Cd123特异性嵌合抗原受体重导向性t细胞及其使用方法
【专利说明】CD123特异性嵌合抗原受体重导向性T细胞及其使用方法
[0001] 优先权要求
[0002] 本申请要求对2013年3月15日提交的美国专利申请号13/844,048的优先权，其 包括附图在内通过提述完整并入本文。
[0003] 政府利益
[0004] 本发明在NIH准予P50CA107399、P01CA030206和M01RR0004下的政府支持下进 行。政府对本发明享有某些权益。
[0005] 发明背景
[0006] 急性髓性白血病（AML)的特征在于未成熟髓细胞在骨髓中的快速增殖，导致功能 障碍性造血作用[1]。急性髓性白血病（AML)的一线治疗几乎50年都保持基本未变，且AML 仍是具有不良预后的疾病。尽管标准诱导能诱导完全免除，但许多患者最终复发并死于该 疾病[2]。因此，开发AML的新治疗是至关重要的。
[0007] 同种异源造血细胞移植能在选定的患者中实现该疾病的治愈且突显了 AML对供 体来源的免疫疗法的易感性。另外，已鉴定白介素3受体alpha链（CD123)是潜在的免疫 治疗靶物，因为它在AML上相比于正常造血干细胞过表达。
[0008] 在AML细胞的免疫表型分析中的最近进展揭示了几种可充当未来治疗的靶物的 AML有关的细胞表面抗原[3]。实际上，已描述了使用靶向CD44、CD47、T细胞免疫球蛋白粘 蛋白-3 0?Μ-3)和白介素3受体alpha链（IL-3Ra ;CD123)的抗体来治疗AML的临床前研 究且在鼠模型中显示出有希望的抗白血病活性[3, 4]。⑶123在多种恶性肿瘤上表达，包括 急性和慢性髓性白血病、毛细胞白血病、B细胞系急性淋巴母细胞白血病、和胚细胞性浆细 胞样树突细胞赘生物。另外，⑶123通常不在正常造血干细胞上表达，如此使得⑶123称为 理想的免疫治疗靶物。而且，已完成了 CD123特异性治疗的两个1期试验，其中两种药物均 展现较好的安全性概况（临床试验政府ID:NCT00401739和NCT00397579)。不幸的是，这 些CD123靶向性药物具有有限的功效，表明可能需要其他的且更有力的靶向CD123的治疗 来观察抗白血病活性。
[0009] 用于治疗AML的一种可能更有力的备选疗法是使用表达嵌合抗原受体（CAR)的T 细胞，该嵌合抗原受体以不依赖于MHC的方式将T细胞特异性重导向（redirect)到细胞表 面肿瘤有关的抗原（TAA) [5]。在大多数情况中，CAR包含来自单克隆抗体的单链可变片段 (scFv)，其融合于⑶3ζ的信号传导域，且可以含有共刺激内在域（endodomain)[5]。几个 研究组已开发了靶向多种抗原的CAR用于治疗B细胞恶性[6-10]且许多已进展到在1期 临床试验中评估表达CAR的T细胞[11-15]。相比之下，用于治疗AML的CAR工程化的T细 胞仍然较少[16, 17]。
[0010] 尽管AML的目前治疗方案能在选定的患者中实现完全的应答，但许多最终会复 发，凸显了对可以引起更持久应答的新治疗的需要。目前正开发多种以AML为目标的免疫 疗法，包括抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞、同种反应性天然杀伤细胞和树突细胞疫苗。例 如，Oka和同事显示WiIms的肿瘤1肽疫苗接种能在AML患者中产生临床和免疫应答[33]。 然而，这些靶向性疗法是HLA依赖性的。为此，将期望设计一种靶向性治疗物如CAR，其能以 不依赖于HLA的方式将T细胞特异性重导向到选择性靶物AML细胞。
[0011] 发明概述
[0012] 开发含有⑶123特异性scFv的嵌合抗原受体（CAR)的家族来靶向⑶123上的不 同表位。在一些实施方案中，这类⑶123嵌合抗原受体（⑶123CAR)基因包含抗⑶123scFv 区符合阅读框地融合于经修饰的IgG4铰链区，所述经修饰的IgG4铰链区包含IgG4间隔区 的改变，其将消除Fc受体结合。在一个实施方案中，经修饰的IgG4铰链区包含S228P取代、 L235E取代、和任选地N297Q取代。所述⑶123CAR基因还包含至少一个共刺激信号传导域； 和T细胞受体（TCR)zeta链信号传导域。在一些实施方案中，所述⑶123CAR基因包含选自 SEQ ID NO: 1，SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核苷酸序列。在其他实施方案 中，CD123CAR基因编码包含SEQIDN0:9;SEQIDN0:10，SEQIDN0:11或SEQIDN0:12 的氨基酸序列。
