了研究神经疾病病理生理学的疾病相关性体外模型。将患者的特定体细胞直接转化为神 经嵴细胞代表了一项产生患者特异性神经嵴细胞生物样品库的容易获得和可重复的技术。 因此，在本发明的又一个优选方面，构思了包含患者特异性神经嵴细胞的生物样本库。在另 一个实施方案中，产生了包含从健康个体所获得的不同神经嵴细胞群体的生物样本库。如 本文所用的术语"生物样本库"意指从不同个体或物种取得的生物样品文库。标本和相关 数据的归档收集意图用于研究目的，旨在对付神经疾病如脱髓鞘病、多发性硬化、脊髓病、 实验性变应性脑脊髓炎（EAE)、急性弥散性脑脊髓炎（ADEM)、感染后或疫苗接种后脑脊髓 炎、周围神经病、神经鞘瘤、进行性神经性肌萎缩综合征、吉兰-巴雷综合征、慢性炎症性脱 髓鞘性多神经根神经病（CIDP)。
[0077] 在一个实施方案中，该方法还包括
[0078] c)在适于神经嵴细胞分化成分化细胞的条件下温育步骤b)的产物，所述的分化 细胞选自施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。
[0079] 如本文所用，术语"分化"、"分化过程"指将分化程度较低的细胞转化成体细胞（例 如将神经嵴细胞转化成施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞）的一个或多个步骤。
[0080] 在一个实施方案中，提供了通过根据任一个以上实施方案的方法获得的施旺细 胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞。优选地，施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细 胞是患者特异的，即源自从患病个体获得的体细胞。在另一个实施方案中，所述细胞群体从 健康个体获得。例如，源自患者的施旺细胞代表了研究神经疾病病理生理学的疾病相关性 体外模型。将患者特异的体细胞转化为施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞代表了 一项产生患者特异性神经嵴细胞生物样品库的容易获得和可重复的技术。因此，在本发明 的又一个优选方面，构思了包含患者特异性施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞的 生物样本库。在另一个实施方案中，产生了包含从健康个体所获得的不同施旺细胞、软骨 细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞群体的生物样本库。如本文所用的术语"生物样本库"意指从 不同个体或物种取得的生物样品文库。标本和相关数据的归档收集意图用于研究目的，旨 在对付多种疾病，例如神经疾病如脱髓鞘病、多发性硬化、脊髓病、实验性变应性脑脊髓炎 (EAE)、急性弥散性脑脊髓炎（ADEM)、感染后或疫苗接种后脑脊髓炎、周围神经病、神经鞘 瘤、进行性神经性肌萎缩综合征（Charcot-Marie-Tooth disease)、吉兰-巴雷综合征、慢 性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病（CIDP)。
[0081] 在一个优选实施方案中，使用由这种方法获得的神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软 骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞作为研究神经疾病病理生理学的体外模型。例如，由本发明 方法获得的神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞可以用于筛选 逆转、抑制或阻止神经疾病的化合物。另外，它们可以用于筛选逆转、抑制或阻止药物（例 如糖尿病药物）的神经副作用的化合物。优选地，由本文所述的本发明方法获得的所述神 经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞源自患病受试者。
