体细胞基于小分子转化为神经嵴细胞的制作方法
【专利说明】体细胞基于小分子转化为神经嵴细胞 发明领域
[0001] 本申请涉及一种基于化学确定成分培养基诱导的关联步骤，将体细胞分化成多能 神经嵴细胞的方法。神经嵴细胞能够分化成众多细胞类型如施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细 胞或脂肪细胞。
[0002] 背景
[0003] 通过异位表达4种关键的发育基因 c-myc、Sox2、0ct4和Klf4,使体细胞再编 程成经诱导的多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells)的赢得诺贝尔奖的方 法是获得能够分化成任何细胞类型的患者特异性多潜能细胞的有力工具（Takahashi和 Yamanaka，2006)。最近，不同研究已经报告，细胞类型特异性基因还可以直接将一个体细胞 类型转化成另一个体细胞类型，这是一种作为细胞转化或转分化报道的方法（Vierbuchen 和Wernig，2011)。这种方法代表一种获得多种确定的细胞用于临床和研究的有前景策略， 从而避免潜在致肿瘤的多潜能阶段。
[0004] 已知的细胞转化或再编程策略的重大缺陷是要求引入异位基因，所述异位基因可 能对已转化细胞的稍后应用产生不利的影响。为了允许长期和稳定表达，异位基因经常不 得不稳定整合入基因组中。尽管可能紧密控制异位基因表达，但整合的基因可以具有不利 的影响。例如，引入原癌基因 c-myc增加嵌合动物中肿瘤形成的风险，原因在于c-myc再活 化（Okita等人，2007)。通常，基因组的复杂调节装置导致很难预测基因修饰的长期效果。
[0005] 为了避免再编程方案中基因整合的缺点，新方法通过小分子更换关键再编程基 因。Li等人通过将某些基因更换为调节特定信号传导途径的小分子如Wnt或TGF- β，产生 IPS细胞（Li等人，2012)。通过基于小分子抑制BMP、TGF β和GSK3b信号传导，基因介导 的成纤维细胞转化成神经元的产率和效率大大增加（Ladewig等人，2012)。与这些结果相 符，也已经证明小分子是指导干细胞分化的有价值工具。例如，对骨形态发生蛋白（BMP)和 TGF-β信号传导的抑制导致高度有效的干细胞的神经诱导（Chambers等人，2009)。
[0006] 并没有彻底理解小分子影响细胞命运决策的机理。尽管小分子可能足以诱导分 化，但是诱导细胞转化成多能性或另一个体细胞类型仍然需要异位基因表达。这可能归因 于以下事实：与干细胞分化成体细胞相比，改变终末分化细胞的表型成为不同的细胞类型 是一种非生理学过程。
[0007] 本文中提供将体细胞转化成多能神经嵴细胞的新方法，所述新方法完全基于小分 子处理和确定的培养条件并且不需要通过引入基因来遗传地修饰细胞。
[0008] 这种新方法利用将体细胞转分化成增殖性神经嵴样阶段的新型多激酶抑制物。神 经嵴细胞可以分化成多种细胞类型如施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。
[0009] 例如，可以通过将特定培养基组合以基于小分子抑制确定的信号传导途径，诱导 神经嵴细胞分化成施旺细胞。神经成熟的施旺细胞代表外周神经系统（PNS)的胶质细胞。 施旺细胞执行多种功能，如神经元的免疫保护、养分供应和髓鞘化。施旺细胞功能障碍是外 周神经系统的许多神经学病症（例如多发性硬化或髓鞘化疾病）的原因。
[0010] 重要地，这种新的细胞转化方法不需要表达任何异位基因，而仅基于化学处理。因 此，它代表有一种产生患者特异性神经嵴细胞或分化细胞如施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细 胞或脂肪细胞的有前景方法。
[0011] 发明概沐
[0012] 本文中提供一种从体细胞产生神经嵴细胞的方法，所述方法包括：
[0013] a)在补充有丙戊酸（valproic acid)的培养基中培养体细胞，
[0014] b)在补充有N-{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基）-苯甲酰 氨基]-吖庚烷-3-基}-4-羟基-3, 5-二甲基-苯甲酰胺的无血清培养基中培养步骤（a) 中获得的细胞。
[0015] 在一个实施方案中，该方法不包括通过引入基因遗传修饰体细胞或步骤（a)中获 得的细胞。
[0016] 在一个实施方案中，步骤b)包括以悬浮培养法培养细胞。
[0017] 在一个实施方案中，步骤b)的无血清培养基补充有骨形态发生蛋白（BMP)的抑制 物。在一个实施方案中，BMP的抑制物是头蛋白（noggin)。
