专利名称：利用酵母细胞不对称合成d－(－)－扁桃酸系列化合物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及(D)-(-)-扁桃酸系列化合物的生物不对称合成。
背景技术：
扁桃酸(Mandelic acid)又称α-羟基苯乙酸，α位碳原子具有手性特性。按照Prelog规则，(D)-(-)-扁桃酸也被称为(R)-(-)-扁桃酸。扁桃酸系列化合物为重要的药物中间体，用于合成常用药物，如血管扩张药环扁桃酯(Cyclandelate)、消炎药物扁桃酸乌洛托品、镇痉药物扁桃酸苄酯、尿失禁的治疗药物奥昔布宁(Oxybutynin)等。国内外市场上奥昔布宁、环扁桃酯等药物目前均为消旋对映体混合物。
目前国内外主要采用化学方法合成扁桃酸，产物为外消旋体。单一构型的扁桃酸是通过化学拆分方法制备的。扁桃酸系列衍生物的化学拆分多采用奎宁、(+)-苯异丙或(L)-酪氨酸甲酯为拆分剂。这些拆分剂价格较昂贵，而且拆分过程选择性不高，需要多次重复操作才可得到较纯的单一对映体，生产成本较高。
手性化合物的生产过程中，生物转化是最具竞争力的手段之一。与化学方法相比，生物催化具有高效、专一、条件温和等显著的优点。国外从20世纪80年代开始研究扁桃酸的生物合成技术。生物合成包括酶催化和细胞催化两种技术路线。
1983年，日本采用葡聚糖明串珠菌(Leuconostoc dextranium)完整细胞进行苯乙酮酸钠的生物不对称还原，产物为(D)-(-)-扁桃酸。
1983年，英国Hills C A等人发现可以(L)-(+)-扁桃酸为唯一碳源和能源的乙酸钙不动杆菌(Actinetobacter calcoceticus)，培养出可生产L型和D型扁桃酸脱氢酶的突变株EBF65/65，并对两种酶进行鉴定和基本特性的研究。
1986年，日本的Yamazaki Yoshimitsu等人从粪链球菌(Streptococcusfaecalis)中提取到的苯甲酰甲酸盐还原酶，用于光学纯(D)-(-)-扁桃酸和其他2-羟基羧酸的酶合成。同年，Yamazaki采用超滤膜反应器利用上述的酶实现(D)-(-)-扁桃酸的连续制备。
1989年，德国采用从弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus curvatus)中提取到的(D)-(-)-扁桃酸脱氢酶，将苯乙酮酸还原成(D)-(-)-扁桃酸。
1992年，英国的Basak等人对于从酵母菌(Rhodotorula graminis)中获得的D型和L型扁桃酸脱氢酶进行结构研究，测定了D型脱氢酶的3D结构。
1993年，英国爱丁堡大学化学系的Stephen确定了D型和L型扁桃酸脱氢酶的结构，并进行克隆，在E.coli中表达，发现该酶与乳酸脱氢酶、甲酸盐脱氢酶的基因序列极度相似，并重组该酶，进行重组酶特性研究。
本发明所涉及的(D)-(-)-扁桃酸系列化合物指化合物(2)，α位上的醇基具有(D)-(-)光学特性，取代基R1-6可为H、烷基或其他取代基。化合物(2)中的R1-6均为H时，即是扁桃酸；化合物(2)中的R1-5均为H，R6为CH3时，即是扁桃酸甲酯。
本发明所涉及的苯乙酮酸系列化合物指化合物(1)。它是含有α-酮基的羧酸(或酯)的潜手性化合物。化合物(1)中的R1-6可为H、烷基或其他取代基。生物催化合成过程的作用位点是潜手性化合物的α-酮基。α-酮基被还原后，生成手性醇酸(或酯)化合物。
酶具有复杂的三维立体结构，生物转化过程具有很高的选择性(包括光学选择性)。采用合适的氧化还原酶可实现目标反应。游离的氧化还原酶的催化过程需消耗辅酶NADH。辅酶NADH价格昂贵。由于NADH尚未能实现大规模生产的催化循环，酶催化技术路线存在制约因素。
采用细胞转化技术路线，要成功地实现(D)-(-)-扁桃酸系列化合物的生物合成，其必要前提是筛选出具有对α位酮基高度光学选择性催化还原酶的微生物菌株；其充分条件是控制合适的工艺条件，使微生物体内的氧化还原酶充分表达活性，同时利用活细胞体内代谢系统，使NADH→NAD循环畅通。目前尚无采用生物转化技术大规模生产单一对映体扁桃酸的报道。
(L)-(+)和(D)-(-)扁桃酸及其他扁桃酸系列化合物可用高效液相色谱仪(HPLC)或毛细管电泳仪(CE)进行拆分，并进行定量分析。
发明内容
本发明的目的是应用酵母细胞来制备具有单一旋光性质的(D)-(-)-扁桃酸系列化合物。为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下(1)菌种的筛选与驯化从不同种类的酵母属酵母菌中筛选对苯甲酰甲酸系列化合物中的酮基具有高度光学选择性氧化还原酶的面包酵母菌株FD1(为Saccharomyces cerevisiae，又称酿酒酵母)。以FD1为出发菌株，经紫外诱变和高浓度底物驯化，进一步筛选得到(D)-(-)-扁桃酸产率高的菌株FD101，进行保存。
