专利名称：一种抗急性髓系白血病的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗急性髓系白血病的药物组合物，具体地说是一种含有苯扎贝特和甲 地孕酮的抗急性髓系白血病的药物组合物。
背景技术：
我国白血病的发病率为2. 76/105，其中急性髓系白血病(AML)年发病率最高，达 1.62/105。AML是白血病中较严重的一种，主要由于髓系造血干细胞的克隆异常导致异常造 血细胞的过度增殖，分化受阻及凋亡抑制所致。其发病率随年龄的增加而增加，其中数年龄 为65 70岁。临床上，急性髓性白血病的治疗较为棘手，一方面是由于其发病迅速，一方 面由于绝大多数患者为老年人，身体机能弱，常常无法耐受常规治疗。目前，临床上多采用联合序贯化疗治疗急性髓系白血病，即获得初始缓解(诱导 治疗)后进行缓解后治疗(巩固治疗)，国内外经典的一线方案主要有DA(柔红霉素+阿 糖胞苷)、MA (米托蒽醌+阿糖胞苷)、HA (三尖杉酯碱+阿糖胞苷)、IDA (去甲氧柔红霉素 +阿糖胞苷)。诱导治疗方案取决于患者的年龄和有无血液学疾病史，缓解后的巩固治疗方 案取决于细胞遗传学危险因素。如果患者对初始诱导治疗不敏感，则尝试放射治疗。骨髓 移植术也是白血病的有效治疗手段之一。虽然近年来联合化疗及骨髓移植术在治疗白血病 方面取得了长足进步，成人AML完全缓解率已达50% -80%，长期生存率为20% -30%，儿 童AML完全缓解率为70% -90%，长期生存率为30% -40%。但化疗由于严重的骨髓抑制 和心肝肾等重要脏器的损害而受到限制，放疗对人体的危害也很大，而骨髓移植则价格昂 贵且很难找到相互匹配的骨髓源，许多患者因苦寻不到配型相合的骨髓源而丧失了治疗时 机。AML-M3亚型(急性早幼粒细胞白血病)的治疗主要是使用全反式维甲酸诱导分 化，使用全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)有72% -95%的患者可取得完全 缓解，但全反式维甲酸对90%的AML患者缺乏理想的疗效。而且全反式维甲酸治疗APL完 全缓解后如继续使用全反式维甲酸巩固和维持，则多数患者短期内复发。一旦复发，多数患 者对全反式维甲酸不再起反应。对全反式维甲酸耐药目前尚缺乏有效治疗方法。叶酸受体(FR)是一种可以介导细胞内化，将叶酸摄取人真核细胞胞浆的一种高 亲和力受体，在正常组织中的表达高度保守，FRa仅只表达于特定上皮细胞，在大部分来 源于上皮组织的恶性肿瘤，如卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和鼻咽癌细 胞中均有高度表达，特别是妇科肿瘤，90%的卵巢癌细胞系都有叶酸受体的过度表达。与 FRa分布不同，FR0高表达于胎盘、粒单核细胞系中成熟的中性粒细胞、被激活的单核或 巨噬细胞及超髓系白血病细胞，在其它组织中几乎没有表达。在正常造血细胞中，FR3只 表达于粒单核细胞系，在中性粒细胞成熟过程中其表达水平升高5倍。不过正常造血细 胞的FRFR0不能与叶酸高度紧密结合。Ross等对43例各种白血病病例骨髓涂片的免 疫组织化学分析显示，在21例慢性粒细胞白血病和急性非淋白血病病例中有70%表达 FR3，在15例淋巴细胞白血病和7例毛细胞白血病中没有FR0表达(Ross JF，Wang H，Behm FG,等.Folate receptor type 旦 is a neutrophilic lineage marker and is diffreentially expressed inmyeloid leukemia. Cancer, 1999 ;85 :348_357)。这提不， FR3主要表达在髓细胞白血病细胞中。由于髓细胞白血病细胞特异性高表达0亚型叶酸 受体，因此0亚型叶酸受体成为叶酸受体介导的髓细胞白血病靶向治疗的潜在靶标。关于 叶酸受体介导治疗各种肿瘤的靶向脂质体已有较多的报道，中国专利200310108850. 5(专 利权人上海复旦张江生物医药股份有限公司，授权公告日2008年10月8日)及陆伟跃等 (陆伟跃，刘敏，潘俊，力弘，马俊.