[0082] 在另一个实施方案中，使用由这种方法获得的神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨 细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞筛选并评价用于治疗神经疾病的新靶和化合物。优选地，由这 种方法获得的神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞衍生自患有 神经疾病的个体。分化来自患病受试者的神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌 细胞或脂肪细胞代表了一个在人类背景范例下早期评价药物安全性的独特机会。在另一个 实施方案中，使用由这种方法获得的分化的施旺细胞作为外周神经系统的体外模型。
[0083] 在另一个方面，本发明提供一种治疗性组合物，其含有由前述任一种方法产生的 细胞或含有前述细胞群体的任一群体。优选地，这种治疗性组合物还包含生理相容性溶液， 包括例如人工脑脊液或磷酸盐缓冲盐水。所述治疗性组合物可以用来治疗、预防或稳定神 经疾病，例如脱髓鞘病、多发性硬化、脊髓病、实验性变应性脑脊髓炎（EAE)、急性弥散性脑 脊髓炎（ADEM)、感染后或疫苗接种后脑脊髓炎、周围神经病、神经鞘瘤、进行性神经性肌萎 缩综合征、吉兰-巴雷综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多神经根神经病（CIDP)。例如，成纤维 细胞、角质形成细胞或脂肪细胞可以通过皮肤活组织检查从需要治疗的个体或从健康个体 中获得并且通过本发明的方法再编程为神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细 胞或脂肪细胞。在本发明的一个实施方案中，收获由这种方法获得的神经嵴细胞、分化的施 旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞并且将其引入个体中以治疗疾病。在另一个实 施方案中，由这种方法获得的神经嵴细胞在引入个体前在适于分化为分化的施旺细胞、软 骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞的条件下培养，并且可以用来更换患病或受损的组织或辅 助其正常功能。本发明的巨大优点在于，它基本上无限制地供应患者特异性人神经嵴细胞、 分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞，或者它基本上无限制地供应来自具有 相同HLA型的健康个体的适用于移植的相容性神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平 滑肌细胞或脂肪细胞。细胞疗法中自体和/或相容性细胞的使用提供了相对于使用非自体 细胞的优势，所述非自体细胞可能受到免疫排斥。相反，自体细胞不可能激发明显的免疫反 应。
[0084] 本发明的另一个实施方案是人神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细 胞或脂肪细胞的生物样品库用于治疗神经疾病的用途。这些生物样品库优选地包含从具有 几种HLA型的患者或健康个体获得的人神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细 胞或脂肪细胞。移植从健康供体获得的细胞至需要用相容性HLA型治疗的个体避免了正常 情况下与异源性型细胞移植相关的突出的排斥反应问题。常规地，通过施用免疫抑制物或 抗排斥药物如环孢菌素阻止或减少排斥。然而，这类药物具有明显的不利副作用，例如，免 疫抑制、致癌性、肾毒性以及十分昂贵。本发明应当消除或至少大幅减少抗排斥药物如环孢 菌素、依木兰、FK-506、糖皮质激素和雷帕霉素及其衍生物的需要。
[0085] 就本发明的治疗方法而言，向哺乳动物施用神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细 胞、平滑肌细胞或脂肪细胞不意在限于特定施用模式、剂量或施用频率；本发明构思了全部 施用模式，包括足以提供充分阻止或治疗疾病的剂量的肌内、静脉内、关节内、病灶内、皮下 或任何其他途径。人神经嵴细胞、分化的施旺细胞、软骨细胞、平滑肌细胞或脂肪细胞可以 按单剂量或多剂量施用至哺乳动物。当施用多剂量，剂量可以彼此相隔例如1周、1月、1年 或10年。也可以在施用细胞之前、其期间或之后施用一种或多种生长因子、激素、白介素、 细胞因子、小分子或其他细胞以进一步使得这些细胞偏向于特定细胞类型。
[0086] 以上实施方案的任一个实施方案可以单独或组合地存在。
