用担子菌菌丝体和酵母细胞对经预处理的含木素纤维素材料酶水解的改进的制作方法

专利名称：：用担子菌菌丝体和酵母细胞对经预处理的含木素纤维素材料酶水解的改进的制作方法
技术领域：
：公开了用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，更具体而言，公开了通过用担子菌菌丝体和/或酵母细胞处理含木素纤维素材料来增加从该材料产生发酵产物的效率的方法。
背景技术：
：含木素纤维素材料，或称生物质，可用于产生可发酵的糖类，其可接着用于产生发酵产物如可再生的(renewable)燃料和化学品。含木素纤维素材料具有纤维素纤维包埋于木质素和半纤维素鞘中的复杂结构。从含木素纤维素材料产生发酵产物包括预处理、水解并发酵所述含木素纤维素材料。将含木素纤维素材料转化为可再生的燃料和化学品常常涉及对生物质的物理、生物、化学和/或酶(使用酶)处理。具体而言，酶将纤维素水解为D-葡萄糖，其为简单的可发酵的糖。在含木素纤维素材料中，需要高剂量的酶以降解纤维素以获得高产率，因为认为木质素和木质素衍生物抑制酶对纤维素的水解。上述抑制可至少以两种方式进行木质素或木质素衍生物优先结合所述酶，从而阻止该酶与纤维素结合或水解纤维素，和/或木质素或木质素衍生物覆盖纤维素的一部分，从而减少酶与纤维素的接近。结果，当加工含木质素的生物质时，能用来降解纤维素的酶可能较少，因为木质素及其衍生物可清除所述酶或减少其活性。即使对于能用来降解纤维素的酶，可用的酶也可能无法与纤维素接触，因为木质素可覆盖纤维素。因此，降低了消化纤维素的工艺的有效性。此外，酶代价不菲。因此，当降解纤维素所需的酶量较高时，加工成本高昂，在经济上不可取。获得令人满意的糖产率所需的酶量的减少可对工艺经济有显著的影响。因此，改进酶使用效率是生物转化工艺中的主要需求。认为数种因素影响纤维素的酶水解。这些因素包括木质素含量、半纤维素含量、乙酰基含量、纤维素的表面积和纤维素结晶性。通常应理解的是，存在于复杂底物中的木质素对酶水解具有不利作用。尚难确定木质素和木质素衍生物在限制水解中的准确作用。然而，已知去除木质素及其衍生物的作用增加纤维素的水解并增加可发酵的糖的产率。该作用可能打开了更多纤维素表面积以供酶攻击，且可能减少非特异性吸附于木素纤维素底物上的酶量。或者，可使用化合物去除木质素及其衍生物的作用从而使得纤维素更易受酶降解。
发明内容公开了在经处理的担子菌菌丝体和/或酵母细胞存在下通过预处理和/或水解含木素纤维素材料来从该材料产生发酵产物的方法。还公开了用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括预处理所述含木素纤维素材料；将经处理的担子菌菌丝体和/或酵母细胞引入经预处理的含木素纤维素材料；将所述经预处理的含木素纤维素材料暴露于有效量的水解酶；和用发酵生物发酵以产生发酵产物。在一个方面，所述经处理的担子菌菌丝体和/或酵母细胞可在将所述含木素纤维素材料暴露于有效量的水解酶之前引入该含木素纤维素材料。经处理的酵母细胞可以以约8%w/w酵母细胞/含木素纤维素材料的量引入经预处理的含木素纤维素材料。附图简述图1.经处理的酵母细胞对PCS酶水解的作用。具体实施例方式公开了改进的并更有效的通过使用经处理的担子菌菌丝体和/或酵母细胞酶水解含木质素的生物质的方法。木质素是可通过松柏醇和/或芥子醇的脱氢聚合衍生的酚聚合物，并见于多种植物的细胞壁中。如本文中使用的术语“木质素”指木质素聚合物的完整结构以及由木质素结构破坏得到的所述完整聚合物的任何衍生片段或化合物，包括可溶性木质素衍生物、缩合(condensed)木质素和不可溶性沉淀木质素。认为木质素和/或木质素衍生物与经处理的担子菌菌丝体和/或酵母细胞以多种方式相互作用。例如，例如，不可溶性沉淀木质素和缩合木质素可具有从水溶液吸附经处理的担子菌菌丝体和酵母细胞的能力，而与之相对，可溶性木质素衍生物可由经处理的担子菌菌丝体和酵母细胞吸附。如本文中使用的术语“生物质浆料”指发生酶水解的水性生物质材料。生物质浆料通过将生物质例如玉米秸秆、甘蔗渣等与水、缓冲液和其他预处理材料混合产生。在水解之前可预处理生物质。如本文中使用的术语“木质素阻断(ligninblocking)”意指在将生物质转化为发酵产物的工艺中减少或消除木质素的有害作用。此外，如本文中使用的术语“有效的木质素阻断量”意指任何可用于促进木质素阻断的量。在一个实施方案中，本方法利用了经处理的担子菌菌丝体。不拘于任何具体理论，经处理的担子菌菌丝体可优先地比纤维素更易结合木质素。可用经处理的担子菌菌丝体处理含木质素的生物质浆料，例如通过将经处理的担子菌菌丝体直接引入经预处理的生物质浆料。猜测经处理的担子菌菌丝体优先与木质素在经预处理的浆料中结合，从而覆盖了沉淀于纤维素表面的木质素，因此阻碍沉淀的木质素与水解酶的结合。还猜测经处理的担子菌菌丝体也许能够吸附未沉淀于纤维素表面的木质素，使得纤维素水解酶能够更有效地水解纤维素。如果不用经处理的担子菌菌丝体处理含木质素的生物质浆料，木质素可结合纤维素水解酶一部分使其无法水解纤维素，或可覆盖纤维素一部分，使其无法被水解酶接近。在另一个实施方案中，本方法利用了经处理的酵母细胞。不拘于任何具体理论，经处理的酵母细胞可优先地比纤维素更易结合木质素。可用酵母细胞处理含木质素的生物质浆料，例如通过将经处理的酵母细胞直接引入经预处理的生物质浆料。猜测经处理的酵母细胞优先与木质素在经预处理的浆料中结合，从而覆盖了沉淀于纤维素表面的木质素，因此阻碍沉淀的木质素与水解酶的结合。还猜测经处理的酵母细胞也许能够吸附未沉淀于纤维素表面的木质素，使得纤维素水解酶能够更有效地水解纤维素。如果不用经处理的酵母细胞处理含木质素的生物质浆料，木质素可结合纤维素水解酶一部分使其无法水解纤维素，或可覆盖纤维素一部分，使其无法被水解酶接近。不拘于任何具体理论，认为木质素以多种方式作用以抑制酶对生物质中纤维素的水解。木质素限制纤维素分解酶和半纤维素分解酶可将纤维素转化为单糖的程度。许多研究活动的焦点在于理解细胞壁中木质素的特性，并开发将其有效去除的预处理工艺。对木质素抑制酶活性模式的理解能够减少传统上由生物质中木质素成分导致的有害作用。如下详述，可在水解含木素纤维素材料或生物素之前对其进行预处理。例如，预处理可为蒸汽预处理、碱性预处理、酸性预处理或其某种组合的形式。蒸汽预处理物理地打开生物质的结构，即至少部分地打断连接木质素、纤维素和半纤维素的键。碱性预处理通常包括用碱性物质如氨处理生物质。碱性预处理化学地改变生物质。对于生物质的木质素成分，认为碱性预处理至少部分地降解木质素，产生木质素衍生物和小的酚类片段，其可不利地影响酶的性能以及酵母的生长和发酵能力。酸性预处理也化学地改变生物质的木质素成分，生成包括缩合木质素的木质素衍生物，其沉淀于纤维素纤维表面。所述缩合木质素可通过覆盖纤维素纤维的表面抑制酶接触纤维素。其他在酸性预处理过程中生成的木质素衍生物包括可抑制酶功能的小的含酚片段和化合物。还认为用经处理的担子菌菌丝体和/或酵母细胞处理生物质浆料至少部分是通过结合木质素，因而减少和/或抑制木质素对纤维素水解酶的非生产性吸附而起作用的。因此，用经处理的担子菌菌丝体和/或酵母细胞处理生物质浆料通过抑制木质素结合酶来改进对含木质素底物的加工，使得对酶水解的改进成为可能。经处理的担子菌菌丝体和酵母细胞可减少酶加载和/或提高其性能，因为所述酶可能不会受木质素的不利影响，因此仍可用其更有效地水解生物质底物。本方法在含木质素的生物质浆料的水解中减少酶加载。通过用经处理的担子菌菌丝体和/或酵母细胞处理生物质浆料显著减少了进行水解所需的酶量。减少酶加载减少了生物质转化工艺的总成本。根据一个实施方案，所述方法使用经处理的担子菌菌丝体增强了纤维素的酶水解。该方法包括用担子菌菌丝体处理含木质素的生物质浆料以获得具有受阻断的木质素组分的经处理的生物质浆料，并将经处理的生物质浆料暴露于有效量的水解酶的步骤。所述担子菌菌丝体可在预处理过程中或之后，或水解之前或过程中直接添加于所述生物质浆料。优选在添加纤维素水解酶和发酵生物之前将所述担子菌菌丝体添加至生物质浆料。根据另一个实施方案，所述方法使用经处理的酵母细胞增强了纤维素的酶水解。该方法包括用经处理的酵母细胞处理含木质素的生物质浆料以获得具有受阻断的木质素组分的经处理的生物质浆料，并将经处理的生物质浆料暴露于有效量的水解酶的步骤。所述经处理的酵母细胞可在预处理过程中或之后，或水解之前或过程中直接添加于所述生物质浆料。优选在添加纤维素水解酶和发酵生物之前将所述经处理的酵母细胞添加至生物质浆料。担子菌菌丝体担子菌是真菌界内构成“高等真菌(HigherFungi)”的两个大的门之一。担子菌包括蘑菇、马勃(puffball)、鬼笔(StinWiorn)、弧状菌(bracketfungus)、其他多孔菌(polypore)、胶状真菌(jellyfungus)、牛肝菌(bolete)、鸡油菌(chanterelle)、地星(earthstar)、黑粉菌(smut)、腥黑粉菌(bunt)、锈菌(rust)、镜像酵母(mirroryeast)和人病原性酵母隐球菌(Cryptococcus)。