专利名称：：Cgi-135基因在早期判断急性髓系白血病预后中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及人类CGI-135基因的一种用途。
背景技术：
：急性髓系白血病(AcuteMyeloidLeukemia,AML)是一种异质性髓细胞肿瘤，也称急性非淋巴细胞性白血病，常进展迅速，其特点是由造血干细胞恶变而形成的原始细胞克隆取代了正常骨髓造血。由于白血病细胞代替了正常血细胞，它们不具备正常血细胞的功能，由此导致贫血，血小板和粒细胞减少而引发一系列并发症。若不经过治疗，存活期一般不超过半年。有的病例从诊断到死亡，甚至不过一周，死亡的主要原因是出血和感染。目前标准化疗可以获得约7080%的完全缓解(CompleteRemission,CR)率，但大部分CR后的患者终将复发，甚至一部分患者难以达到CR而成为难治性白血病，治疗无效而死亡。目前对AML的预后判断主要根据患者年龄、染色体核型等指标。但即使是年龄、染色体核型等因素完全相同的患者，他们的预后也不尽相同。因此，为了获得更好的治疗效果，提高患者的存活率，需要早期判断AML的预后指标指导制定合适的治疗方案。故寻找早期判断预后的敏感性指标具有重要现实意义。但是，现阶段有效的判断指标严重不足，从基因水平上研究寻找预后相关的指标已成为研究热点。
发明内容本发明的目的在于提供一种人类CGI-135基因的用途。发明人通过成熟的荧光定量PCR技术研究发现，CGI-135mRNA急性髓系白血病患者细胞中均有表达。通过荧光定量PCR检测了77例初次诊断并治疗前的急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞的CGI-135mRNA表达量，并设立缺铁性贫血、特发性血小板减少性紫癜患者为对照。将所测结果与临床特征、治疗反应及随访结果分析比较，发现CGI-135表达mRNA量大于1.5%的患者，其复发、难治的比例显著高于表达量小于1.5%的患者。CGI-135mRNA表达量大于1.5%患者的生存期也显著縮短，随访1年时，其总生存率仅为48%，而CGI-135mRNA表达量小于1.5%患者的总生存率高达78%。由此表明，CGI-135mRNA表达量的多少，与患者病情未来的发展密切相关表达量高，患者治疗后易复发且治疗难度大；表达量低则与之相反。可见，CGI-135mRNA的表达量可以作为判断AML患者预后的指标，为个体化治疗方案的设计提供了理论依据。图1是CGI-135mRNA表达水平与AML患者生存时间的关系图；图2为基因PCR产物的电泳图，图中，M为标记带，l为P-actin产物带，8为CGI-135产物带；图3是cDNA相对浓度梯度_ACT关系图。具体实施例方式选取南方医院血液科2005年9月至2008年7月期间诊治的初发AML患者77例，根据临床表现、细胞形态学和免疫分型及细胞遗传学特征全部符合原发性AML诊断标准，记为病例组，其特征如表1所示；选取20例非恶性血液病患者为对照，诊断及疗效标准参照张之南《血液病诊断及疗效标准》。病例组中，48例患者随访1年以上。表l病例组特征表病例数百分比/%年龄[中位数(范围)]34(17—67)性别男4255女3545FAB分型Ml23M22634M334M41621M52228系列不确定810核型正常4052t(8;21)79t(2;17)/t(3;5)/+8/+10/+2179T(15;17)34未知2026诱导方案D+A4457IDA+A1722T+A912H+A7977例中细胞表面抗原CD33、CD13共同表达47例，伴随CD34表达55例，伴随CD14、CDllb表达17例，伴随淋系抗原表达(CD7、CD9、CD19、CD20)35例。完成染色体核型分析的有57例，染色体异常的17例，其中t(15;17)3例，t(8;21)3例，t(8;21)伴-X2例，t(8;21)伴-Y2例，t(2;17)1例，t(ll;17)1例，t(3;5)1例，+81例，+8伴19q22缺失1例，+101例，+211例。