基于气相色谱-质谱联用技术和形态的山羊转基因克隆胚胎质量评估差异代谢物的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及一种基于气相色谱-质谱联用技术和形态的 山羊转基因克隆胚胎质量评估差异代谢物的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 体细胞核移植技术（SCNT)能将体细胞在体外去分化，发育成具有全能性的胚胎， 这在临床上有广阔的应用前景。然而，SCNT技术过程复杂、影响因素多，通过SCNT技术获 得出生个体的效率也非常低，严重制约转基因大家畜的研究与应用。研究发现，缺乏有效的 胚胎评估体系，不能筛选出优质的移植胚胎是影响SCNT效率低下的主要原因之一。因此， 寻找一种更为客观、全面的评估胚胎质量和发育潜能的方法，筛选优质胚胎进行移植至关 重要。
[0003] 目前，胚胎评估最主要的方法是形态学观察，依据卵裂球形态、数目及分布、胚胎 色泽和细胞碎片等参数评估胚胎质量。虽然这种方法直观快速，但缺乏统一标准，观察者的 主观性使胚胎形态与发育潜能的评估出现偏差。另外，有胚胎碎片的胚胎可能有更好的发 育潜能，并且形态正常的胚胎也可能存在遗传或表观遗传缺陷。因此，仅仅通过形态学不足 以识别优质胚胎。因此如何有效筛选出优质的移植胚胎和提高转基因克隆的效率是本领域 技术人员亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于一种基于气相色谱-质谱联用技术和形态的山羊转基因克隆 胚胎质量评估差异代谢物的筛选方法。
[0005] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006] -种基于气相色谱-质谱联用技术和形态的山羊转基因克隆胚胎质量评估差异 代谢物的筛选方法，包括以下步骤：
[0007] (1)重构胚培养48h时，检查卵裂率，并依据形态将卵裂的胚胎分为高质量卵裂胚 胎组和低质量卵裂胚胎组，随机将各组胚胎分组放入囊胚培养滴中继续培养；
[0008] (2)第7. 5d统计囊胚率并分别收集高质量卵裂胚胎组和低质量卵裂胚胎组的囊 胚和胚胎代谢液；
[0009] (3)对收集的胚胎代谢液样品进行处理，并以囊胚培养液作为空白对照进行气相 色谱-质谱检测；
[0010] (4)对检测结果进行统计分析：用SmCA-P11. 5软件进行PCA、PLS-DA和0PLS-DA 分析胚胎代谢液的代谢组学测定结果，应用0PLS-DA模型中VIP值（VIP>1)以及t检验中 的P值（P〈〇. 05)来确定组间差异代谢物。
[0011]步骤⑴中根据重构胚培养48h后卵裂球数目、大小均一性和细胞碎片多少将胚 胎分为高质量卵裂胚胎组和低质量卵裂胚胎组；所述的高质量卵裂胚胎组卵裂球细胞数目 多8细胞，形态大小一致，胞质碎片〈10 %;所述的低质量卵裂胚胎组卵裂球细胞数目多8细 胞，形态大小不均匀，胞质碎片多10%。
[0012] 步骤（3)中胚胎代谢液样品进行处理的过程为：向胚胎代谢液样品中加入甲醇和 L-2-氯苯丙氨酸，混匀后离心取上清液进行真空浓缩干燥，然后加入甲氧胺盐试剂（20mg/ mL甲氧胺盐酸盐溶液）并混匀在37°C条件下孵育2h，最后加入BSTFA试剂（内含有1 % (v/v)TCMS)充分混匀后在70°C条件下孵育lh;冷却至室温（25±5°C)。
[0013] 所述胚胎代谢液样品、甲醇、L-2-氯苯丙氨酸的体积比为1 :3. 5 :0. 5。
[0014] 所述胚胎代谢液样品、甲氧胺盐试剂、BSTFA试剂的体积比为1 :0. 8 :1。
[0015] 所述离心的条件为4°C、12000rpm离心lOmin。
[0016] 步骤⑶中气相色谱-质谱检测的条件：色谱柱：DB-5MS毛细管柱；运载气体：氦 气；进气速度：3mL/min;通过毛细管柱的速度：lmL/min;升温程序：80°C保持0. 2min;然后 以10°C/min的速度上升至180°C;接着以5°C/min的速度上升至240°C;再以20°C/min 的速度上升至290°C;最后在290°C保持llmin;电子轰击离子源（El);离子化电压为70eV; 接口温度、传输流和离子源的温度分别为280°C、270°C和220°C;样品保留492s后，在35~ 600m/z的范围内，以100光谱/min的速率获得质谱数据。