叶酸-脂质体制备及对HeLa细胞靶向作用.上海医科大 学学报.2000 ;27(1) 4-8.)均对叶酸受体介导治疗各种肿瘤的靶向脂质体的制备做了报 道。甲孕酮和苯扎贝特联合使用对急性髓系白血病有一定治疗作用，并且要更好的安 全性，副作用很小(中国医药报-药学周刊2010年1月26日，B1版)。但其疗效与现有药 物相比尚未发现有优越性。如何使这种安全性高，副作用很小的药物组合物提高疗效，以替 代现有的白血病化疗药物并降低使用化疗药物的毒副作用是目前亟待解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明目的是提供了一种疗效显著高于甲孕酮与苯扎贝特组 合物的治疗急性髓系白血病的药物组合物。本发明所述抗急性髓系白血病的药物组合物，其特征在于所述药物组合物每单 位剂量中含有全反式维甲酸2mg、醋酸甲地孕酮l_2mg、苯扎贝特100_200mg及医药学上可 接受的载体，且醋酸甲地孕酮与苯扎贝特质量比为1 100。其中所述医药学上可接受的载体首选医药学上口服制剂或静脉注射制剂的载 体；优选叶酸受体靶向的脂质体药物载体。上述叶酸受体靶向的脂质体药物载体组成按摩尔百分比计优选为二硬脂酰磷脂 酰胆碱56%、胆固醇40%、PEG2000-磷脂酰乙醇胺3. 7%、叶酸-半胱氨酸-PEG3400-磷脂 酰乙醇胺0.3%。关于叶酸受体靶向的脂质体药物载体的制备已有文献报道，其中脂质体药物载 体的制备技术已较为成熟，在药物载体组成不变的情况下，在脂质体表面联接叶酸从而 提高脂质体针对叶酸受体的靶向性的叶酸受体靶向脂质体的制备方法可参考中国专利 200310108850. 5 (专利权人上海复旦张江生物医药股份有限公司，授权公告日2008年10 月8日)及陆伟跃等(陆伟跃，刘敏，潘俊，力弘，马俊.叶酸-脂质体制备及对HeLa细胞 靶向作用.上海医科大学学报.2000 ；27(1) 4-8.)所述的制备方法及相关文献。本发明所述的抗急性髓系白血病的药物组7物，优选的药物组成为全反式维甲酸2g醋酸甲地孕酮2g苯扎贝特200g二硬脂酰磷脂酰胆碱442g (0. 56mol)胆固醇155g(0. 4mol)PEG2000-磷脂酰乙醇胺 104g(0. 037mol)叶酸-半胱氨酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺15g(0. 003mol)。
上述抗急性髓系白血病的药物组合物(全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎贝特 复方叶酸靶向脂质体)的制备方法(1)按处方取全反式维甲酸、醋酸甲地孕酮、苯扎贝特溶于磷酸盐缓冲液 (pH7. 5)，置于65 70°C水浴中，保温，待用；(2)将硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、PEG2000-磷脂酰乙醇胺、叶酸-半胱氨 酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺溶于氯仿，用旋转蒸发仪将溶液中氯仿减压蒸去，形成脂质薄 膜；(3)取预热的全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎贝特磷酸盐缓冲液，对脂质薄膜 进行水化；水化温度为65 70°C。水化后室温下以1500rpm搅拌速度搅拌30分钟。然后 经液氮骤冷、-20°C冰箱续冷、冻融5个循环处理。然后用高压均质机使其通过孔径为lOOnm 聚碳酸脂薄膜，4°C下以3000rpm离心2h，得固体全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎贝特 复方叶酸靶向脂质体。低压冻干制成冻干粉后灭菌分装成1000份。