本发明属于生物学领域，涉及一种β-D-葡聚糖，具体来是一种从产朊假丝酵母细胞壁中提取β-D-葡聚糖的方法。
背景技术：
产朊假丝酵母没有致病性，与啤酒酵母、克鲁维酵母一起被许多国家认证为一种可作为食品添加剂的微生物，也是中国卫生部门允许的可用于保健食品的微生物。酵母细胞壁一般直接被用做饲料产品，这样附加值太低。
酵母β-葡聚糖是酵母细胞壁的结构多糖。它们具有不同的功能特性，如医疗，制药，食品，化妆品等行业。它们也可以作为免疫反应的生物修饰剂。除此之外，它们也有利于抗菌抗炎反应；促进霉毒素的吸收；减少低密度脂蛋白中的胆固醇颗粒等作用；还具有抗癌、抗诱变、抗氧化以及促进伤口愈合的特性。
目前国内提取β-D-葡聚糖方法主要采用酸法、碱法、酸碱结合，缺点是产品纯度不高，且酸碱提取条件比较剧烈，易污染环境，尤其是在提取过程中部分β-葡聚糖会降解，造成产品得率与生物活性的降低。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种从产朊假丝酵母细胞壁中提取β-D-葡聚糖的方法，所述的这种从产朊假丝酵母细胞壁中提取β-D-葡聚糖的方法要解决现有技术中提取β-D-葡聚糖的方法容易破坏β-D-葡聚糖的结构，同时β-D-葡聚糖的纯度和得率不高的技术问题。
本发明提供了一种从产朊假丝酵母细胞壁中提取β-D-葡聚糖的方法，包括以下步骤：
1）一个获取产朊假丝酵母细胞的步骤，将产朊假丝酵母在去蛋白土豆汁中培养10-14h，然后离心，再用去离子水冲洗，即得到产朊假丝酵母细胞；
2）一个对产朊假丝酵母细胞进行诱导自溶的步骤，将步骤1）获得的产朊假丝酵母细胞加入到一个氯化钠溶液中，所述的氯化钠溶液的质量百分比浓度为2%-5%，产朊假丝酵母细胞在氯化钠溶液中的质量百分比浓度为10%-20％，在pH4.0-pH7.0， 55-60℃，100-120rpm的条件下振荡自溶，时间为20h-24h，自溶后离心，并用去离子水冲洗；
3）一个高温浸提的步骤，将步骤2）获得产朊假丝酵母细胞加入pH6.0-10.0的磷酸盐缓冲液中，在磷酸盐缓冲液中，酵母细胞的质量百分比浓度为10%-15%，将产朊假丝酵母细胞悬浮，然后加入直径为0.5cm玻璃珠，料液比1：5-1：15，进行高温浸提，浸提时间2-8h、温度为80-120℃、离心，用去离子水洗涤，获得富集沉淀；
4）一个超声波破壁的步骤，用去离子水使步骤3）的富集沉淀悬浮，在600-1000w功率条件下超声波破壁30min-90min，然后在离心力为3000-5000g，温度为4-20℃下离心得细胞壁沉淀；
5）一个高温抽提的步骤，将步骤4）获得产朊假丝酵母细胞壁加入pH6.0-10.0的磷酸盐缓冲液中，在磷酸盐缓冲液中，酵母细胞壁的质量百分比浓度为10%-20%，将产朊假丝酵母细胞壁悬浮，加入直径0.5cm玻璃珠，料液比为1：5-1：15，高温抽提，抽提时间为2-8h、温度80-120℃、离心，沉淀用去离子水洗涤，得到沉淀；
6）一个脱脂的步骤，将步骤5）的沉淀加入到无水乙醇溶剂中，进行反复萃取，得到去脂肪的葡聚糖粗品；
7）一个酶解去蛋白的步骤，已脱脂的葡聚糖粗品用pH6.0-10.0的磷酸缓冲液配成质量百分比浓度为10%-20％的悬浮液，然后加入中性蛋白酶，加入后的中性蛋白酶的质量分数为0.1g/L-1g/L，在50℃-65℃的条件下进行酶解处理1-5h，反应结束后，得到的沉淀用水洗涤，离心，再加水使其充分混匀后于100℃加热3-8分钟灭酶，离心，冷冻干燥，得到淡黄色粉末即为β-D-葡聚糖产品。