[0017] 胚胎质量对于胚胎移植的成功与否至关重要，筛选出能评价胚胎质量的代谢标记 物对提高转基因克隆的效率有重要意义。本试验根据不同的形态标准（高质量:Avs低 质量：B)对山羊转基因克隆胚胎进行分组培养，体外发育至囊胚时，收集各组的囊胚和对 应的胚胎代谢液进行分析。结果发现，高质量胚胎组A组的囊胚率显著高于低质量胚胎组 B组（P〈0. 05)。应用气相色谱-质谱联用技术测定各组胚胎代谢液后，经PCA、PLS-DA和 OPLS-DA分析发现，组间代谢液中含有多种显著差异代谢物，这些差异物与胚胎的质量密切 相关。
[0018] 本发明技术方案结合胚胎的形态学评估（形态标准），首次尝试通过气相色谱-质 谱分析技术检测胚胎代谢物质的变化，分析其与胚胎发育潜能是否存在相关性，为寻找预 测山羊转基因克隆胚胎发育潜能的研究提供了参考，也有助于筛选出优质的移植胚胎和提 高转基因克隆的效率。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 本发明结合胚胎的形态评估，找出与山羊转基因克隆胚胎质量密切相关的代谢标 记物，为寻找预测胚胎发育潜能的研究提供了参考，有助于筛选出优质的移植胚胎和提高 转基因克隆的效率。
【附图说明】
[0021] 图1为胚胎构建流程、胚胎分组和代谢液收集图
[0022] 图2为SCNT和胚胎发育过程
[0023] 注：A:成熟卵母细胞（100X);B:去核（200X);C:注核（200X) ;D-G:2 细胞、4-8 细胞、16-32细胞和囊胚（200X)。
[0024] 图3为GC-TOFMS检测胚胎培养液样品的总TIC色谱图
[0025] 图4为PCA主成分分析
[0026] 注：a:不同卵裂质量组主成分分析；b:高质量胚胎组与空白对照组主成分分析； C:低质量胚胎组与空白对照组主成分分析；A:高质量卵裂胚胎组；B:低质量卵裂胚胎组；E:空白对照组（不含胚胎的培养液）。
[0027] 图5为PLS-DA分析各组胚胎代谢液
[0028] 注：A:高质量卵裂胚胎组；B:低质量卵裂胚胎组；E:空白对照组（不含胚胎的培 养液）。
[0029] 图6为0PLS-DA分析各组胚胎代谢液
[0030] 注：A:高质量卵裂胚胎组；B:低质量卵裂胚胎组；E:空白对照组（不含胚胎的培 养液）。
【具体实施方式】
[0031] 1材料与方法
[0032] 1. 1样品采集
[0033] 在山羊的繁殖季节（10~12月），从丹阳珥陵屠宰场采集废弃的非妊娠山羊的卵 巢，保存于含有庆大霉素的生理盐水中（37°C)，3h内运回实验室。在实验室内，用生理盐水 冲洗卵巢5遍后去除卵巢系膜。
[0034] 1.2主要仪器
[0035] 拉针仪（Narishige，PC-10)，锻针仪（Narishige，MF-900)，磨针仪（Narishige， EG400)，显微操作仪（Nikon，Ti-5)，融合仪（BTX，ECM2001)，体视显微镜（Nikon，C-DS)，GC 色谱仪（Agilent，7890A)，质谱仪（LECO,ChromaTOFPEGASUS4D)〇
[0036] 1. 3主要试剂
[0037] M2 (Sigma，M7167)，地美可辛（Sigma，D1925)，Quinn'sAdvantageCleavage Medium(Sage,ART-1027),Quinn,sAdvantageBlastocystMedium(Sage,ART-1029)
[0038] 1.4主要溶液配制
[0039] (1)细胞培养液：10% (V/V)胎牛血清（FBS)的高糖DMEM;
[0040] (2)细胞消化液：0? 25% (m/V，g/mL)Trypsin+0. 〇2% (m/V)EDTA;
[0041] (3)抽卵液：2% (V/V)FBS+HEPES缓冲的TCM199(H199);
[0042] (4)卵母细胞IVM液：10 % (V/V)FBS+5yg/mL促卵泡素（FSH) +0? 3IU/mL促黄体 素（LH) +1yg/mL0 -雌二醇的TCM199 (M199);
[0043] (5)显微操作液：7. 5yg/mL细胞松弛素B(CB) +10%FBS的H199 ;
[0044] (6)融合液：D-山梨醇 0? 25mol/L，醋酸?丐 0?lmmol/L，醋酸镁 0? 5mmol/L，Hepes 0. 5mmol/L,BSAlmg/mL〇
[0045] 1. 5试验方法
[0046] 1. 5. 1供体细胞的准备
[0047] 解冻本实验室制备的转人乳铁蛋白基因奶山羊成纤维细胞于6孔板中，5% 0)2培 养箱内用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养，待其生长