[0013] 根据下文描述的实施方案，CD123CAR基因可以是插入载体（例如病毒载体）中的 表达盒的一部分。如此，人T细胞的群体可由该载体转导，导致该T细胞表达⑶123CAR基 因。当在健康供体T细胞（⑶4/⑶8)中表达时，⑶123CAR重导向T细胞特异性和介导针对 ⑶123+细胞系以及原代AML患者样品的有力的效应器活性。⑶123CAR T细胞不显著改变 体外粒细胞/巨噬细胞和红细胞集落形成，表明在AML细胞上与免疫细胞相反的不同效果。
[0014] 此外，从患有活性AML的患者获得的T细胞可修饰为表达⑶123CAR基因且能体 外裂解自体同源AML胚细胞。这些结果表明CD123CAR转导的T细胞可用作治疗高风险 AML的免疫疗法。因此，根据一些实施方案，提供治疗受试者中AML的方法，其中这类方法 包括对所述受试者施用用第一⑶123CAR基因转导的第一 T细胞群体。该方法可进一步包 括另外的步骤即对所述受试者施用用第一 CD123CAR基因转导的第一 T细胞群体与用第二 ⑶123CAR基因转导的第二T细胞群体的组合。在一些实施方案中，第一⑶123CAR基因包 含选自SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的核苷酸序列。第二CD123CAR基因也可以包含选自 SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的核苷酸序列，然而，第二CD123CAR基因的核苷酸序列不能与 对第一⑶123CAR基因选定的核苷酸序列相同。这引起使用用两种或更多种不同⑶123CAR 转导的T细胞群体的AML组合治疗，其相比于使用单一 CD123CAR转导的T细胞群体可导致 协同效果。
[0015] 附图简述
[0016] 图1显示⑶123特异性CAR可在健康供体人T细胞中表达。（A)含有经修饰的 IgG4铰链、CD28的经修饰的跨膜和胞内信号传导域、和CD3 ζ信号传导域的CAR的示意图。 还指示了 T2A核糖体跳跃（skip)序列和截短的EGFR(EGFRt)转导标志物。（B)源自单个健 康供体的用模拟物和慢病毒转导的T细胞的代表性表型。在免疫磁性选择和一轮扩增后， 经CAR修饰的T细胞用生物素化抗Fc或生物素化抗EGFR，接着是缀合有PE的链霉亲合素 和抗TCR α / β、抗⑶4或抗⑶8染色，，并通过流式细胞术分析。象限放置基于用同种型对 照的染色，且指示了落入每个象限的细胞百分比。（C)在免疫磁性选择和一轮扩增后来自3 个不同健康供体T细胞系的指定细胞表面标志物的表达。数据代表均值土SEM。
[0017] 图2显示表达⑶123特异性CAR的T细胞裂解表达⑶123的肿瘤细胞系。（A)对 瞬时转染以表达⑶123 (顶部，黑色线）或⑶19 (底部，黑色线）的293T细胞的流式计量学 (Flow kilometric)分析。将用亲本模拟物转导的293T细胞用抗⑶123或抗⑶19抗体染 色（灰色填充，顶部和底部）来测定背景表达水平。⑶表达⑶123-CAR的T细胞（26292和 32716)对表达CD123(293T-CD123)或CD19(293T-CD19)的293T细胞的特异性细胞毒性，通 过铬释放测定法测量。数据代表一式三份孔的均值+S.D. (C)对AML细胞系KGla、用EBV转 化的LCL细胞系和CML细胞系K562上的CD123的流式计量学分析。在每个柱状图中指示了 ⑶123染色为阳性的细胞（黑色线）对同种型对照（灰色填充）的百分比。（D)⑶123-CAR T细胞（26292和32716)对CD19+CD123+LCL细胞系和CD19-CD123+细胞系KGla的特异性细 胞毒性，通过铬释放测定法测量。分别使用表达LCL的0KT3 (LCL-0KT3)和⑶19-⑶123-K562 细胞系作为阳性和阴性对照细胞系。数据代表一式三份孔的均值+S. D。