进一步的，所述的产朊假丝酵母（Candidautilis），保藏编号CICC1769。
本发明提供了一种从产朊假丝酵母细胞壁中提取β-D-葡聚糖的方法，利用诱导自溶-高温浸提-超声波破壁-酶解-脱脂的提取方法。所得提取物冷冻干燥即得到β-D-葡聚糖粉末。本发明以产朊假丝酵母为原料生产的葡聚糖可以用于食品、饲料、化妆品以及水产养殖中，能显著地降血脂、降血糖以及提高免疫能力，对有糖尿病、肥胖症、便秘及高胆固醇等疾病的患者有良好的辅助治疗的作用；使用去蛋白的土豆汁作为产朊假丝酵母的培养基，可以减轻废弃土豆汁对环境的污染，对环境保护具有重要意义。
本发明的一种产朊假丝酵母菌种，被许多国家认证为一种可作为食品添加剂的微生物，也是中国卫生部门允许的可用于保健食品的微生物。因此该产朊假丝酵母菌细胞壁中的β-D-葡聚糖具有食品安全可靠的特点。
本发明的一种从产朊假丝酵母细胞壁中提取的β-D-葡聚糖，对肥胖症、糖尿病人、高胆固醇、心血管等疾病患者有良好的辅助治疗作用，还具有辅助降血压降血糖、保肝护肝、保护胃黏膜，改善微循环、增强免疫力等保健功能。本发明的一种从产朊假丝酵母细胞壁中提取β-D-葡聚糖的方法，相比传统的提取方法，由于采用了一种条件较温和的提取β-D-葡聚糖方法，操作过程简单易行、快速，更重要的是避免了酸碱试剂对产品带来的降解作用。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明避免了酸碱试剂等传统方法对产品带来的降解作用，是一种条件较温和的提取β-葡聚糖的方法。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
本发明各实施例中所用的产朊假丝酵母菌种产朊假丝酵母（Candidautilis），保藏编号CICC1769，于中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏机构地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号6号楼，邮编：100015。
实施例1
一种产朊假丝酵母细胞壁的β-D-葡聚糖，通过包括如下步骤的方法制备而成：
（1）、产朊假丝酵母细胞的获取
将产朊假丝酵母用去蛋白土豆汁培养14h后，取去蛋白土豆汁培养液50mL，离心(15500g/4℃/10min，冷冻离心机)，然后用去离子水冲洗两遍，即得到产朊假丝酵母细胞，可将细胞沉淀部分保存于冰箱（4℃）中；
所用的产朊假丝酵母（Candidautilis），保藏编号CICC1769；
（2）细胞的诱导自溶
将步骤（1）获得的产朊假丝酵母细胞诱导自溶，即溶酶体将酶释放出来将自身细胞降解使内容物流出。酵母自溶菌体浓度5％(w／w)，pH7.0，5％NaCl和60℃，120rpm振荡自溶。在此条件下，酵母细胞诱导自溶的时间为24h即可。自溶后离心，并用去离子水冲洗两遍，；
（3）高温浸提
用pH10.0的磷酸盐缓冲液配成质量浓度为15%的酵母细胞壁悬浮液于250mL三角瓶中(加入直径0.5cm玻璃珠),抽提条件为时间3h、温度120℃、料液比1：15进行高温浸提，浸提时间2h、温度为120℃，离心，用去离子水洗涤3次，即得沉淀；
（4）超声波破壁
用300mL去离子水将每个样品沉淀悬浮，在1000w功率条件下破壁90min，然后在离心力为4000g，温度为4℃下离心得细胞壁沉淀；