一般而言，担子菌是包含菌丝(除了那些构成酵母的)并通过形成特化的称为担子(basidia)的棒状末端细胞而有性繁殖的丝状真菌，所述担子通常携带外孢子(externalspore)，其为特化的减数孢子，称为担孢子(basidiospore)0菌丝体(单数mycelium，复数mycelia)是真菌的营养部分，由大量分支的线样菌丝组成。由菌丝体组成的真菌菌落见于土壤中以及许多其他基质之上或之中。通常单一孢子萌发为单倍体核的菌丝体，其无法有性繁殖；当两个相容的单倍体核菌丝体接合并形成二倍体核的菌丝体时，该菌丝体可形成子实体如蘑菇。菌丝体可为微小的，形成小到不可见的菌落，或其可为庞大的。真菌是通过菌丝体从环境吸收养分的。菌丝体对于陆生和水生生态系统是至关重要的，因为其在植物物质腐败中起的作用。其对土壤中的有机部分作出了贡献，且其生长将二氧化碳释放回大气。菌根真菌的菌丝体增加了大部分植物的水和养分吸收效率，并赋予其对一些植物病原体的抗性。菌丝体对于许多土壤中的无脊椎动物而言是重要的食物来源。用于本发明的担子菌菌丝体可包含来自发酵工艺的废物。更具体而言，其可包含来自发酵工艺的纤维素废物、半纤维素废物和木质素修饰酶废物或其某种组合。可使用的担子菌菌丝体的实例包括但不仅限于白腐或褐腐真菌。使用发酵废物改进酶水解在经济上是有益的。其增加了发酵产物的产量，并在同时循环并重新利用了来自发酵工艺的本应舍弃的自然废物。担子菌菌丝体本身也可从发酵工艺回收并再次用于改进酶水解。涵盖了担子菌菌丝体可在引入生物质浆料之前经处理或加工以在其引入生物质浆料之前杀灭活细胞。如果未杀灭活细胞，其可能消耗来自水解工艺的简单糖类从而减少发酵可用的糖量。处理或加工可包括酶方法、热方法、机械方法、化学方法或方法的组合。可在将担子菌菌丝体引入生物质浆料之前对其进行高压灭菌。例如，所述担子菌菌丝体可在121°C高压灭菌20分钟。涵盖了首先用经处理的担子菌菌丝体处理生物质浆料，然后添加纤维素水解酶使得纤维素转化具有最高的效率。用经处理的担子菌菌丝体处理生物质浆料还可与将纤维素水解酶添加至生物质浆料同时进行。不拘于任何具体理论，认为经处理的担子菌菌丝体对木质素的非特异性结合减少了酶对木质素表面的非生产性结合或由于与木质素的相互作用对酶活性的抑制。因此，在用于木素纤维素转化的工艺中使用经处理的担子菌菌丝体有利促进取得相同的目标转化百分数的酶加载水平下降。酵母细胞酵母是归类于真菌界的真核微生物的生长型。酵母通常是单细胞的，尽管一些酵母菌种，如见于大部分霉菌，可通过形成一串连接的出芽细胞(称为假菌丝(pseudohypha)或假的菌丝(falsehypha))而变为多细胞的。酵母的大小可取决于菌种有很大变化，通常直径为3-4μm,虽然一些酵母可超过40μm。酵母菌种酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)已在烘烤和酒精饮料发酵中使用了数千年。其在现代细胞生物学研究中还是极端重要的模式生物，并为研究得最为彻底的真核微生物。其他酵母物种如白色假丝酵母(Candidaalbicans)为机会致病菌，且可在人类中造成感染。酵母最近被用于在微生物燃料电池中发电，并在用于生物燃料工业的发酵工艺中从糖产生乙醇。酵母并不构成特定的分类学或系统发生的分组。术语“酵母”常常认为是酿酒酵母的同义词，但是酵母被置于子囊菌和担子菌两个分类(division)显示了其系统发生多样性。出芽酵母归类于酵母菌目(Saccharomycetales)。用于本发明的酵母细胞可包含来自发酵工艺的废酵母细胞。使用废酵母细胞改进酶水解在经济上是有益的。其增加了发酵产物的产量，并在同时循环并重新利用了来自发酵工艺的本应舍弃的自然废物。涵盖了酵母细胞可多次从发酵工艺回收并用于改进酶水解。涵盖了酵母细胞可在引入生物质浆料之前经处理或加工以在其引入生物质浆料之前杀灭活细胞。如果未杀灭活细胞，其可能消耗来自水解工艺的简单糖类从而减少发酵可用的糖量。处理或加工可包括酶方法、热方法、机械方法、化学方法或方法的组合。可在将酵母细胞引入生物质浆料之前对其进行高压灭菌。例如，所述酵母细胞可在121°C高压灭菌15分钟。涵盖了首先用经处理的酵母细胞处理生物质浆料，然后添加纤维素水解酶使得纤维素转化具有最高的效率。用经处理的酵母细胞处理生物质浆料还可与将纤维素水解酶添加至生物质浆料同时进行。用经处理的酵母细胞处理生物质浆料产生从纤维素的水解产率可测量为最终糖产率或纤维素转化率提高的百分数。试举一例，与来自未用经处理的酵母细胞处理的生物质浆料的纤维素的水解产率相比，可于最终的糖产率方面得到大约16%的提高。此外，再举一例，与来自未用经处理的酵母细胞处理的生物质浆料的纤维素的水解产率相比，可于纤维素转化率方面得到大约25%的提高。不拘于任何具体理论，认为经处理的酵母细胞对木质素的非特异性结合减少了酶对木质素表面的非生产性结合或由于与木质素的相互作用对酶活性的抑制。因此，在用于木素纤维素转化的工艺中使用经处理的酵母细胞促使取得相同的目标转化百分数的酶加载水平下降。含木素乡千纟佳素材料“木素纤维素”或“含木素纤维素材料”意指主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的材料。上述材料常常被称作“生物质”。生物质具有纤维素纤维包埋于木质素和半纤维素鞘中的复杂结构。生物质的结构使其不易受酶水解。为了增强酶水解，必须预处理生物质，例如通过在足够的压力和温度条件下进行酸水解以打破木质素的密封，糖化并溶解半纤维素，并破坏纤维素的晶体结构。然后可将纤维素用酶水解，例如通过纤维素分解酶水解，来将糖聚合物转化为可发酵为所需发酵产物如乙醇的可发酵的糖类。还可使用半纤维素分解酶处理来水解经预处理的生物质中任何残留的半纤维素。生物质可为任何含有木素纤维素的材料。在一个优选实施方案中，生物质含有至少约30wt.%，优选至少约50wt.%，更优选至少约70wt.%，甚至更优选至少约90wt.%木素纤维素。应理解的是，所述生物质还可包含其他成分如蛋白质材料、淀粉和糖类如可发酵或不可发酵的糖类，或其混合物。生物质通常见于例如植物的茎、叶、壳/荚011111)、壳/皮/荚/苞(husk)和穗轴或树的叶、枝和木质(wood)。生物质包括但不仅限于草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆及造纸厂残余物。应理解的是，生物质可为在混合的基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。其他合适的生物质的实例包括玉米纤维、稻秆、松木、刨花、甘蔗渣、纸和纸浆加工废物、玉米秸秆、玉米穗轴、硬木如杨木和桦木、软木、谷物秸秆如麦秆、稻秆、柳枝稷、芒属(Miscanthus)、稻壳、城市固体废物(MSW)、工业有机废物、办公室用纸或其混合物。在一个优选实施方案中，所述生物质选自玉米秸秆、玉米穗轴、玉米纤维、麦秆、稻秆、柳枝稷和甘蔗渣中的一种或多种。预处理所述生物质可用任何合适的方式进行预处理。根据本发明，预处理可包括将担子菌菌丝体和/或酵母引入所述生物质。预处理在水解或发酵之前进行。预处理的目标是分离或释放纤维素、半纤维素和木质素，从而改进水解速率或效力。预处理方法(包括湿法氧化和碱性预处理)靶向木质素释放，而稀酸处理和自水解(auto-hydrolysis)靶向半纤维素释放。蒸汽爆炸是靶向纤维素释放的预处理方法。预处理步骤可包括其中将担子菌菌丝体和/或酵母细胞添加至生物质的步骤。如前所示，当添加担子菌菌丝体和/或酵母细胞时，生物质通常为生物质浆料的形式。如果担子菌菌丝体和/或酵母细胞是在预处理过程中添加至生物质浆料的，预处理工艺的其余部分仍和常规一致。然而，或者可将担子菌菌丝体和/或酵母细胞在水解步骤中添加，从而使得预处理步骤为使用本领域众所周知的技术的常规预处理步骤。酵母细胞可以以约8%w/w酵母细胞/含木素纤维素材料的量添加。在预处理过程中生物质可以以约10-80wt.%的量，优选约20-70wt.%的量，特别是约30-60wt.%的量存在，如约50wt.%的量。化学、机械和/或生物预处理在水解之前或过程中，所述生物质可经化学、机械、生物预处理，或其任意组合。优选所述化学、机械或生物预处理是在水解之前实施的。或者，所述化学、机械或生物预处理可与水解同时实施，如与添加一种或多种纤维素分解酶或其他酶活性同时，以释放例如可发酵的糖类如葡萄糖或麦芽糖。在一个实施方案中，经预处理的生物质可以以另一种方式洗涤或解毒。然而，洗涤或解毒并非必需的。在一个优选实施方案中，经预处理的生物质未经洗涤或解毒。化学预处理短语“化学预处理”指促进纤维素、半纤维素或木质素的分离或释放的任何化学预处理。