申请人:在对醋酸甲地孕酮和苯扎贝特药物组合物的研究中发现，虽然醋酸甲地孕 酮和苯扎贝特药物组合物对急性髓系白血病的治疗作用不优于甲孕酮与苯扎贝特组合物， 而全反式维甲酸对大多数急性髓系白血病的治疗作用也较低，但全反式维甲酸对醋酸甲地 孕酮/苯扎贝特药物组合物之间有惊人的增效作用，对提高急性髓系白血病存活率的作用 尤为显著。故本发明提出了一种疗效显著高于甲孕酮与苯扎贝特组合物的治疗急性髓系白 血病的药物组合物，为急性髓系白血病的治疗又开辟了一条途径。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明内容不仅限于此。实施例1全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎贝特复方口腔崩解片剂的制备制剂处方全反式维甲酸2g、醋酸甲地孕酮lg、苯扎贝特100g、微晶纤维素80g，甘 露醇60g，低取代羟丙基纤维素30g，硬脂酸镁3g，聚乙烯吡咯烷酮35g，共制成1000片。制备方法取处方量全反式维甲酸、醋酸甲地孕酮、苯扎贝特、微晶纤维素，甘露 醇，低取代羟丙基纤维素，分别研细，过4号筛，混合，将聚乙烯吡咯烷酮溶于适量60%乙醇 中作为黏合剂，制成软材，湿法制粒，60°C鼓风烘干，过筛后，加硬脂酸镁，整粒，混勻，压片， 即得。崩解时限检查溶出度测定仪装上小杯，加入纯化水50ml为递质，温度为 (37. 0士0. 5) °C，加入1片到杯中，用秒表开始计时，直到药片完全崩解成颗粒并通过2号筛 的时间为崩解时间。按上述方法随机检查6片。结果表明本工艺制备的口腔崩解片全部在lmin内崩 解并通过筛网。全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎贝特复方口腔崩解片在服用时不需用水或只 需少量水，将片剂置于舌面，无需咀嚼，遇唾液即能崩解或溶解，然后借吞咽动力入胃，可方 便老人、儿童、吞咽困难或特殊环境下的患者用药，更适于急性髓系白血病患者人群。实施例2全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎贝特复方脂质体注射液的制备(1)将全反式维甲酸2g、醋酸甲地孕酮2g、苯扎贝特200g溶于磷酸盐缓冲液 (pH7. 5) 50ml置于65 70°C水浴中，保温，待用；
(2)将硬脂酰磷脂酰胆碱442g、胆固醇155g溶于氯仿，用旋转蒸发仪将溶液中氯 仿减压蒸去，形成脂质薄膜；(3)取预热的全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎贝特磷酸盐缓冲液50ml，对脂 质薄膜进行水化。水化温度为65 70°C。水化后用高压均质机使其通过孔径为50nm聚碳 酸脂薄膜。注射用水定容至5000ml，灭菌后分装为5ml/瓶。实施例3全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎贝特复方叶酸靶向脂质体的制备制剂处方全反式维甲酸2g醋酸甲地孕酮2g苯扎贝特200g 二硬脂酰磷脂酰胆碱442g (0. 56mol)胆固醇155g(0. 4mol)PEG2000-磷脂酰乙醇胺 104g(0. 037mol)叶酸-半胱氨酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺15g(0. 003mol)PEG2000-磷脂酰乙醇胺(2805. 497)购自德国Lipoid GmbH公司；叶酸-半胱 氨酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺购自美国Endocyte公司；磷脂酰胆碱及胆固醇均购自美国 Sigma公司制备方法(1)取全反式维甲酸2g、醋酸甲地孕酮2g、苯扎贝特200g溶于磷酸盐缓冲液 (pH7. 5) 50ml置于65 70°C水浴中，保温，待用；(2)将硬脂酰磷脂酰胆碱442g、胆固醇155g、PEG2000-磷脂酰乙醇胺104g、叶 酸_半胱氨酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺15g溶于氯仿，用旋转蒸发仪将溶液中氯仿减压蒸 去，形成脂质薄膜；(3)取预热的全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎贝特磷酸盐缓冲液50ml，对脂 质薄膜进行水化。