（5）高温抽提
用pH10.0的磷酸盐缓冲液将酵母细胞壁悬浮液配成质量浓度为20%的溶液于250mL三角瓶中(加入直径0.5cm玻璃珠)，高温抽提条件是时间3h、温度120℃、料液比为1：15，高温抽提时间为2h、温度100℃，离心，沉淀用去离子水洗涤3次，得到沉淀；
（6）脱脂
利用脂肪能溶于有机溶剂的性质，在索氏提取器中将样品用无水乙醇溶剂反复萃取，提取样品中的脂肪后，所得的物质即为去脂肪的葡聚糖粗品；
（7）酶解去蛋白
已脱脂的粗品葡聚糖用pH10.0的磷酸缓冲液配成20％(w／w)的悬浮液，然后用质量分数为1g/L的中性蛋白酶在65℃的条件下进行酶解处理2h，反应结束后，得到的沉淀用水洗涤3次，离心，再加水使其充分混匀后于100℃加热5分钟灭酶，离心，冷冻干燥，得到淡黄色粉末即为β-D-葡聚糖产品。
上述所得的β-D-葡聚糖，其纯度是77.51%。
实施例2
一种产朊假丝酵母细胞壁的β-D-葡聚糖，通过包括如下步骤的方法制备而成：
（1）、产朊假丝酵母细胞的获取
将产朊假丝酵母用去蛋白土豆汁培养10h，取去蛋白土豆汁培养液50mL，离心(15500g/4℃/10min，冷冻离心机)，然后用去离子水冲洗两遍，即得到产朊假丝酵母细胞，可将细胞沉淀部分保存于冰箱（4℃）中；
所用的产朊假丝酵母（Candidautilis），保藏编号CICC1769；
（2）细胞的诱导自溶
将步骤（1）获得的产朊假丝酵母细胞诱导自溶，即溶酶体将酶释放出来将自身细胞降解使内容物流出。酵母自溶菌体浓度10％(w／w)，pH4.0，2％NaCl和55℃，100rpm振荡自溶。在此条件下，酵母细胞诱导自溶的时间为20h即可。自溶后离心，并用去离子水冲洗两遍，；
（3）高温浸提
用pH6.0的磷酸盐缓冲液配成质量浓度为10%的酵母细胞壁悬浮液于250mL三角瓶中(加入直径0.5cm玻璃珠),抽提条件为时间3h、温度120℃、料液比1：5进行高温浸提，浸提时间3h、温度为90℃，离心，用去离子水洗涤3次，即得沉淀；
（4）超声波破壁
用300mL去离子水将每个样品沉淀悬浮，在600w功率条件下破壁30min，然后在离心力为4500g，温度为14℃下离心得细胞壁沉淀；
（5）高温抽提
用pH6.0的磷酸盐缓冲液将酵母细胞壁悬浮液配成质量浓度为10%的溶液于250mL三角瓶中(加入直径0.5cm玻璃珠)，高温抽提条件是时间3h、温度120℃、料液比为1：5，高温抽提时间为4h、温度80℃，离心，沉淀用去离子水洗涤3次，得到沉淀；
（6）脱脂
利用脂肪能溶于有机溶剂的性质，在索氏提取器中将样品用无水乙醇溶剂反复萃取，提取样品中的脂肪后，所得的物质即为去脂肪的葡聚糖粗品；
（7）酶解去蛋白
已脱脂的粗品葡聚糖用pH6.0的磷酸缓冲液配成10％(w／w)的悬浮液，然后用质量分数为0.1g/L的中性蛋白酶在50℃的条件下进行酶解处理3h，反应结束后，得到的沉淀用水洗涤3次，离心，再加水使其充分混匀后于100℃加热4分钟灭酶，离心，冷冻干燥，得到淡黄色粉末即为β-D-葡聚糖产品。
上述所得的β-D-葡聚糖，其纯度是77.23%。
实施例3
一种产朊假丝酵母细胞壁的β-D-葡聚糖，通过包括如下步骤的方法制备而成：
（1）、产朊假丝酵母细胞的获取
将产朊假丝酵母用去蛋白土豆汁培养12h，取去蛋白土豆汁培养液50mL，离心(15500g/4℃/10min，冷冻离心机)，然后用去离子水冲洗两遍，即得到产朊假丝酵母细胞，可将细胞沉淀部分保存于冰箱（4℃）中；