合适的化学预处理方法的实例包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫或二氧化碳进行处理。此外，湿法氧化和控制PH的水热解(hydrothermolysis)亦视为化学预处理。在一个优选实施方案中，所述化学预处理为酸处理，更优选，为连续的稀酸或弱酸(mildacid)处理，例如，用硫酸，或用其他有机酸，如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或其混合物处理。也可使用其他酸。弱酸处理意为处理的PH在约pH1-5，优选在约pH1-3的范围内。在一个具体实施方案中，所述酸浓度在0.1到2.酸的范围内，并优选为硫酸。该酸可与所述生物质相接触，且混合物可保持在约160-220°C，如约165-195°C范围内的温度，处理时间为数分钟到数秒，例如，1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可运用强酸(如硫酸)的加入来移除半纤维素。强酸的添加增强了纤维素的可消化性。根据本发明亦涵盖其他化学预处理技术。已经显示纤维素溶剂处理将约90%的纤维素转化为葡萄糖。也显示了当木素纤维素结构被破坏时，极大增强了酶水解。碱、h202、臭氧、有机溶剂(使用含水醇中的路易斯酸，I^eCl3,(Al)2SO4)、甘油、二礎、烷、酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等，2005，BioresourceTechnology96673-686)。本发明也涵盖了使用碱，例如NaOH，Na2CO3和氨等的碱性化学预处理。使用氨的预处理方法描述于例如WO2006/110891、W02006/11899、W02006/11900、W02006/110901，其通过提述并入本文。湿氧化技术涉及使用氧化剂，如，基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的实例包括用DMSO(二甲亚砜)等的处理。化学预处理通常进行1到60分钟，如5到30分钟，但可依赖于待进行预处理的材料进行较短或较长的时间。其他合适的预处理方法的实例描述于khell等，2003，Appl.BiochemandBiotechn.105-108卷69-85禾口Mosier等，2005，BioresourceTechnology96:673—686，以及美国申请公开2002/0164730号，其每一个均通过提述并入本文。机械预处理短语“机械预处理”指任何机械的或物理的预处理，其促进自生物质分离或释放纤维素、半纤维素或木质素。举例而言，机械预处理包括多种类型的磨制、照射、汽蒸/蒸汽爆炸(steamexplosion)，以及水热解。机械预处理包括粉碎，即机械减小大小。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨(vibratoryballmilling)。机械预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。“高压”意指压力在约300到600psi，优选400到500psi，例如约450psi的范围内。高温意指温度在约100到300°C，优选约140到235°C的范围内。在一个优选实施方案中，机械预处理是分批工艺的蒸汽枪水解器系统，其使用如上定义的高压和高温。也可为此使用SimdsHydrolyzer(可由SundsDefibratorAB(Sweden)得至丨J)。组合的化学和机械预处理在一个优选实施方案中，对生物质进行了化学和机械两种预处理。例如，所述预处理步骤可涉及稀酸或弱酸处理以及高温和/或高压处理。所述化学和机械预处理可根据需要顺序或同时进行。因此，在一个优选实施方案中，对生物质进行化学和机械预处理以促进纤维素、半纤维素或木质素的分离或释放。在一个优选实施方案中，所述预处理作为稀酸或弱酸预处理步骤进行。在另一个优选实施方案中，预处理作为氨纤维爆炸(fiberexplosion)步骤(或AFEX预处理步骤)进行。生物预处理短语“生物预处理”指促进自生物质分离或释放纤维素、半纤维素或木质素的任何生物预处理。生物预处理技术可涉及应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu,Τ.-Α.,1996,Pretreatmentofbiomass,于HandbookonBioethanolProductionandUtilization,ffyman,C.Ε.编，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh,P.和Singh,Α.,1993,Physicochemicalandbiologicaltreatmentsfprenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass,Adv.Appl.Microobiol.39295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreatinglignocellulosicbiomass:areview,于EnzymaticConversionofBiomassforFuelsProduction,Himmel,Μ.Ε.,Baker,J.0.和Overend,R.P.编，ACSSymposiumSeries566,AmericanChemicalSociety,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.Τ.,1999,Ethanolproductionfromrenewableresources,于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Scheper,T.编，Springer-VerlagBerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；01sson,L.和Hahn—Hagerdal,B.,1996,Fermentationoflignocellulosichydrolysatesforethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331；以及Vallander,L.和Eriksson,K.-Ε.L.,1990,Productionofethanolfromlignocellulosicmaterials:Stateoftheart,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。水解在发酵经预处理的生物质(优选为生物质浆料的形式)之前，可将其水解以将纤维素和半纤维素降解为可发酵的糖类。在一个优选实施方案中，经预处理的材料在发酵之前经水解，优选酶水解。水解过程中的干固体含量可为约5_50wt.%，优选约10_40wt.%，优选约20-30wt.%的范围。在一个优选实施方案中，水解可作为补料分批工艺实施，其中将经预处理的生物质(即，底物)逐渐加料于例如含有酶的水解溶液。在一个优选实施方案中，水解是通过酶实施的。根据本发明，经预处理的生物质浆料可由一种或多种纤维素分解酶如纤维素酶或半纤维素酶或其组合来水解。在一个优选实施方案中，水解是使用下述纤维素分解酶制备物来实施的，其包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽。在一个优选实施方案中，具有纤维素分解增强活性的多肽来源于家族GH61A。合适和优选的纤维素分解酶制备物和具有纤维素分解增强活性的多肽的实例描述于下面的“纤维素分解酶”和“纤维素分解增强多肽”部分。因为生物质可含有除了木质素、纤维素和半纤维素之外的组分，水解和/或发酵可在其他酶活性如蛋白酶活性、淀粉酶活性、糖生成酶活性和酯酶活性如脂肪酶活性存在下实施。酶水解优选在合适的水性环境中在本领域技术人员可容易地确定的条件下实施。在一个优选实施方案中，水解在对所述酶合适的，优选为最佳的条件下实施。合适的工艺时间、温度和pH条件可容易地由本领域技术人员确定。优选地，水解在25至70°C，优选40至60°C，特别是约50°C的温度实施。水解优选在pH3_8，优选pH4-6，特别是约pH5的pH范围中实施。此外，水解通常实施12至192小时，优选16至72小时，更优选24至48小时。鍾来自经预处理和/或水解的生物质的可发酵的糖类可以通过一种或多种发酵生物发酵，所述发酵生物能够将糖类如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖直接或间接发酵成期望的发酵产物。发酵条件取决于期望的发酵产物和发酵生物，并且能够由本领域的一个普通技术人员确定。