首次诱导化疗方案均采用标准剂量DA(柔红霉素+阿糖胞苷)方案(M3患者予以全反式维甲酸联合化疗)，再次诱导未获得CR者改用FLAG(氟达拉滨30mg/m2dl-5+阿糖胞苷lg/m2dl-5)、CAG(阿糖胞苷10mg/m2dl-14+阿克拉霉素10mg/m2dl-4)等方案，获得CR后采用TA(吡柔比星20mg/m2dl-3+阿糖胞苷150mg/m2dl-7)、MA(米托蒽醌8mg/m2dl-3+阿糖胞苷150mg/m2dl-3)、DA、中剂量阿糖胞苷(2gdl_5)治疗方案交替使用，有5例行自体干细胞移植，3例异基因干细胞移植。CR后治疗疗程中位数4(014)，随访中位时间374(3-1440)天。20例非恶性血液病患者骨髓为对照，其中9例为缺铁性贫血，11例为特发性血小板减少性紫癜，男性和女性分别为5例和15例，中位年龄36岁(5-58岁)。依据治疗反应及生存时间不同，将AML患者分成首疗程CR与NR组、1年内存活与l年内死亡组。排除M3型、诊断后首疗程化疗未完成，或化疗l-2个疗程后失访的患者。故77例AML病例中，有52例列入疗效分析，其中48例随访1年以上。使用SPSS13.0进行统计分析，选取的模型为两组间比较Mann-WhitneyUtest;两变量间相关分析Spearmanrankcorrelationanalysis;率的比较chi-squaretest;生存分析Kaplan-Meier曲线；单因素分析、多因素分析CoxRegression。表达量=2—ACTX100%。(CT值是荧光达到阈值的循环数)实验结果检测患者骨髓细胞CGI-135mRNA基因的表达量，其结果如下表所示骨髓单个核细胞CGI135mRNA表达水平与AML亚型关系<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>在26例首疗程获CR患者组中，CGI-135mRNA表达量的中位数为0.68%(0.00%4.36%)，29例首疗程NR组中，CGI-135mRNA表达量的中位数为1.84%(0.06%23.32%)，统计分析结果有显著性差异，Z值为-2.883，P值为0.004。以CGI135mRNA表达量1.5%为界评价表达水平高低在可评价的52例AML患者中有25例为高表达，27例为低表达。二组中分别有难治性AML患者病例15例(58.6%)和9例(32.0%)，二组比较差异无显著性(x2=1.997，P=0.158)。随访至少1年者在高表达组25例中l年内死亡13例(52.0%，死因为白血病原发耐药10例，化疗后感染3例)；低表达组23例中l年内死亡5例(21.7%，死因为白血病原发耐药5例)。在高表达组的死亡率明显高于低表达组(x2=4.680，P=0.028)。CGI-135mRNA表达水平对AML患者生存时间的影响如图1所示。23例CGI_135mRNA表达量低于1.39%的AML患者中，1年内死亡5例，占总数的22%;25例CGI-135mRNA表达量高于1.39%的AML患者中，1年内死亡13例，占总数的52%，统计分析结果显示两组间差异具有显著意义，P值为0.031，表明CGI-.135mRNA表达量高的AML患者更容易死亡。通过计算表达量与患者1年内死亡之间的敏感性和特异性，发现表达量2—"TX100X大于1.5%的患者可能在1年内死亡，其敏感性52%，特异性72%。以上数据表明，CGI-135mRNA的表达量可以作为判断AML患者预后的有效指标，为个性化治疗方案的设计、改善预后提供理论依据。CGI-135基因的表达量的一种检测方法为提取患者单个骨髓细胞中的总RNA，逆转录成cDNA;设计PCR引物，应用实时荧光定量PCR检测AML患者CGI-135基因的mRNA的表达量。本实验方案中，具体的实验步骤为1.提取患者骨髓总RNAa)抽取患者骨髓液25ml，添加肝素抗凝，用淋巴细胞分离单个核细胞，EP管收集510X106个细胞，加入lmlTRIzol;b)加入O.2ml氯仿后盖紧管盖，剧烈振荡30s，静置5min后，4t:下12000rpm离心15minjc)将上层水相转移到一个新的EP管中，加入lml异丙醇并混匀，室温放置5min后，4。