[0018] 在一个实施方案中，步骤b)的无血清培养基补充有转化生长因子β (TGFP)的小 分子抑制物。
[0019] 在一个实施方案中，TGFI3的小分子抑制物是SB431542。
[0020] 在一个实施方案中，步骤b)的无血清培养基补充有糖原合酶激酶3 (GSK3 β )的小 分子抑制物。
[0021] 在一个实施方案中，GSK3 0的抑制物是3-(3-氨基-苯基）-4-(1-甲基-IH-吲 哚-3-基）-吡咯-2, 5-二酮。
[0022] 在一个实施方案中，步骤a)包括将细胞培养2天。
[0023] 在一个实施方案中，步骤b)包括将细胞培养7天。
[0024] 在一个实施方案中，体细胞是成纤维细胞。
[0025] 在一个实施方案中，体细胞是人细胞。
[0026] 在一个实施方案中，体细胞从患有神经疾病的受试者获得。
[0027] 在一个实施方案中，提供了通过根据任一个以上实施方案的方法获得的神经嵴细 胞。
[0028] 在一个实施方案中，该方法还包括
[0029] c)在适于神经嵴细胞分化成分化细胞的条件下温育步骤b)的产物，所述的分化 细胞选自施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。
[0030] 在一个实施方案中，提供了通过根据任一个以上实施方案的方法获得的施旺细 胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。
[0031] 在一个实施方案中，提供神经嵴细胞或分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或 脂肪细胞的生物样本库（biobank)。
[0032] 在一个实施方案中，使用神经嵴细胞或分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或 脂肪细胞作为神经疾病的体外模型。
[0033] 一个实施方案包括治疗性组合物，所述治疗性组合物包含神经嵴细胞或分化的施 旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞或包含这些细胞的生物样本库。
[0034] 一个实施方案包括N- {(3R，4R) -4- [4- (2-氟-6-羟基-3-甲氧基-苯甲酰基）-苯 甲酰氨基]-吖庚烷-3-基} -4-羟基-3, 5-二甲基-苯甲酰胺在从体细胞产生神经嵴细胞 的方法中的用途。
[0035] 一个实施方案包括3- (3-氨基-苯基）-4- (1-甲基-IH-吲哚-3-基）-吡 咯-2, 5-二酮在从体细胞产生神经嵴细胞的方法中的用途。
[0036] 以上实施方案的任一个实施方案可以单独或组合地存在。
[0037] 附图简沐
[0038] 图1 :鉴定增强神经干细胞（NSC)增殖并使成纤维细胞能转化为神经球样结构的 小分子。A :化合物B以剂量依赖性方式促进ESC-NSC增殖。通过ATP测定法分析增殖并且 显示2次实验的均数。B :用化合物B处理的成纤维细胞在悬浮培养时形成球状体样结构。 比例尺：200 μ m。C :化合物B的激酶选择性谱。橙色图标代表受抑制超过80%的激酶。D : 通过其他化合物单一或联合抑制化合物B靶（化合物靶在图注中括号内显示）对成纤维细 胞的球状体形成没有影响或具有更小影响。图中将增殖速率显示为悬浮培养第3日初始细 胞数目（左）和平均球状体直径（右）的倍数变化。条柱显示三次独立实验的均数+/-SD。 使用Student t检验评价数据。* :与DMSO对照相比，p〈0. 05。+ :化合物B与单一抑制物 相比，p〈〇. 05。E :使人成纤维细胞转化成经诱导的施旺细胞（iSC)的实验设计的示意图。
[0039] 图2 :人成纤维细胞转化成神经嵴样阶段。A-D :在转化第11日的次生球状体，同时 双极细胞从球状体长出并表达早期神经板标志物Soxl和巢蛋白（Nestin)。比例尺：50 μ m。 E :转化的神经嵴细胞（第18日）和成纤维细胞（第0日）的流式细胞术揭示出成纤维细 胞标志物⑶29下调和神经嵴标志物⑶271上调。下半小图显示平均荧光强度（MFI)的定 量。条柱显示三次独立实验的均数+/-SD并且使用Student t检验评价数据。F-I :在转 化第18日，细胞已经从球状体迀出并表达神经嵴标志物Snail、SoxlO、FoxD3和AN2。比例 尺：100 μm。J-M :神经嵴样细胞的非神经分化。在特定分化培养基中的培养导致脂肪细胞 (J)、平滑肌细胞（K)和软骨细胞（UM)的形成。比例尺：50 μm(J)，100 μm(K).