特别是在乙醇发酵的情况下，发酵可以进行1-48个小时，优选I-M个小时。在一个实施方案中，发酵在约20-40°C之间的温度，优选约^_34°C，特别是大约32°C进行。在一个实施方案中，PH大于5。在另一实施方案中，pH为约pH3-7，优选4-6。然而，例如，某些细菌发酵生物具有更高的最优发酵温度。因此，在一个实施方案中，发酵在约40-60°C之间，如50-60°C的温度下进行。本领域技术人员能够简单地测定合适的发酵条件。发酵可在分批、补料分批或连续反应器中实施。补料分批发酵可为定容(fixedvolume)或变容(variablevolume)补料分批。在一个实施方案中，使用补料分批发酵。补料分批发酵的体积和速率依赖于，例如发酵生物、可发酵的糖类的身份(identity)和浓度和所需的发酵产物。上述发酵速率和体积可容易地由本领域一般技术人员确定。SSF、HHF和SHF水解和发酵可作为同时水解和发酵步骤(SSF)进行。通常这意味组合的/同时水解和发酵在对所述发酵生物合适，优选最佳的条件(例如，温度和/或PH)下实施。水解步骤和发酵步骤可作为混合水解和发酵(HHF)实施。HHF通常以单独的部分水解步骤开始，并以同时水解和发酵步骤结束。单独的部分水解步骤为酶法纤维素糖化步骤，通常在对所述的水解酶合适，优选最佳的条件(例如在较高温度)下实施。后续的同时水解和发酵步骤通常在对发酵生物合适的条件(常常在比所述单独水解步骤更低的温度)下实施。水解和发酵步骤也可作为单独的水解和发酵步骤进行，其中所述水解在起始发酵之前已经完成。这常常称作“SHF”。Ml^在发酵之后，可任选地自发酵培养基中以任何合适的方式分离发酵产物。例如，可蒸馏发酵培养基以提取发酵产物，或可自发酵培养基中通过微滤或膜过滤技术提取发酵产物。或者，可通过汽提(stripping)回收发酵产物。回收方法在本领域为众所周知的。发酵产物本发明可用于产生任何发酵产物。优选的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，吐和0)2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、Β12、β-胡萝卜素)；以及激素。其他产物包括消费醇类工业产物，例如，啤酒和葡萄酒；乳制品工业产物，例如，发酵的乳制品；皮革工业产物和烟草工业产物。在一个优选的实施方案中，所述发酵产物是醇，特别是乙醇。根据本发明获得的发酵产物(如乙醇)可优选用作燃料醇/乙醇。然而，对于乙醇，其亦可用作饮用乙醇。酶在本发明的方法或工艺的上下文中，即使未特别提及，也可理解的是酶以及其他化合物是以有效量使用的。可使用一种或多种酶。本文所使用的短语“纤维素分解活性”应理解为包括具有纤维二糖水解酶活性(EC3.2.1.91)的酶，例如，纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及具有内切葡聚糖酶活性(EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶活性(EC3.2.1.21)的酶。在一个优选实施方案中，所述纤维素分解活性可为真菌来源的酶制备物的形式，如来自木霉属CTrichoderma)的菌株，优选里氏木霉CTrichodermareesei)的菌株；腐质霉属(Humicola)的菌株，如特异腐质霉(Humicolainsolens)的菌株；或金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，优选ChrysosporiumIucknowense的菌株。所述纤维素分解酶制备物可含有一种或多种下述活性酶、半酶(hemienzyme)、纤维素分解酶增强活性、β-葡糖苷酶活性、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或木糖异构酶。所述酶可为如PCT/US2008/065417中定义的组合物，其通过提述并入本文。例如，所述纤维素分解酶制备物包括具有纤维素分解增强活性的多肽，优选家族GH61A的多肽，优选WO2005/074656(Novozymes)中公开的多肽。所述纤维素分解酶制备物还可包括β-葡糖苷酶，例如来源于木霉属、曲霉属或青霉属(Penicillium)菌株的β-葡糖苷酶，包括WO2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白。所述纤维素分解酶制备物还可包括CBHII酶，优选土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)纤维二糖水解酶IICEL6A。所述纤维素分解酶制备物还可包含纤维素分解酶，优选来源于里氏木霉或特异腐质霉的纤维素分解酶。所述纤维素分解酶制备物还可包含公开于W02005/074656中的具有纤维素分解增强活性(GH61A)的多肽；β-葡糖苷酶(公开于W0/2008057637中的融合蛋白)以及来源于里氏木霉的纤维素分解酶。纤维素分解酶组合物可为商业上可以获得的产品CELLUCLAST1.5L或CELLUZYME(可得自NovozymesA/S,Denmark)或ACCELERASE1000(来自GenencorInc.USA)。可以加入纤维素分解酶以供水解经预处理的生物质浆料。纤维素分解酶可以以0.1-100FPU每克总固体(TS)，优选0.5-50FPU每克TS，特别是1-20FPU每克TS范围内的剂量加入。在另一个实施方案中，将至少0.Img纤维素分解酶每克总固体(TS)，优选至少;3mg纤维素分解酶每克TS，如5-10mg纤维素分解酶每克TS用于水解。内切葡聚糖酶(EG)在水解过程中可存在一种或多种内切葡聚糖酶。术语“内切葡聚糖酶”意指内-1，4-(1，3;1，4)-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(Ε.C.No.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷联结，混合型β-1，3-葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖，以及其他含有纤维素成分的植物材料中β-1，4-键的内水解。内切葡聚糖酶活性可使用羧甲基纤维素(CMC)水解根据(ihOSe，1987，PureandAppl.Chem.59:257-268的方法确定。内切葡聚糖酶可来源于木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属的菌株，优选ChrysosporiumIucknowense的菌株。纤维二糖水解酶(CBH)在水解过程中可存在一种或多种纤维二糖水解酶。术语“纤维二糖水解酶”意指1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其在纤维素，纤维寡糖或任何含有β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中催化1，4-β-D-葡糖苷联结的水解，将纤维二糖自链的还原或非还原末端释放。纤维二糖水解酶的实例为上面提及的，包括来自里氏木霉、特异腐质霉的CBHI和CBHII；和来自土生梭孢霉的CBHII纤维二糖水解酶(CELL6A)。纤维二糖水解酶活性可根据由Lever等，1972，Anal.Biochem.47:273-279和由vanTilbeurgh1982,FEBSLetters149:152-156；vanTilbeurgh禾口Claeyssens，1985，FEBSLetters187:283-288描述的方法来确定。所述Lever等的方法适用于评估玉米秸杆中纤维素的水解，而vanTilbeurgh等的方法适用于基于荧光二糖衍生物确定纤维二糖水解酶的活性。β-葡糖苷酶在水解过程中可存在一种或多种β-葡糖苷酶。术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡萄糖水解酶(Ε.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶活性根据由Venturi等，2002，J.BasicMicrobiol.42:55-66描述的基本方法确定，只是如本文所述使用不同的条件。一单位的β-葡糖苷酶活性定义为在IOOmM柠檬酸钠、0.01%TWEEN20中在50°C、pH5自作为底物的4mM对硝基苯酚-β-D-吡喃葡糖苷每分钟产生1.O微摩尔的对硝基苯酚。所述β-葡糖苷酶可为真菌来源，例如木霉属、曲霉属或青霉属的菌株。所述β-葡糖苷酶可来源于里氏木霉，如由bgll基因编码的β-葡糖苷酶(参见EP562003的图1)。