所用的产朊假丝酵母（Candidautilis），保藏编号CICC1769；
（2）细胞的诱导自溶
将步骤（1）获得的产朊假丝酵母细胞诱导自溶，即溶酶体将酶释放出来将自身细胞降解使内容物流出。酵母自溶菌体浓度15％(w／w)，pH5.0，3％NaCl和56℃，110rpm振荡自溶。在此条件下，酵母细胞诱导自溶的时间为21h即可。自溶后离心，并用去离子水冲洗两遍，；
（3）高温浸提
用pH8.0的磷酸盐缓冲液配成质量浓度为14%的酵母细胞壁悬浮液于250mL三角瓶中(加入直径0.5cm玻璃珠),抽提条件为时间3h、温度120℃、料液比1：10进行高温浸提，浸提时间4h、温度为100℃，离心，用去离子水洗涤3次，即得沉淀；
（4）超声波破壁
用300mL去离子水将每个样品沉淀悬浮，在800w功率条件下破壁40min，然后在离心力为5000g，温度为12℃下离心得细胞壁沉淀；
（5）高温抽提
用pH8.0的磷酸盐缓冲液将酵母细胞壁悬浮液配成质量浓度为15%的溶液于250mL三角瓶中(加入直径0.5cm玻璃珠)，高温抽提条件是时间3h、温度120℃、料液比为1：10，高温抽提时间为5h、温度120℃，离心，沉淀用去离子水洗涤3次，得到沉淀；
（6）脱脂
利用脂肪能溶于有机溶剂的性质，在索氏提取器中将样品用无水乙醇溶剂反复萃取，提取样品中的脂肪后，所得的物质即为去脂肪的葡聚糖粗品；
（7）酶解去蛋白
已脱脂的粗品葡聚糖用pH8.0的磷酸缓冲液配成15％(w／w)的悬浮液，然后用质量分数为0.5g/L的中性蛋白酶在60℃的条件下进行酶解处理5h，反应结束后，得到的沉淀用水洗涤3次，离心，再加水使其充分混匀后于100℃加热3分钟灭酶，离心，冷冻干燥，得到淡黄色粉末即为β-D-葡聚糖产品。
上述所得的β-D-葡聚糖，其纯度是79.92%。
实施例4
一种产朊假丝酵母细胞壁的β-D-葡聚糖，通过包括如下步骤的方法制备而成：
（1）、产朊假丝酵母细胞的获取
将产朊假丝酵母用去蛋白土豆汁培养13h，取去蛋白土豆汁培养液50mL，离心(15500g/4℃/10min，冷冻离心机)，然后用去离子水冲洗两遍，即得到产朊假丝酵母细胞，可将细胞沉淀部分保存于冰箱（4℃）中；
所用的产朊假丝酵母（Candidautilis），保藏编号CICC1769；
（2）细胞的诱导自溶
将步骤（1）获得的产朊假丝酵母细胞诱导自溶，即溶酶体将酶释放出来将自身细胞降解使内容物流出。酵母自溶菌体浓度18％(w／w)，pH5.0，5％NaCl和57℃，115rpm振荡自溶。在此条件下，酵母细胞诱导自溶的时间为22h即可。自溶后离心，并用去离子水冲洗两遍，；
（3）高温浸提
用pH9.0的磷酸盐缓冲液配成质量浓度为13%的酵母细胞壁悬浮液于250mL三角瓶中(加入直径0.5cm玻璃珠),抽提条件为时间3h、温度120℃、料液比1：6进行高温浸提，浸提时间6h、温度为110℃，离心，用去离子水洗涤3次，即得沉淀；
（4）超声波破壁
用300mL去离子水将每个样品沉淀悬浮，在900w功率条件下破壁80min，然后在离心力为3000g，温度为20℃下离心得细胞壁沉淀；
（5）高温抽提
用pH9.0的磷酸盐缓冲液将酵母细胞壁悬浮液配成质量浓度为14%的溶液于250mL三角瓶中(加入直径0.5cm玻璃珠)，高温抽提条件是时间3h、温度120℃、料液比为1：6，高温抽提时间为6h、温度90℃，离心，沉淀用去离子水洗涤3次，得到沉淀；
（6）脱脂