水化温度为65 70°C。水化后室温下以1500rpm搅拌速度搅拌30分 钟。然后经液氮骤冷、-20°C冰箱续冷、冻融5个循环处理。然后用高压均质机使其通过孔 径为lOOnm聚碳酸脂薄膜，4°C下以3000rpm离心2h，得固体全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮 /苯扎贝特复方叶酸靶向脂质体。低压冻干制成冻干粉后灭菌分装成1000份。取上述脂质体样品上样至10cm Sepharose CL4B柱用磷酸盐缓冲液洗脱，分析全 反式维甲酸、醋酸甲地孕酮、苯扎贝特浓度，计算各自的包封率，结果表明上述脂质体中全 反式维甲酸、醋酸甲地孕酮、苯扎贝特包封率(均值)分别为90.7%、86.4%、92.5%。实施例4全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎贝特药物组合物对急性髓系白血病 NB4、KGla、U937细胞的体外作用研究将急性髓系白血病NB4、KGla、U937细胞培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、 100mg/ml链霉素的RPMI1640培养液，37°C,5% C02的培养箱中常规培养，复苏后，接种于含 10%小牛血清的RPMI1640培养液中培养，每2-3天传代1次，实验时取对数生长期细胞。 0. 4%台盼兰鉴定细胞活性在98%以上。取对数生长期NB4、KGla、U937细胞配成细胞终浓度为2 X 106个/ml的悬液，分别 接种于96孔培养板，每孔200 ill。
各种急性髓系白血病细胞株均分为四组，分别加入(A)苯扎贝特0.2g/ml+醋酸 甲地孕酮2X 10_3g/ml⑶全反式维甲酸2X 10_3g/ml (C)苯扎贝特0. 2g/ml+醋酸甲地孕酮 2X10_3g/ml+全反式维甲酸2X10_3g/ml(D)米托蒽醌1 X 10_5g/ml。细胞与药物共培养， 37°C,5% C02培养箱中培养10天后分别取培养细胞，PBS洗3次.70%冷乙醇固定，染色前 PBS洗，后加入50mg/L碘化丙啶，4°C，避光30min，用流式细胞仪计数凋亡细胞，计算出凋亡 细胞百分比。急性髓系白血病细胞的凋亡率(％，平均值士标准差)
“与A组比较p<0.01; 1)与0组比较p<0. 05实验结果表明，全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎贝特药物组合物对急性髓系 白血病NB4、KGla、U937细胞株的致凋亡作用显著高于醋酸甲地孕酮/苯扎贝特药物组合物 及米托蒽醌，且维甲酸对醋酸甲地孕酮/苯扎贝特药物组合物有增效作用。实施例5醋酸甲地孕酮/苯扎贝特药物组合物对全反式维甲酸(ATRA)耐药的急 性髓系白血病HL-60细胞的体外药效学研究HL-60/ATRA细胞的诱导取对数生长期的HL-60细胞1 X 106/ml加入1 X lO.mol/ LATRA,培养72h后用RPMI 1640洗涤，用不含ATRA的完全培养基培养2_3代后提高ATRA 浓度1倍，如此反复，经过4个月后诱导出在含1 X 10_8mol/L ATRA RPMI 1640维持培养基 中保持原细胞增殖和分化状态基本不变的细胞系，即全反式维甲酸耐药的HL-60/ATRA。将上述细胞配成细胞终浓度为2 X 106个/ml的悬液，分别接种于96孔培养板，每 孔200iU。然后分为三组，分别加入(A)苯扎贝特0. 2g/ml+醋酸甲地孕酮2X10_3g/ml(B) 全反式维甲酸2X10_3g/ml(C)苯扎贝特0. lg/ml+醋酸甲地孕酮1 X 10_3g/ml+全反式维甲 酸1 X 10_3g/ml。细胞与药物共培养，37°C,5% C02培养箱中培养7天后，用流式细胞仪检测 细胞表面分化抗原CDllb，检测细胞分化。