(2)种子培养取保存菌种，接种于含有葡萄糖、蛋白胨和无机盐的种子培养基中，28-35℃，300rpm摇瓶培养，培养8-12h后，作为种子液备用。
(3)游离酵母细胞的生物转化将种子液接种于含有葡萄糖或蔗糖、以及其它无机盐的生产培养基中，接种量5-20％，28-35℃，好氧培养。接种后5-20h，加入潜手性化合物苯甲酰甲酸系列化合物，使终浓度达10-150mmol/L。在恒定温度(28-35℃)、恒定pH(5.0-7.5)和厌氧条件下进行游离酵母细胞的生物还原反应。48-72h后，潜手性底物的转化率达90％以上、产物扁桃酸中(D)-(-)-扁桃酸达95％以上。
(4)固定化酵母细胞的生物转化取保存菌种，接种于种子培养基中，扩培后，离心得菌泥。采用海藻酸钠法制备固定化酵母细胞颗粒。
将所制备的固定化细胞颗粒填充于柱形反应器或槽式反应器中。用泵连续进料，将反应物(生产培养基+苯甲酰甲酸系列化合物10-150mmol/L)连续泵入反应器，在厌氧条件下实现手性扁桃酸系列化合物的连续生物转化。水力停留时间为24-72h时，潜手性底物的转化率达90％以上、产物扁桃酸中(D)-(-)-扁桃酸达95％以上。
采用本项技术，以游离酵母细胞或固定化酵母细胞一步生物转化制备(D)-(-)-扁桃酸，潜手性底物的转化率可达90％以上，副产物少，目标产物(D)-(-)-扁桃酸占总扁桃酸的95％以上，可简化后续的拆分分离步骤。
具体实施例方式
实施例1酵母细胞的筛选配制种子培养基，灭菌后备用。
种子培养基组成(g/L)蛋白胨5，葡萄糖30，K2HPO41，MgSO4·7H2O0.5，KCl 0.5，Fe2(SO4)30.01，自然pH。
配制生产培养基，灭菌后备用。
生产培养基组成(g/L)葡萄糖或蔗糖30，(NH4)2SO45，K2HPO42，CaCO31，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，Fe2(SO4)30.01，ZnSO40.01。
将斜面培养基上的各种酵母菌种分别转接到种子培养基中，30℃培养8h的培养物作为种子液。取2ml种子液接种到25ml的生产培养基中(50ml的锥形瓶)，培养10h后加入底物(分别为苯乙酮酸或苯乙酮酸乙酯)，使底物终浓度为10mmol/L，30℃厌氧振荡培养。反应结束后取出培养液，离心(10000rpm，10min)，取上清液进行高效液相色谱分析，测定产物浓度。
表1 酵母筛选实验结果序号扁桃酸甲酯得率(％)扁桃酸得率(％)旋光性FD180.93 70.13 左旋FD234.55 3.33 左旋FD369.47 30.30 左旋FD445.27 3.36 左旋FD536.41 28.23 左旋FD621.57 19.95 右旋FD73.51 10.95 左旋FD867.90 42.34 左旋FD973.25 44.86 左旋FD1021.87 29.91 左旋FD1133.27 22.80 左旋FD1244.69 18.80 左旋FD132.23 3.42 左旋对菌株FD1进行进一步的紫外诱变和高浓度底物的驯化，经筛选得到4株耐较高浓度底物的菌株。其中FD101菌株生物还原速度快，产物得率最高，D构型产物含量也最高。
表2四种酵母还原苯乙酮酸的实验结果D构型产物菌种 培养时间(h) 产物得率(％)含量(％)FD10148 90.8397.75FD10248 29.0595.07FD10348 49.7794.07FD10448 57.4992.63表3四种酵母还原苯乙酮酸乙酯的结果D构型产物菌种 培养时间(h)产物得率(％)含量(％)FD10148 92.11 95.60FD10248 83.02 93.52FD10348 82.82 91.64FD10448 87.32 94.45实施例2游离酵母细胞在全混批式反应器系统中制备(D)-(-)-扁桃酸按实施例1方法配制种子培养基和生产培养基。取甘油管保存菌种FD101，接种于种子培养基中，培养10小时，OD值达2.0以上，作为种子液，5℃保存使用。
将种子液20ml接种于生产培养基(100ml)中，好氧条件下，30℃培养。通过流加2mol/L NaOH维持pH恒定(pH6.5)。培养8h后，细胞浓度OD值达到2.5以上，加入潜手性底物苯甲酰甲酸，终浓度为10mmol/L。继续厌氧培养40h后，全混批式反应系统中底物苯甲酰甲酸浓度下降至0.2mmol/L以下，底物转化率大于98％。毛细管电泳分析表明，目标产物(D)-(-)-扁桃酸含量95.0％，(L)-(+)-扁桃酸含量5.0％。未观察到明显的其他副产物。