所述β-葡糖苷酶可来源于米曲霉(根据WO2002/095014在米曲霉中重组产生)，烟曲霉(Aspergillusfumigatus)(根据WO2002/095014的实施例22在米曲霉中重组产生)，或黑曲霉(1981，J.Appl.第3卷，ppl57-163)。半纤维素酶半纤维素可由半酶和/或酸水解分解以释放其五和六碳糖组分。木素纤维素衍生的材料可用一种或多种半纤维素酶进行处理。可使用任何适用于水解半纤维素(优选水解为木糖)的半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶以及上述两种或更多种的混合物。优选的，用于本发明的半纤维素酶为外作用的(exo-acting)半纤维素酶，且更优选地，所述半纤维素酶为下述的外作用的半纤维素酶，其具有在PH小于7，优选3-7的酸性条件下水解半纤维素的能力。适用于本发明的半纤维素酶的实例包括VISC0ZYME(可自NovozymesA/S,Denmark得到)。所述半纤维素酶可为木聚糖酶。所述木聚糖酶可优选为微生物来源的，如真菌来源的(例如，木霉属、多孔菌属(Meripilus)、腐质霉属、曲霉属、镰孢属(Fusarium))或来自细菌(例如，芽孢杆菌属(Bacillus))。所述木聚糖酶可来源于丝状真菌，优选来源于曲霉属，如棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的菌株，或腐质霉属，优选疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)的菌株。所述木聚糖酶可优选为内_1，4-β-木聚糖酶，更优选GHlO或GHll的内-1，4-β-木聚糖酶。商业木聚糖酶的实例包括来自NovozymesA/S,Denmark的SHEARZYME和BI0FEEDWHEAT。所述半纤维素酶也可以有效水解半纤维素的量添加，如，以约0.001到0.5wt%总固体(TQ，更优选约0.05到0.5wt%TS的量添加。木聚糖酶也可以0.001-1.0g/kg干物质(DM)底物的量，优选以0.005-0.5g/kgDM底物的量，且最优选以0.05-0.10g/kgDM底物的量添加。木糖异构酶木糖异构酶(D-木糖酮异构酶)(E.C5.3.1.5)为催化D-木糖变为D-木酮糖的可逆异构化反应的酶。葡萄糖异构酶转化D-葡萄糖到D-果糖的可逆异构化。然而，葡萄糖异构酶时称作木糖异构酶。木糖异构酶可用于本发明方法或工艺，且可为任何具有木糖异构酶活性的酶，且可得自任何来源，优选细菌或真菌来源，如丝状真菌或酵母。细菌木糖异构酶的实例包括属于链霉菌属(Str印tomyces)、游动放线菌属(Actinoplanes)、芽孢杆菌属和黄杆菌属(FlavcAacterium)的那些，以及栖热袍菌属(Thermotoga)的，例如新阿波罗栖热袍菌(T.neapolitana)(Vieille等，1995，Appl.Environ.Microbiol.61(5)，1867-1875)和海栖热袍菌(T.maritime)。真菌木糖异构酶的实例为担子菌纲(Basidiomycetes)来源的菌种。优选的木糖异构酶来源于酵母假丝酵母属的菌株，优选博伊丁氏假丝酵母(Candidaboidinii)，特别是由例如Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem.,52(7)1817-1824公开的博伊丁氏假丝酵母木糖异构酶。所述木糖异构酶可优选来源于博伊丁氏假丝酵母的菌株(Kloeckera2201)，其以DSM70034和ATCC48180保藏，公开于Ogata等，Agric.Biol.Chem,33,1519-1520或Vongsuvanlert等，1988,Agric.Biol.Chem,52(2)，1519-1520。在一个实施方案中，所述木糖异构酶来源于链霉菌属的菌株，例如，来源于鼠灰链霉菌(Sti^ptomycesmurinus)的菌株(美国专利号4，687，742)、黄微绿链霉菌(S.flavovirens)、白色链霉菌(S.albus)、不产色链霉菌(S.achromogenus)、多刺链霉菌(S.echinatus)、威德莫尔链霉菌(S.wedmorensis)，其均公开于美国专利3，616，221号。其他的木糖异构酶公开于美国专利3，622，463号，美国专利4，351，903号，美国专利4，137，126号，美国专禾Ij3，625，828号，HU专利12,415号，DE专利2，417，642，JP专利69，观，473号，以及WO2004/044129，每个均通过提述并入本文。所述木糖异构酶可为固定化或液体形式。优选液体形式。商业上可得到的木糖异构酶的实例包括来自NovozymesA/S，Denmark的SWEETZYMEΤ。添加的木糖异构酶的量提供0.01-100IGIU每克总固体范围内的活性水平。α-淀粉酶可使用一种或多种α-淀粉酶。优选的α-淀粉酶是微生物来源的，如细菌或真菌来源。最适合的α-淀粉酶是基于工艺条件确定的，但本领域技术人员可容易地确定。优选的α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，例如，真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。短语“酸性α-淀粉酶”意指α-淀粉酶(Ε.C.3.2.1.1)，当其以有效量添加时，在3到7，优选3.5到6，或更优选4-5的范围内的ρΗ具有最佳活性。细菌α-淀粉酶如上所示，所述α-淀粉酶可为芽孢杆菌属来源。所述芽孢杆菌属α-淀粉酶可优选来源于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens),枯草杆菌(Bacillussubtilis)或嗜热月旨肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的菌株，但也可来源于其他芽孢杆菌属菌种。涵盖的α-淀粉酶的特定实例包括示于WO1999/19467的SEQIDNO4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，示于WO1999/19467的SEQIDNO5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，和示于WO1999/19467的SEQIDNO3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在一个实施方案中，所述α-淀粉酶可为与分别示于WO1999/19467(通过提述并入本文)的SEQIDNO1，2或3中的任何序列具有至少60%，优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，例如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的酶。所述芽孢杆菌属α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，特别是描述于W01996/23873、WO1996/23874、WO1997/41213、WO1999/19467、W02000/60059和WO2002/10355(所有文件通过提述并入本文)中任一的变体和/或杂合体。特别涵盖的α-淀粉酶变体公开于美国专利6，093，562,6,297，038或6，187，576号(通过提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α_淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选WO1996/023873公开的双缺失-参见，例如，第20页第1-10行(通过提述并入本文)，优选与WO1999/19467公开的SEQIDNO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO1999/19467中的SEQIDNO3的编号方式缺失氨基酸R179和G180。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其较之WO99/19467公开的SEQIDNO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列具有对应于Δ(181-182)的双缺失，且进一步包括W93F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。细菌杂合体α-淀粉酶可使用一种或多种细菌杂合体α-淀粉酶。