A、B、C三组的HL-60细胞分化研究表明，C组92%的细胞出现⑶lib表达显著升 高，A、B两组细胞出现⑶lib表达显著升高的百分数分别为16%和9%。说明醋酸甲地孕 酮/苯扎贝特药物组合物对全反式维甲酸(ATRA)耐药的急性髓系白血病HL-60细胞有逆 转作用，有利于提高全反式维甲酸的诱导分化作用。实施例6全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎贝特药物组合物对急性髓系白血病 的体内药效学研究细胞培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI 1640培养 液，37°C、5% C02的培养箱中常规培养，复苏后，接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养液 中培养，每2-3天传代1次，实验时取对数生长期HL-60细胞配成细胞终浓度为5 X 106个/ ml的悬液。
雄性SCID小鼠，3 4周龄，每只静脉直接接种1ml上述HL-60细胞悬液。接种7 天后随机分为五组，每组6只。A组每次静脉注射给予生理盐水2ml/只，每日两次，共给药20天；B组每次静脉注射给予全反式维甲酸2mg/只，每日两次，共给药20天；C组每次静脉注射给予醋酸甲地孕酮2mg+苯扎贝特200mg/只，每日两次，共给药 20天;D组每次静脉注射给予实施例3制备的脂质体1份/只，每日两次，共给药20天；E组每次静脉注射给予阿糖胞苷2mg/只，每日两次，共给药20天；计数小鼠生存天数，根据公式计算各治疗组生命延长率生命延长率=(给药组 平均生存天数-生理盐水组平均生存天数)/生理盐水组平均生存天数X 100%。A-E组小鼠平均生存天数分别为(23. 2士 10. 05)天、(60. 3士 11. 04)天、 (55. 1 士 11. 07)天、(93. 1 士2. 87)天、(55. 0士7. 24)天。B-E 组生命延长率分别为 159.9%, 137. 5%,301. 3%U37. 1%D D组与各组比较均有显著差异(p < 0. 01)。结果表明全反式维甲酸/醋酸甲地孕酮/苯扎贝特叶酸靶向脂质体可使急性髓 系白血病小鼠存活率显著提高。
权利要求
一种抗急性髓系白血病的药物组合物，其特征在于所述药物组合物每单位剂量中含有全反式维甲酸2mg、醋酸甲地孕酮1-2mg、苯扎贝特100-200mg及医药学上可接受的载体，且醋酸甲地孕酮与苯扎贝特质量比为1∶100。
2.如权利要求1所述的抗急性髓系白血病的药物组合物，其特征在于所述医药学上 可接受的载体为叶酸受体靶向的脂质体药物载体。
3.如权利要求2所述的抗急性髓系白血病的药物组合物，其特征在于所述叶酸受体 靶向的脂质体药物载体组成按摩尔百分比计为二硬脂酰磷脂酰胆碱56%、胆固醇40%、 PEG2000-磷脂酰乙醇胺3. 7%、叶酸-半胱氨酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺0. 3%。
4.如权利要求1所述的抗急性髓系白血病的药物组合物，其特征在于所述药物组合 物组成为全反式维甲酸2g 醋酸甲地孕酮2g 苯扎贝特200g 二硬脂酰磷脂酰胆碱442g 胆固醇155gPEG2000-磷脂酰乙醇胺104g叶酸_半胱氨酸-PEG3400-磷脂酰乙醇胺15g。
全文摘要
本发明公开了一种抗急性髓系白血病的药物组合物，所述药物组合物每单位剂量中含有全反式维甲酸2mg、醋酸甲地孕酮1-2mg、苯扎贝特100-200mg及医药学上可接受的载体，且醋酸甲地孕酮与苯扎贝特质量比为1∶100。本发明的药物组合物可使急性髓系白血病的存活率显著提高，为临床治疗开辟了一条新途径。
文档编号A61K31/57GK101856359SQ201010171968
公开日2010年10月13日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者厉保秋 申请人:山东大学