利用脂肪能溶于有机溶剂的性质，在索氏提取器中将样品用无水乙醇溶剂反复萃取，提取样品中的脂肪后，所得的物质即为去脂肪的葡聚糖粗品；
（7）酶解去蛋白
已脱脂的粗品葡聚糖用pH9.0的磷酸缓冲液配成16％(w／w)的悬浮液，然后用质量分数为0.8g/L的中性蛋白酶在58℃的条件下进行酶解处理4h，反应结束后，得到的沉淀用水洗涤3次，离心，再加水使其充分混匀后于100℃加热7分钟灭酶，离心，冷冻干燥，得到淡黄色粉末即为β-D-葡聚糖产品。
上述所得的β-D-葡聚糖，其纯度是77.96%。
实施例5
一种产朊假丝酵母细胞壁的β-D-葡聚糖，通过包括如下步骤的方法制备而成：
（1）、产朊假丝酵母细胞的获取
将产朊假丝酵母用去蛋白土豆汁培养11h，取去蛋白土豆汁培养液50mL，离心(15500g/4℃/10min，冷冻离心机)，然后用去离子水冲洗两遍，即得到产朊假丝酵母细胞，可将细胞沉淀部分保存于冰箱（4℃）中；
所用的产朊假丝酵母（Candidautilis），保藏编号CICC1769；
（2）细胞的诱导自溶
将步骤（1）获得的产朊假丝酵母细胞诱导自溶，即溶酶体将酶释放出来将自身细胞降解使内容物流出。酵母自溶菌体浓度12％(w／w)，pH6.0，4％NaCl和58℃，105rpm振荡自溶。在此条件下，酵母细胞诱导自溶的时间为23h即可。自溶后离心，并用去离子水冲洗两遍，；
（3）高温浸提
用pH7.0的磷酸盐缓冲液配成质量浓度为12%的酵母细胞壁悬浮液于250mL三角瓶中(加入直径0.5cm玻璃珠),抽提条件为时间3h、温度120℃、料液比1：8进行高温浸提，浸提时间8h、温度为80℃，离心，用去离子水洗涤3次，即得沉淀；
（4）超声波破壁
用300mL去离子水将每个样品沉淀悬浮，在700w功率条件下破壁60min，然后在离心力为3500g，温度为10℃下离心得细胞壁沉淀；
（5）高温抽提
用pH7.0的磷酸盐缓冲液将酵母细胞壁悬浮液配成质量浓度为18%的溶液于250mL三角瓶中(加入直径0.5cm玻璃珠)，高温抽提条件是时间3h、温度120℃、料液比为1：8，高温抽提时间为8h、温度110℃，离心，沉淀用去离子水洗涤3次，得到沉淀；
（6）脱脂
利用脂肪能溶于有机溶剂的性质，在索氏提取器中将样品用无水乙醇溶剂反复萃取，提取样品中的脂肪后，所得的物质即为去脂肪的葡聚糖粗品；
（7）酶解去蛋白
已脱脂的粗品葡聚糖用pH7.0的磷酸缓冲液配成14％(w／w)的悬浮液，然后用质量分数为0.2g/L的中性蛋白酶在55℃的条件下进行酶解处理1h，反应结束后，得到的沉淀用水洗涤3次，离心，再加水使其充分混匀后于100℃加热8分钟灭酶，离心，冷冻干燥，得到淡黄色粉末即为β-D-葡聚糖产品。
上述所得的β-D-葡聚糖，其纯度是76.23%。
综上所述，本发明的一种从产朊假丝酵母细胞壁中提取β-D-葡聚糖的方法，利用诱导自溶-高温浸提-超声波破壁-高温抽提-脱脂-酶解的提取方法。结果由此表明，其提取率较高，相比传统的提取方法，采用了一种条件较温和的提取β-D-葡聚糖方法，操作过程简单易行、快速，更重要的是避免了酸碱试剂对产品带来的降解作用。具有辅助降血压降血糖、保肝护肝、保护胃黏膜，防治脑供血不足以及心血管疾病、改善微循环、增强免疫力等保健功能。
以上实施例仅用于说明本发明的内容，除此之外，本发明还有其他实施方式，但凡本领域技术人员因本发明所涉及之技术启示，而采用等同替换或等效变形方式形成的技术方案均落在本发明的保护范围内。