[0018] 图3显示⑶123特异性T细胞释放INF- γ和TNF- α且应答表达⑶123的靶细胞 而增殖。将来自3个健康供体的CD123CAR T细胞或对照配对的T细胞与指定的细胞系以 10:1的Ε:Τ共培养24小时，并通过Luminex多重珠 （multiplex bead)技术量化IFN-γ和 TNF- α的释放。⑶将配对的用CFSE标记的⑶19或⑶123特异性T细胞与指定的刺激细 胞系以2:1的Ε:Τ共培养96小时，并通过流式细胞术分析用于CFSE稀释。将未刺激的T 细胞（填充的柱状图）用作基线T细胞增殖对照。
[0019] 图4显示在与原代AML样品共培养后通过⑶123特异性CAR对多种⑶4和⑶8效 应器功能的活化。将配对的CAR工程化的T细胞与3份不同的原代AML患者样品（AML 179、 373和605)共培养6小时并分析表面⑶107a表达和胞内IFN-γ或TNF-α产生。（A，条状 图）.表达CD107a的DAPI-CD3+CD8+EGFRt+细胞的百分比。数据代表均值+S. D. (Α，饼状 图）.经历脱粒和产生IFN- γ和/或TNF- α的CD3+CD8+EGFRt+细胞的分数在饼状图中绘 出。（B)来自同一实验的DAPI-CD3+CD4+EGFRt+群体数据，如A和B中描述的。（C)将配对 的用CFSE标记的⑶19或⑶123特异性T细胞与指定的刺激细胞以2:1的E:T共培养72 小时，并通过对于CFSE稀释的流式细胞术在DAPI⑶3+EGFRt+群体中分析。LCL和K562细 胞系分别充当阳性和阴性27对照。PreB-ALL 802是对⑶19和⑶123为双阳性的原代患者 样品。象限放置基于未刺激的T细胞。
[0020] 图5显示原代AML细胞由⑶123特异性T细胞特异性靶向。（A)将配对的⑶19或 ⑶123特异性T细胞与用51Cr标记的⑶34+原代AML样品以25:1的E:T共培养4小时。 LCL和K562细胞系分别充当阳性和阴性对照。Pre B-ALL802是对⑶19和⑶123为双阳性 的原代患者样品。数据代表一式三份孔的均值+S.D. (B) (A)中来自3份原代AML患者样品 的AML胚细胞的特定裂解。数据代表均值土SEM。使用不配对Student' s t检验将26292 和 32716 与 CD19R 比较，*，ρ〈0· 05,林，ρ〈0· 0005。
[0021] 图6显示表达⑶123CAR的T细胞在体外对正常和白血病祖细胞的作用。（Α和Β) 通过⑶34免疫磁性选择选出⑶34+脐带血（CB)细胞（η = 3)并与⑶19或⑶123特异性配 对的T细胞或仅培养基（未处理）以25:1的Ε:Τ共培养4小时。然后，将细胞铺板于半固 态甲基纤维素祖细胞培养14-18天并对粒细胞-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM，A)和红 系爆发集落形成单位（burst forming unit erythroid) (BFU-Ε,Β)集落的存在打分。将百 分比相对于⑶19特异性T细胞对照标准化。数据代表3份不同CB样品的均值土SEM。（C) 免疫磁性地选择⑶34+原代AML患者样品（AML 493、519或545)并与⑶19或⑶123特异 性配对的T细胞或仅培养基（未处理）以25:1的E: T共培养4小时。然后，将细胞铺板于 半固态甲基纤维素祖细胞培养14-18天并对白血病集落形成单位（CFU-L)的存在打分。将 百分比相对于⑶19特异性T细胞对照标准化。数据代表3份不同原代AML患者样品的均 值土SEM。使用不配对 Student's t 检验将 26292 和 32716 与 CD19R 比较，*，ρ〈0· 05。（D) 用任一⑶123靶向性CAR构建体（26292或32716)处理的来自⑷的CB或来自（C)的AML 细胞的组合的集落形成，相对于⑶19R标准化。使用不配对Student' s t检验，*，p〈0. 05。