实施例3游离酵母细胞在全混批式反应器系统中制备(D)-(-)-扁桃酸乙酯按实施例1方法配制种子培养基和生产培养基。制备FD101的种子培养液。
将培养的种子液按10％(v/v)接种于生产培养基中。摇瓶培养8h，酵母大量繁殖，OD达2.5。加入溶于乙醇的苯甲酰甲酸乙酯溶液，苯甲酰甲酸乙酯终浓度为10mmol/L。厌氧条件下，恒pH(6.5)，恒温(32℃)培养。培养50h后，培养液中底物(苯甲酰甲酸乙酯)浓度下降至0.95mmol/L。产物扁桃酸乙酯中(D)-(-)-扁桃酸乙酯含量达90％以上，(L)-(+)-扁桃酸乙酯含量小于10％。反应过程中约10％的扁桃酸乙酯水解成为扁桃酸。
实施例4固定化酵母细胞在连续搅拌釜式反应器(CSTR反应器)中制备(D)-(-)-扁桃酸按实施例2的方法，将FD101菌种接于种子培养基中，32℃培养10小时，离心得酵母菌泥。称取湿菌体50克，加入到50ml浓度为40g/L，40℃的海藻酸钠水溶液中，迅速混匀。用针筒逐滴注入到浓度为5％的氯化钙溶液中，得到粒径1-2mm的颗粒，在5-10℃温度条件下固化24h，备用。
采用CSTR反应器，装液量300ml，底物(生产培养基加苯甲酰甲酸20mmol/L)连续恒量加入，物料水力停留时间48h，反应温度32℃，pH6.5，底物转化率达90％以上，(D)-(-)-扁桃酸含量占总扁桃酸95％以上。连续运行25天，未观察到细胞活性衰退现象。
实施例5固定化酵母细胞在填充床式反应器系统中制备(D)-(-)-扁桃酸乙酯按实施例4方法制备固定化酵母细胞颗粒。填充床反应器Φ34×1100mm，底部装有进料分布装置，固定化细胞颗粒装填高度800mm。反应物料(生产培养基+苯甲酰甲酸乙酯30mmol/L)从底部流入，从顶部流出。pH6.5，32℃，底物停留时间48h的条件下，底物转化率大于90％以上，目标产物(D)-(-)-扁桃酸乙酯含量占总扁桃酸乙酯95％以上。反应过程中约10％的扁桃酸乙酯水解成为扁桃酸。连续20天运行，未观察到细胞活性衰退现象。
权利要求
1.利用酵母细胞不对称合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，包括菌种的筛选与驯化、种子培养、生物转化等几个步骤，其特征在于(1)采用苯乙酮酸系列化合物为底物；(2)采用酵母菌为生物转化菌种，该酵母菌可为游离细胞或固定化细胞；(3)游离酵母细胞的生物转化过程中，菌体生长阶段需好氧培养；加入苯乙酮酸系列化合物后，生物还原反应要求在厌氧条件下进行；(4)固定化酵母细胞的生物转化过程在厌氧条件下进行。
2.如权利要求1所述的利用酵母细胞不对称合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的苯乙酮酸系列化合物的通式为 其中R1-6可为H、烷基或其他取代基。
3.如权利要求2所述的利用酵母细胞不对称合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的苯乙酮酸系列化合物为苯乙酮酸。
4.如权利要求2所述的利用酵母细胞不对称合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的苯乙酮酸系列化合物为苯乙酮酸甲酯。
5.如权利要求2所述的利用酵母细胞不对称合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的苯乙酮酸系列化合物为苯乙酮酸乙酯。
6.如权利要求1所述的利用酵母细胞不对称合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的酵母细胞为酵母属酵母菌。
7.如权利要求6所述的利用酵母细胞不对称合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的酵母属酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，也称为面包酵母。
8.如权利要求7所述的利用酵母细胞不对称合成(D)-(-)-扁桃酸系列化合物，其特征在于所述的酵母菌为FD101。
全文摘要
利用酵母细胞不对称合成D－(－)－扁桃酸系列化合物，涉及D－(－)－扁桃酸系列化合物的生物不对称合成。本发明筛选出具有对α位酮基高度光学选择性催化还原酶的面包酵母菌株FD
文档编号C12P7/42GK1580270SQ03144058
公开日2005年2月16日 申请日期2003年7月30日 优先权日2003年7月30日
发明者郭养浩, 孟春, 石贤爱 申请人:福州大学