特别涵盖的杂合体α_淀粉酶包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO99/19467的SEQIDNO4)的445个C-末端氨基酸残基，以及来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(示于W099/19467的SEQIDNO5)的37个N-末端氨基酸残基，并具有下列取代中的一个或多个，特别是全部48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO99/19467的SEQIDNO4的地衣芽孢杆菌编号)。也优选具有一个或更多下述突变的变体(或在其他芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中的对应突变):Η1ΜΥ，Α181Τ，N190F,A209V和Q264S和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选Ε178和G179的缺失(使用WO99/19467的SEQIDNO5编号)。真菌α-淀粉酶可使用一种或多种真菌α-淀粉酶。真菌α-淀粉酶包括来源于曲霉属菌株的α-淀粉酶，如米曲霉(Aspergillusoryzae)，黑曲霉(Aspergillusniger)和川地曲霉(Aspergilliskawachii)α-淀粉酶。优选的酸性真菌α-淀粉酶为Fimgamyl样α-淀粉酶，其来源于米曲霉的菌株。短语“Fungamyl样α-淀粉酶”指下述的α-淀粉酶，即与WO1996/23874的SEQIDNO10中所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，即，多于70%，多于75%，多于80%，多于85%，多于90%，多于95%，多于96%，多于97%，多于98%，多于99%或甚至100%的同一性。另一个优选的酸性α-淀粉酶来源于黑曲霉的菌株。所述酸性真菌α-淀粉酶可为来自黑曲霉的α-淀粉酶，作为“ΑΜΥΑASPNG”以原始登录号Ρ56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO1989/01969(实施例3)。来源于黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由NovozymesA/S,Denmark得到)。所述真菌α-淀粉酶也可为包含淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即非杂合体)，或其变体。在一个实施方案中，所述野生型α-淀粉酶可来源于川地曲霉(Aspergilluskawachii)的菌株。其他涵盖的野生型α-淀粉酶包括来源于根毛霉属(I^hizomucor)和多孔菌属(Meripilus)的菌株，优选微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)(WO2004/055178通过提述并入本文)或巨多孔菌(Meripilusgiganteus)菌株的那些α-淀粉酶。α-淀粉酶可以来源于如Kaneko等1996，J.Ferment.Bioeng.81292-298"Molecular-cloninganddeterminationofthenucleotide-sequenceofageneencodinganacid-stableα-amylasefromAspergilluskawachii，，公开，并进一步作为EMBL:#AB008370公开的川地曲霉。真菌杂合体α-淀粉酶可使用一种或多种真菌杂合体α-淀粉酶。所述真菌酸性α_淀粉酶可为杂合体α-淀粉酶。真菌杂合体α-淀粉酶的实例包括公开于WO2005/003311或美国申请公开2005/0054071号(Novozymes)或美国专利申请60/638，614号(Novozymes)中的那些，将其通过提述并入本文。杂合体α-淀粉酶可包括α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域，以及任选的接头。所涵盖的杂合体α-淀粉酶的特定实例包括美国专利申请号60/638，614实施例中的表1到5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Atheliarolfsii)SBD的Fungamyl变体(US申请60/638，614号中的SEQIDNO:100)，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD(US申请60/638，614号中的SEQIDNO101)的微小根毛霉α-淀粉酶，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为美国申请号11/316，535中氨基酸序列SEQIDNO20,SEQIDNO72和SEQIDNO:96的组合公开于表5)，或作为W02006/069290中表5中的V039，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(US申请60/638，614中的SEQIDNO:102)。其他特别涵盖的杂合体α-淀粉酶为美国申请号11/316，535和WO2006/06拟90(每个均通过提述并入本文)实施例4中表3、4、5和6中所列的任何杂合体α-淀粉酶。涵盖的杂合体α-淀粉酶的其他特定实例包括美国申请公开2005/0054071号中公开的那些，包括第15页表3公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。也涵盖下述α-淀粉酶，其与任何上面提及的α-淀粉酶显示高同一性，g卩，与成熟酶序列显示多于70%，多于75%，多于80%，多于85%，多于90%，多于95%，多于96%，多于97%，多于98%，多于99%或甚至100%同一性。酸性α-淀粉酶可根据本发明以0.1至10AFAU/gDS,优选0.10至5AFAU/gDS,特别是0.3至2AFAU/gDS的量添加。商业性α-淀粉酶产品优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括来自DSM的MYC0LASE、BANtm、TERMAMYLSC、FUNGAMYL、LIQU0ZYMEX和SANtmSUPER、SANEXTRAL(NovozymesA/S)和CLARASEL-40,000、DEX-L0tm、SPEZYMEFRED、SPEZYMEAA和SPEZYMEDELTAAA(GenencorInt.),以及以商品名出售的酸性真菌α-淀粉酶(可由NovozymesA/S,Denmark得到)。糖源生成酶短语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(其为葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(其为麦芽糖生成者)。糖源生成酶能够产生糖，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于产生发酵产物例如乙醇的工艺时。所产生的糖可直接或间接的转化为期望的发酵产物，优选乙醇。可存在糖源生成酶的混合物。特别涵盖的混合物为至少是葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶的混合物。葡糖淀粉酶可使用一种或多种葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可来源于任何合适的来源，例如来源于微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉Gl或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBOJ.3(5):ρ.1097-1102)，及其变体，如公开于WO1992/00381，W02000/04136和WO2001/04273(来自Novozymes，Denmark)的那些；公开于WO8194/02921的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.，1991，55(4):p.941-949)，及其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体G137A和G139A(Chen等，1996，Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等，1995，Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等，1994，Biochem.J-3Ol:275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等，1996，Biochemistry，35:8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等，1997，ProteinEng.10:1199-1204)。