[0022] 图7显示源自AML患者的⑶123CAR重导向的T细胞在体外特异性裂解自体同源 胚细胞。（A)将来自3名AML患者的T细胞慢病毒转导以表达⑶19R、26292或32716CAR。 显示在转导后19天来自AML 722的T细胞系。（B)用于51Cr释放测定法的在靶细胞上的 ⑶123表达。指示每份样品的⑶123+细胞百分比和相对荧光指数（RFI)。（C)使用从3份 AML患者样品工程化的T细胞作为效应器和51Cr标记的自体同源富集CD34的胚细胞作为 靶细胞进行的4小时自体同源杀伤测定法的结果。数据代表一式三份孔的均值+S. D。
[0023] 图8显示如由对NSG小数的生物发光成像显示的肿瘤大小的变化，该小鼠在注射 经修饰以表达萤火虫萤光素酶的AML细胞系KGl后5天（第5天）用含有S228P+L235E突 变或S228P+L235E+N297Q突变的CD123CAR转导的T细胞（26292)处理。
[0024] 图9显示嵌合抗原受体（CAR)的示意图，依照一些实施方案其具有抗原特异性单 链Fv、铰链区、共刺激信号传导域、和T细胞受体zeta链信号传导域。（图像来自Urba WJ 和 Longo DL N Engl J Med 2011 ;365:754-757)。
[0025] 图10显示依照一些实施方案具有L235E突变和S228P突变的32716CAR构建体 ("32716CAR(S228P+L235E)"）的示意图连同 32716CAR(S228P+L235E)构建体的核苷酸序 列（SEQ ID N0:1-反义链（顶部编号链）；SEQ ID N0:5-有义链（底部未编号链））和 32716CAR(S228P+L235E)构建体的氨基酸序列（SEQ ID N0:9)。突变粗体显示。
[0026] 图11显示依照一些实施方案具有L235E突变和S228P突变的26292CAR构建体 ("26292CAR(S228P+L235E)"）的示意图连同 26292CAR(S228P+L235E)构建体的核苷酸序 列（SEQ ID N0:2-反义链（顶部编号链）；SEQ ID N0:6-有义链（底部未编号链））和 26292CAR(S228P+L235E)构建体的氨基酸序列（SEQ ID N0:10)。突变粗体显示。
[0027] 图12显示依照一些实施方案具有L235E突变、S228P突变和N297Q突 变的 32716CAR构建体（"32716CAR(S228P+L235E+N297Q)"）的示意图连同 32716CAR(S228P+L235E+N297Q)构建体的核苷酸序列（SEQ ID N0:3-反义链（顶部编号 链）；SEQ ID N0:7-有义链（底部未编号链））和32716CAR(S228P+L235E+N297Q)构建体 的氨基酸序列（SEQ ID NO: 11)。突变高亮、粗体和划线显示。IUPAC碱基编码R对应于A 或G，而IUPAC碱基编码Y对应于T或C。
[0028] 图13显示依照一些实施方案具有L235E突变、S228P突变和N297Q突 变的 26292CAR构建体（"26292CAR(S228P+L235E+N297Q)"）的示意图连同 26292CAR(S228P+L235E+N297Q)构建体的核苷酸序列（SEQ ID N0:4-反义链（顶部编号 链）；SEQ ID N0:8-有义链（底部未编号链））和26292CAR(S228P+L235E+N297Q)构建体 的氨基酸序列（SEQ ID NO: 12)。突变粗体显示。IUPAC碱基编码R对应于A或G，而IUPAC 碱基编码Y对应于T或C。
[0029] 图14显示原代AML样品和脐带血上的⑶123表达。（A)原代AML细胞上⑶123表 达的代表性例子。将细胞在DAPI系⑶34 +群体上设门并评估⑶123表达（黑色-同种型 对照，红色-抗⑶123)。（B)在DAPI系⑶34+群体中表达的⑶123阳性细胞的百分比。 每个点代表单个样品。（C)DAPI系⑶34+群体中的⑶123相对荧光指数（RFI)。RFI通过 将抗⑶123细胞的中值除以同种型对照染色细胞的中值来计算。（D) AML 605 (红色）、AML 722(蓝色）和脐带血样品（灰色）上⑶123表达的柱状图覆盖。同种型对照以黑色显示。<