C下12000rpm离心15min;d)弃上清，加入lml75%的乙醇洗涤，室温放置5min后，4t:下12000rpm离心5min;e)弃上清，空气干燥10min，加入无RNase的水20y1，反复抽吸使RNA溶解；2.总cDNA合成按TAKARA公司PrimeScriptTMRT逆转录试剂盒说明书进行。逆转录反应体系6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>逆转录反应条件，37。Clh40min，85。C4min，在PTC-200PCR仪上进行。3.测定CGI135基因表达量a)以上述cDNA为模板，用上游引物5'-GGAGGACCTGCTGAAGTTTG-3'(SEQID1)和下游引物5'ACGGCCAGGTAGAAGACGTA-3'(SEQID2)进行实时荧光定量PCR扩增，扩增片断204bp;选用P-actin作为内参，用上游引物5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'(SEQID3)和下游引物5'-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3'(SEQID4)，同时进行实时荧光定量PCR扩增，扩增片断186bp;反应条件为95t:、20s预变性，95t:、15s变性，6(rC、31s退火延伸，共40个循环;b)计算基因的表达量，计算方法为2—a"X100^，式中，-ACT=(CGI135的CT值-p-actin的CT值)。基因PCR产物的电泳图如图2所示。图中，M为标记带，l为P-actin产物带，8为CGI135产物带。由电泳图可知，引物具有很好的特异性。验证实验cDNA稀释成多个浓度梯度，对于每一个稀释样品，都同时进行基因和内参基因扩增，计算出各基因与内参基因的平均CT值以及ACT值，通过cDNA的相对浓度梯度对ACT值作图，其结果如图3所示。图中直线斜率均小于O.IO，绝对值接近于O，表明目的基因和内参基因的CT值差(ACT)几乎不随模板浓度变化而变化，目的基因和内参基因的扩增效率基本一致。通过检测CGI135mRNA的表达量，判断AML患者的病情发展或预后，可以针对性的设计治疗方案，减少治疗中的盲目性，提高患者的治愈率。序列表〈110〉南方医科大学〈120>CGI-135基因在早期判断急性髓系白血病预后中的应用〈130〉〈160>4〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1ggaggacctgctgEuagtttg<210>2〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列<400>23CggCC3ggt3g朋g3Cgt3〈210>3〈211>18<212〉DNA〈213〉人工序列〈400>3cgggaaatcgtgcgtgac〈210〉4〈211>19〈212>DNA〈213>人工序列〈400〉4c;aggEuaggEuaggctgg卿权利要求CGI-135基因在早期判断急性髓系白血病预后中的应用。全文摘要本发明公开了CGI-135基因在早期判断急性髓系白血病预后中的应用。通过荧光定量PCR检测了77例初次诊断并治疗前的急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞的CGI-135mRNA表达量。将所测结果与临床特征、治疗反应及随访结果分析比较，发现CGI-135mRNA表达量大于1.5％的患者，其复发、难治的比例显著高于表达量小于1.5％的患者。CGI-135mRNA表达量大于1.5％患者的生存期也显著缩短，随访1年时，其总生存率为48％，而CGI-135mRNA表达量小于1.5％患者的总生存率为78％。CGI-135mRNA的表达量可以作为判断AML患者预后的指标，为个性化治疗方案的设计提供理论依据。文档编号C12Q1/68GK101781682SQ20091021419公开日2010年7月21日申请日期2009年12月25日优先权日2009年12月25日发明者孟凡义,黄走方申请人:南方医科大学