其他的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(之前表示为罗耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利4，727，026号和Nagasaka等，1998,"Purificationandpropertiesoftheraw-starch-degradingglucoamylasesfromCorticiumrolfsii,ApplMicrobiolBiotechnol.50:323-330)，以及踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是来源于埃莫森踝节菌(Talaromycesemersonii)(W01999/28448)、TalaromycesIeycettanus(美国专利Re.32,153号)、杜邦踝节菌(Talaromycesduponti)和嗜热踝节菌(Talaromycesthermophilus)(美国专利4，587，215号)。涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135，138)禾口热it化S梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(TO1986/01831)以及瓣环栓菌CTrametescingulata)的葡糖淀粉酶，其披露于WO2006/069289(通过提述并入本文)。还涵盖了杂合体葡糖淀粉酶。所述杂合体葡糖淀粉酶的实例公开于W02005/045018。具体实例包括公开于WO2005/045018实施例1表1和4的杂合体葡糖淀粉酶，其以其教导杂合体葡糖淀粉酶的程度通过提述并入本文。还涵盖了与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高同一性的葡糖淀粉酶，S卩，与成熟酶序列显示多于70%，多于75%，多于80%，多于85%，多于90%，多于95%，多于96%，多于97%，多于98%，多于99%或甚至100%的同一性。商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG200L、AMG300L.SANSUPER、SANEXTRAL、SPIRIZYMEPLUS、SPIRIZYMEFUEL、SPIRIZYMEB4U禾ΠAMGE(来自NovozymesA/S)；0PTIDEX300(来自GenencorInt.)；AMIGASE和AMIGASEPLUS(来自DSM)；G-ZYMEG900、G-ZYME和G990ZR(来自GenencorInt.)。葡糖淀粉酶可以以0.02-20AGU/gDS,优选0.1-lOAGU/gDS,特别是在l_5AGU/gDS，如0.5AGU/gDS的量添加。β-淀粉酶可使用一种或多种β-淀粉酶。术语“β-淀粉酶”(Ε.C3.2.1.2)为传统上给予外作用的(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中1，4-α_葡糖苷联结的水解。自非还原的链末端以逐步的方式连续移除麦芽糖单元直至分子降解，或者，在支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β异头物构象，由此得到淀粉酶的名称。已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(W.Μ.Fogarty和C.T.Kelly，ProgressinIndustrialMicrobiology，第15卷，pp.112-115，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有范围在40°C到65°C的最适温度以及范围在4.5到7的最适ρΗ。来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶为来自NovozymesA/S,Denmark的NOVOZYMWBA和来自GenencorInt.，USA的SPEZYMEBBA1500。产寿芽糖淀粉酶可使用一种或多种产麦芽糖淀粉酶。淀粉酶也可为产麦芽糖α-淀粉酶。产麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶，Ε.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α-构象的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可由NovozymesA/S得到。产麦芽糖的α-淀粉酶描述于美国专利4，598，048，4，604，355和6，162，628号，其通过提述并入本文。所述产麦芽糖淀粉酶可以0.05_5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/gDS的量添加。蛋白酶蛋白酶可在水解、发酵或同时水解和发酵过程中添加。可在发酵过程中添加蛋白酶以反絮凝发酵生物，特别是酵母。所述蛋白酶可为任何蛋白酶。在一个优选实施方案中，所述蛋白酶为微生物来源的酸性蛋白酶，优选真菌或细菌来源的。酸性真菌蛋白酶是优选的，但也可使用其他蛋白酶。合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶为酸性蛋白酶，即，特征为能够在PH7以下的酸性条件下水解蛋白质的蛋白酶。涵盖的酸性真菌蛋白酶包括来源于曲霉属，毛霉属(Mucor)、根霉属(lihizopus)、假丝酵母属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、小核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属CTorulopsis)的真菌蛋白酶。特别涵盖的是来源于黑曲霉(参见，例如，Koaze等，1964，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)，斋藤曲霉(Aspergillussaitoi)(参见，例如，Yoshida，1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan,沘，66)，泡盛曲霉(Hayashida等，1977Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)，棘孢曲霉(W01995/02044)或米曲霉的蛋白酶，如ρ印A蛋白酶，以及来自微小毛霉(Mucorpusillus)和米黑毛霉(Mucormiehei)的酸性蛋白酶。还涵盖了中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。例如，本发明涵盖的蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌，且具有在Swissprot可作为登录号P06832得到的序列。也涵盖与在Swissprot可作为登录号P06832得到的氨基酸序列具有至少90%同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特别为至少99%同一性的蛋白酶。进一步涵盖的是与WO2003/048353中作为SEQ.ID.NO1公开的氨基酸序列具有至少90%的同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特别为至少99%的同一性的蛋白酶。还涵盖木瓜蛋白酶样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，如EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(萝蘑蛋白酶(asclepain)),EC3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。在一个实施方案中，所述蛋白酶可为来源于曲霉属，如米曲霉的菌株的蛋白酶制备物。在另一个实施例中，所述蛋白酶可来源于根毛霉属，优选曼赫根毛霉(Miizomucormiehei)的菌株。在另一个涵盖的实施方案中，所述蛋白酶可为蛋白酶制备物，优选来源于曲霉属(如米曲霉)的菌株的蛋白水解制备物以及来源于根毛霉属(优选曼赫根毛霉)的菌株的蛋白酶的混合物。