<210>11<211>20<212〉DNA<213>人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400〉11cagaaaggcactgtgaccaa20<210>12<211〉20<212〉腿〈213〉人工序列〈220><221>misc一feature<223>引物<400>12gggacctcagatgtgctgtt<210>13<211>19<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉引物<400〉13ttggcgtcctagcatcagg<210〉14<211>19<212>腿<213>人工序列<220〉<221>misc一feature<223>引物<400〉14gacaagccgaaatccgaaa<210>15<211〉19<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>15ggcctgacgactcgtgcta<210>16<211>23<212>DNA〈213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400>16caaag組gacgatcctgctaat〈210>17<211>1114<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400〉17MetAlaLysAlaThrSerGlyAlaAlaGlyLeuArgLeuLeuLeuLeu151015LeuLeuLeuProLeuLeuGlyLysValAlaLeuGlyLeuTyrPheSer202530ArgAspAlaTyrTrpGluLysLeuTyrValAspGinAlaAlaGlyThr354045ProLeuLeu丁yrValHisAlaLeuArgAspAlaProGluGluValPro505560SerPheArgLeuGlyGinHisLeuTyrGlyThrTyrArgThrArgLeu65707580HisGluAsnAsnTrplieCyslieGinGluAspThrGlyLeuLeuTyr859095LeuAsnArgSerLeuAspHisSerSerTrpGluLysLeuSerValArg100105110AsnArgGlyPheProLeuLeuThrValTyrLeuLysValPheLeuSer115120125ProThrSerLeuArgGluGlyGluCysGinTrpProGlyCysAlaArg130135140ValTyrPheSerPhePheAsnThrSerPheProAlaCysSerSerLeu145150155160LysProArgGluLeuCysPheProGluThrArgProSerPheArglie165170175ArgGluAsnArgProProGlyThrPheHisGinPheArgLeuLeuPro180185190ValGinPheLeuCysProAsnlieSerValAlaTyrArgILeuLeuGlu195200205GlyGluGlyLeuProPheArgCysAlaProAspSerLeuGluValSer210215220ThrArgTrpAlaLeuAspArgGluGinArgGluLysTyrGluLeuVal225230235240AlaValCysThrValHisAlaGlyAlaArgGluGluValValMetVal245250255ProPheProValThr.ValTyrAspGluAspAspSerAlaProThrPhe260265270ProAlaGlyValAspThrAlaSerAlaValValGluPheL_ysArgLys275280285GluAspThrValValAlaThrLeuArgValPheAspAlaAspValVal290295300ProAlaSerGlyGluLeuValArgArgTyrThrSerThrLeuLeuPro305310315320GlyAspThrTrpAlaGinGinThrPheArgValGluHisTrpProAsn325330335GluThrSerValGinAlaAsnGlySerPheValArgAlaThrValHis340345350AspTyrArgLeuValLeuAsnArgAsnLeuSerlieSerGluAsnArg355360365ThrMetGinLeuAlaValLeuValAsnAspSerAspPheGinGlyPro370375380GlyAlaGlyValLeuLeuLeuHisPheAsnValSerValLeuProVal385390395400SerLeuHisLeuProSerThrTyrSerLeuSerValSerArgArgAla405410415ArgArgPheAlaGinlieGlyLysValCysValGluAsnCysGinAla420425430PheSerGlylieAsnValGinTyrLysLeuHisSerSerGlyAlaAsn435440445CysSerThrLeuGlyValValThrSerAlaGluAspThrSerGlylie450455460LeuPheValAsnAspThrLysAlaLeuArgArgProLysCysAlaGlu465470475480LeuHisTyrMetValValAlaThrAspGinGinThrSerArgGinAla485490495GinAlaGinLeuLeuValThrValGluGlySerTyrValAlaGluGlu500505510AlaGlyCysProL_euSerCysAlaValSerLysArgArgLeuGluCys515520525GluGluCysGlyGlyLeuGlySerProThrGlyArgCysGluTrpArg530535540GinGlyAspGlyLysGlylieThrArgAsnPheSerThrCysSerPro545550555560SerThrLysThrCysProAspGlyHisCysAspValValGluThrGin565570575AsplieAsnlieCysProGinAspCysLeuArgGlySerlieValGly580585590GlyHisGluProGlyGluProArgGlylieLysAlaGlyTyrGlyThr595600605CysAsnCysPheProGluGluGluLysCysPheCysGluProGluAsp610615620lieGinAspProLeuCysAspGluLeuCysArgThrVallieAlaAla625630635640AlaValUuPheSerPhelieValSerValLeuLeuSerAlaPheCys645650655lieHisCysTyrHisLysPheAlaHisLysProProlieSerSerAla660665670GluMetThrPheArgArgProAlaGinAlaPheProValSerTyrSer675680685SerSerGlyAlaArgArgProSerLeuAspSerMetGluAsnGinVal690695700SerValAspAlaPheLyslieLeuGluAspProLysTrpGluPhePro705710715720ArgLysAsnLeuValLeuGlyLysThrLeuGlyGluGlyGluPheGly725730735LysValValLysAlaThrAlaPheHisLeuLysGlyArgAlaGlyTyr740745750ThrThrValAlaValLysMetLeuLysGluAsnAlaSerProSerGlu755LeuArgAspL_eu770ProHisVallie785LeuLeulieValArgGluSerArg820ArgAsnSerSer835GlyAspLeulie850LeuAlaGluMet865LeuValAlaGluArgAspValTyr900lieProValLys915ThrThrGinSer930ValThrLeuGly945PheAsnLeuLeuLeutysGlu805LysSerSerLysGly885GluTrpAspGlyLys965TyrSerGluGluMet980AspLysArgProVal995MetValLys760SerGluPheAsnValLeu775LeuTyrGlyAlaCysSer790795TyrAlaLysTyrGlySer810ValGlyProGlyTyrLeu825LeuAspHisProAspGlu柳PheAlaTrpGinlieSer855LeuValHisArgAspLeu870875ArgLysMetLyslieSer890GluAspSerTyrValLys905MetAlalieGluSerLeu920ValTrpSerPheGlyVal935AsnProTyrProGlylie950955ThrGlyHisArgMetGlu970ArgLeuMetLeuGinCys985765LysGinValAsnHis780GinAspGlyProLeu800LeuArgGlyPheLeu815GlySerGlyGly830ArgAlaLeuThr845GinGlyMetGin860AlaAlaArgAsnAspPheGlyLeu895ArgSerGinGly910PheAspHislie925LeuLeuTrpGlu940ProProGluArgArgProAspAsn975TrpLysGinGlu990SerMetTyrlie880SerArgTyrlieLeu960CysProPheAlaAsplieSerLysAspLeuGluLysMet1010SerAsp1025ProLeu1040SerThr1055TrpPro1070AsnThr1085TrpMet1100SerSerValTrpGlyGlyLeuArgArgLeulieAspCyslieGluGluSerPheProSerProAspTyrAsmAsnProArgSer1000TyrLeu1015Asp1030Asm1045Lys1060Val1075Tyr1090Ala1105AspAlaLeuProProAlaAspLeuGlyLeuProLeuTyrGlyLeuThrAsnAspLysLeuAlaSerProMetArgSerMet1005AlaSer1020Glu1035Arg1050Ser1065Ala1080Val1095Asp1110GluAlaAspAspTyrThrThrProGluThrLeuProProAsnGlyThrAlaAsnPheAsp权利要求1.一种体外确定样品中是否存在RET基因、转录本、和/或蛋白变异的方法，其特征在于，所述的方法包括检测样品中RET基因、转录本、和/或蛋白，并与正常的RET基因、转录本、和/或蛋白相比较，存在选自下组的一个或多个变异形式就表明该样品存在RET基因、转录本、和/或蛋白变异RET基因外显子11，第634位氨基酸C→W，或其密码子TGC→TGG；RET基因外显子11，第634位氨基酸C→Y，或其密码子TGC→TAC；RET基因外显子11，第634位氨基酸C→R，或其密码子TGC→CGC；RET基因外显子11，第634位氨基酸C→F，或其密码子TGC→TTC；RET基因外显子11，第634位氨基酸C→S，或其密码子TGC→TCC；或RET基因外显子16，第918位氨基酸M→T，或其密码子ATG→ACG；其中，氨基酸位置编号基于GenBank登录号NP_066124。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，检测的是RET基因的核苷酸序列，并与正常RET基因的核苷酸序列比较差异。3.—种体外确定核酸样品中是否存在RET基因变异的试剂盒，其特征在于，它包括(i)特异性扩增RET基因外显子11的引物，所述的引物扩增出的扩增产物含有对应于RET基因外显子ll，第634位氨基酸的密码子；以及(ii)特异性扩增RET基因外显子16的引物，所述的引物扩增出的扩增产物含有对应于RET基因外显子16，第918位氨基酸的密码子。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括针对RET基因外显子ll、第634位氨基酸密码子，和针对RET基因外显子16、第918位氨基酸密码子的单碱基延伸反应的引物。5.—种RET多核苷酸的用途，其中所述的RET多核苷酸的第634位和/或第918位的密码子不同于野生型RET基因，其特征在于，用于制备检测多发性内分泌腺瘤2型的试剂盒。6.—种获得RET基因扩增产物的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)以DNA样品为模板，PCR扩增RET基因序列，获得第一扩增产物；和(2)以步骤(l)获得的第一扩增产物为模板，进行单碱基延伸反应，获得第二扩增产物。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(l)中，采用以下引物对进行PCR扩增SEQIDNO:l和SEQIDNO:2所示的引物对，和SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物对。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，采用以下引物进行单碱基延伸反应SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(l)中，还包括采用虾碱酶SAP和外切酶ExonI来纯化所述的第一扩增产物。10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，还包括采用虫下碱酶SAP来纯化所述的第二扩增产物。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
，公开了一种体外确定核酸样品中是否存在RET基因变异的方法。本发明还公开了一种确定RET基因变异的试剂盒。本发明还公开了一种获得RET基因扩增产物的方法。本发明所述方法精确、简便、快速、稳定。文档编号C12Q1/68GK101148684SQ20061011639公开日2008年3月26日申请日期2006年9月22日优先权日2006年9月22日发明者周瑜琳,光宁,斌崔,王卫庆,赵咏桔申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院