[0040] 图3 :过渡性前体细胞分化成经诱导的施旺细胞（iSC)。（A-D) iSC表达施旺细胞标 记蛋白。比例尺：50μπι。（E)转化效率。在第31日时PLP阳性细胞的定量。因背景信号 所致少量PLP阳性成纤维细胞。条柱显示均数+/-SD (η = 3)。使用Student t检验分析数 据。（F)来自第0日（成纤维细胞）、第7日（早期tP)、第11日（早期tP)、第18日（晚 期tP)、第39日（iSC)时的细胞和原代施旺细胞（pSC)的全转录组表达谱的主成分分析。 主成分l(x_轴）占数据集合变异的27. 4%并且主成分2 (y-轴）占据集合变异的16. 5%。 每种阶段由衍生自独立实验的至少两个数据点代表。在第39日聚类的转录组学概况显示 方案的稳健性。（G)与第0日细胞（成纤维细胞）相比，第39日细胞（iSC)中的基因集合 富集图（反应组学/R0NET)。红色节点代表iSC富集的基因集合，而蓝色节点代表成纤维 细胞富集的基因集合。将节点分组并且根据相关的基因集合按照它们的相似性注释；将共 有的基因表示为节点之间的绿线。将功能相关节点的聚类汇总并使用WordCloud注释。分 析来自至少两个独立测定法的数据。（H) iSC的全膜片钳分析。在从保持电位Vh =-80mV 起IOmV渐增阶式方案中从-70mV至+40mV获得电压依赖性电流。早期内向电流的不存在 证实电压依赖性Na+通道的缺乏，而外向组分与电压依赖性K +通道的存在相符。（I)在iSC 中，最大电压依赖性K+流比成纤维细胞中显著更高。条柱显示两个独立实验中测量的不同 细胞的均数+/ -SD(FB :n = 12 ;iSC :n = 7)。使用Student t检验分析数据。
[0041] 图4 :与神经元细胞共培养时iSC的功能。（A-C)在POL(A)、在细胞示踪物标记的 成纤维细胞（B)和iSC (C)上分别培养NSC衍生的神经元。比例尺：100 μ m。通过MAP2染色 区域（D)、神经突数目（E)和总神经突长度（F)分析，用iSC培养的NSC神经元形成更致密 和分支的网络。条柱显示均数+/-SD(η = 3)。使用Student t检验分析数据。*:p〈0. 05。 (G) iSC与原代大鼠 DRG神经元共培养。一些iSC形成通过MB染色（黄色）和神经丝（NF) 染色（品红）的共定位检测到的单个有髓鞘片段（箭头）。比例尺：20 μ m。
[0042] 图5 :表征用于生成iSC的人成纤维细胞。（A-C)人成纤维细胞不表达神经嵴细 胞标志物或施旺细胞标志物。（A)成纤维细胞的相差图像。比例尺：50 μm。（B)成纤维细 胞的流式细胞分析显示初始成纤维细胞群体不含有表达神经嵴标志物CD271的细胞。（C) 神经嵴细胞标志物和施旺细胞标志物的免疫染色。胞核用Hoechst染色可视化。比例尺： 50 μm。（D、E)成纤维细胞培养物和诱导的过渡性前体细胞不含有间充质干细胞（MSC)。通 过免疫染色（D)和流式细胞术（E)分析MSC标志物⑶146。使用衍生自胚胎干细胞的MSC 作为阳性对照。D中的比例尺：50 μm。
[0043] 图6 :化合物B处理介导球状体贴壁至层粘连蛋白基材。在POL上铺种两小时后 用化合物B或单一化合物B靶的抑制物生成的次生球状体。仅化合物B处理的球状体（上 部中间）已经贴壁并开始移行。在对照（DMSO)条件和单一抑制物条件下，漂浮的球状体已 经在孔的中心聚集。比例尺：200 μ m。
[0044] 图7 :(A、B)转化方案不产生神经元，如通过第31日时的阴性Map2染色所示。胞 核用Hoechst染色可视化。比例尺：100μπι。（C、D)转化过程期间的全基因表达谱。（C)相 对于第0日（成纤维细胞），在第11日（早期tP)、第18日（晚期tP)和第39日（iSC)时 差异性表达的基因（在至少1个时间点期间倍数变化>10)的热图。使用平均连锁和欧氏 距离，生成总体下调的基因（蓝色）和总体上调基因（红色）的聚类。生物学过程GO术语 用于聚类注释。对于每个阶段，分析来自至少两个独立测定法的数据。（D)显示神经营养因 子差异性表达的热图。Lo