天冬氛酸蛋白醇描述于,例如,HandbookofProteolyticEnzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings禾口J.F.Woessner编，AcademicPress,SanDiego,1998,Chapter270)。天冬氨酸蛋白酶的合适的实例包括，例如，R.M.Berka等，Gene,96,313)(1990)；(R.Μ.Berka等Gene,125，195-198)(1993)；以及Gomi等，Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100(1993)公开的那些，其通过提述并入本文。％，商业上可得到的产品包括ALCALASE、ESPERASE、FLAV0URZYME、PR0MIX、NEUTRASE、RENNILASE、N0V0ZYMFM2.0L、以及N0V0ZYM50006(可由NovozymesA/S、Denmark得到)以及来自GenencorInt.,Inc.USA.的GC106和SPEZYMEFAN。所述蛋白酶可以0.0001-lmg酶蛋白每克DS，优选0.001到0.Img酶蛋白每克DS的量存在。或者，所述蛋白酶可以0.0001到lLAPU/gDS，优选0.001到0.lLAPU/gDS和/或0.0001到ImAU-RH/gDS，优选0.001到0.ImAU-RH/gDS的量存在。此处描述并要求保护的发明不限于此处公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案旨在说明本发明的几个方面。意图将任何等效的实施方案以及一个或多个所述实施方案的组合包括在本发明的范围内。根据前文的描述，在此处说明和记载的修饰之外对本发明的各种修饰对于本科领域技术人员会是显而易见的。意欲使这些修饰也落入所附权利要求的范围内。此处引用了多篇参考文献，将它们整体通过提述并入。通过以下实施例进一步描述本发明，但不应将这些实施例理解为对本发明范围的限制。材料和方法同一性两个氨基酸序列或两个多核苷酸序列间的相关性由参数“同一性”描述。就本发明而言，两个氨基酸序列间的同一性程度可通过Clustal方法(Higgins，1989,CABIOS5:151-153)使用LASERGENEMEGALIGN软件(DNASTAR，Inc.,Madison,WI)及同一性表和下述多重比对(multiplealignment)参数确定缺口罚分为10，而缺口长度罚分为10。配对比对参数(pairwisealignmentparameter)为K元组(Ktuple)=1，缺口罚分=3，窗口=5和对角线=5。就本发明而言，两个多核苷酸序列间的同一性可通过WiIbur-Lipman方法(Wilbur禾口Lipman,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80:726-730)使用LASERGENEMEGALIGN软件(DNASTAR，Inc.，Madison,WI)及同一性表和下述多重比对参数确定缺口罚分为10，而缺口长度罚分为10。配对比对参数为K元组=3，缺口罚分=3和窗口=20。蛋白质测定法AZCL-酪蛋白测定法将0.2%蓝色底物AZCL-酪蛋白溶液在搅拌的同时悬于硼砂/NaH2PO4缓冲液pH9中。一边搅拌一边将所述溶液分配到微滴定板上(每孔100μL)，添加30μL酶试样，然后将板在Eppendorf热混合器中在45°C和600rpm温育30分钟。使用变性的酶试样(100°C沸腾20分钟)作为空白。在温育后，通过将微滴定板转移至冰上而终止反应，且通过在4°C以3000rpm离心5分钟来将有色溶液与固体分离。将60μL上清转移至微滴定板，并使用BioRad微板读数器测定在595nm的吸光度。DNA测定法将50μL含蛋白酶的试样添加至微滴定板，并通过添加100μLlmMρΝΑ底物(5mg溶于100μLDMS0,并进一步用硼砂/NaH2PO4缓冲液pH9.0稀释至IOmL)来起始所述测定法。监测OD4tl5在室温的增加作为蛋白酶活性的量度。葡糖淀粉酶活性(AGU)葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶单位(AGU)测定。Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37°C，pH4.3，底物麦芽糖23.2mM，缓冲液乙酸盐0.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。可使用自动分析仪系统。将变旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖在上述反应中反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处测定作为起始葡萄糖浓度的量度。AMG温育底物麦芽糖232mM缓冲液乙酸盐0.IMpH4.30±0.05温育温度37"C±1反应时间5分钟酶工作范围0.5-4.0AGU/mL颜色反应GlucDH430U/L2权利要求1.用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括(a)预处理所述含木素纤维素材料；(b)将担子菌菌丝体引入经预处理的含木素纤维素材料；(c)将经预处理的含木素纤维素材料暴露于有效量的水解酶；和(d)用发酵生物发酵以产生发酵产物。2.权利要求1的方法，其中所述担子菌菌丝体是在将含木素纤维素材料暴露于有效量的水解酶之前弓I入该含木素纤维素材料的。3.权利要求1的方法，其中所述担子菌菌丝体是在将含木素纤维素材料暴露于有效量的水解酶的同时引入该含木素纤维素材料的。4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述担子菌菌丝体在引入经预处理的含木素纤维素材料之前受到处理。5.权利要求4的方法，其中对所述担子菌菌丝体进行高压灭菌。6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中使用酸性预处理来预处理所述含木素纤维素材料。7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述含木素纤维素材料选自下组玉米秸秆、玉米穗轴、玉米纤维、柳枝稷、麦秆、稻秆、甘蔗渣，及其组合。8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述发酵产物是乙醇。9.用于增强含木素纤维素材料酶水解的方法，包括(a)将有效的木质素阻断量的担子菌菌丝体引入含木素纤维素材料，和(b)将所述含木素纤维素材料暴露于有效量的水解酶。10.用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括(a)预处理所述含木素纤维素材料；(b)将酵母细胞引入经预处理的含木素纤维素材料；(c)将经预处理的含木素纤维素材料暴露于有效量的水解酶；和(d)用发酵生物发酵以产生发酵产物。11.权利要求10的方法，其中所述酵母细胞是在将含木素纤维素材料暴露于有效量的水解酶之前弓I入该含木素纤维素材料的。12.权利要求10的方法，其中所述酵母细胞是在将含木素纤维素材料暴露于有效量的水解酶的同时引入该含木素纤维素材料的。13.权利要求10-12任一项所述的方法，其中所述酵母细胞是以约8%w/w酵母细胞/含木素纤维素材料的量引入所述含木素纤维素材料的。14.权利要求10-13任一项所述的方法，其中所述酵母细胞在引入经预处理的含木素纤维素材料之前受到处理。15.权利要求14的方法，其中对所述酵母细胞进行高压灭菌。16.权利要求10-15任一项所述的方法，其中使用酸性预处理来预处理所述含木素纤维素材料。17.权利要求10-16任一项所述的方法，其中所述含木素纤维素材料选自下组玉米秸秆、玉米穗轴、玉米纤维、柳枝稷、麦秆、稻秆、甘蔗渣，及其组合。18.权利要求10-17任一项所述的方法，其中所述发酵产物是乙醇。19.用于增强含木素纤维素材料酶水解的方法，包括(a)将有效的木质素阻断量的酵母细胞引入含木素纤维素材料，和(b)将所述含木素纤维素材料暴露于有效量的水解酶。全文摘要用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括预处理所述含木素纤维素材料；将经处理的担子菌菌丝体和/或酵母细胞引入经预处理的含木素纤维素材料；将经预处理的含木素纤维素材料暴露于有效量的水解酶；和用发酵生物发酵以产生发酵产物。文档编号C12P7/10GK102171354SQ200980138468公开日2011年8月31日申请日期2009年9月30日优先权日2008年9月30日发明者李鑫,陈晔申请人:诺维信北美公司