[0087] 如本文所用的术语"干细胞"指具有自我更新能力的细胞。如本文所用的"未分 化的干细胞"指具有分化成种类多样的细胞类型的能力的干细胞。如本文所用，"多潜能 干细胞"指能产生多种细胞类型的细胞的干细胞。多潜能干细胞（PSC)包括人胚胎干细胞 (hESC)和人经诱导的多潜能干细胞（hiPSC)。人经诱导的多潜能干细胞能衍生自再编程的 体细胞，例如通过本领域已知的方法转导4种确定的因子（Sox2、0ct4、Klf4、c-Myc)。 实施例
[0088] 成纤维细胞培养和iSC转化
[0089] SCC058包皮成纤维细胞（Millipore)于37 °C和5 % 0)2在低血清 FibroGro(Millipore)中培养。为了转化，将7300个细胞/cm2接种在含有ImM丙戊酸（VPA， Sigma)的成纤维细胞培养基中。随后，将细胞用ImM VPA和6μg/ml聚凝胺（polybrene) (Millipore)处理2天并随后转移至低黏附平板的NSC培养基中用于形成球状体。NSC培 养基由NeuroCult NS-A增殖培养基（StemCell Technologies)组成，所述增殖培养基补 充有青霉素 / 链霉素、bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)、BDNF(20ng/ml)、肝素（2μg/ml)、 D114 (500ng/ml)、Jaggedl (500ng/ml)、SHH (500ng/ml，peprotech)、抗坏血酸（0· 2mM， Sigma)、FGF8a(100ng/ml)、10% NSC-CM(由 ESC-NSC 条件化的培养基）和化合物 B(2 μΜ， Roche)。
[0090] 化合物B已经例如在WO 03/076429中描述并且具有以下结构：
[0092] 熔点温度（°C ) :180_183°C
[0093] 系统命名：
[0094] [3R，4R] -N- {4-[4- (2-氟-6-羟-3-甲氧基-苯甲酰基）-苯甲酰氨基]-吖庚 烷-3-基}-4-羟-3, 5-二甲基-苯甲酰胺盐酸盐
[0095] 如果不另外指明，则全部生长因子均来自R&D Systems。为了比较其他抑制物的 效果，将化合物 B 分别更换为 2 μΜ DorsomorphinUOyM H89 (Tocris)、10 μΜ Y27632 或 10 μΜ GSK650394(Tocris)。
[0096] 在4天后，将球状体用Accutase解离并且将单细胞接种在低黏附平板中补充有抑 制物混合物的NSC培养基中，所述抑制物混合物包含500ng/ml头蛋白（peprotech)、10 μ M SB431452 (Tocris)和 1 μΜ CP21 (Roche)。
[0097] CP21是一种新的高度选择性GSK3 β抑制物：系统命名：3- (3-氨基-苯 基）-4-(1-甲基-IH-吲哚-3-基）-吡咯-2, 5-二酮；描述于以下文献中：L. Gong等人； Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 20 (2010),1693-1696〇
[0098]
[0099] 3天后，将次生球状体接种在聚鸟氨酸-层粘连蛋白（POL)包被的培养皿上。在贴 壁后（24小时），将培养基更换为分化培养基，所述分化培养基包含N2B27 (1: 1DMEM/F12和 Neurobasal连同β -疏基乙醇（50 μ M)、无维生素 A的B27补充物（1:50, Invitrogen)，和 补充有抗生素的 Ν2 补充物（1:100, Invitrogen)、BDNF(20ng/ml)、⑶NF(20ng/ml)、层粘连 蛋白（11^/1111)、抗坏血酸（0.21111)和双丁酰-〇410 3(0.51111，3丨81]^)。每隔1日，更换50% 培养基。对于分化的第一个7天，向培养基补充抑制物混合物。
[0100] 对于神经嵴样细胞的脂肪细胞分化和平滑肌细胞分化，将次生球状体作为球状体 或单个细胞铺种在生长因子减量的基质胶上。在24小时后，将培养基更换成脂肪生成性分 化培养基，所述分化培养基含有DMEM、7. 5%敲除血清替代物（KOSR，Invitrogen)、0· 5%非 必需氨基酸、1%青霉素和链霉素、〇. 1 μΜ地塞米松、10 μ g/ml胰岛素（Sigma)和0. 5 μΜ罗 格列酮。每隔1日更换培养基。在4周后，细胞用4% PFA固定并用油红或抗SM分别染 色。对于软骨生成，通过离心收集次生球状体并且作为沉淀物在补充有谷氨酰胺、丙酮酸、 抗生素、NEAA、10%FCS和10ng/ml TGFP的DMEM高葡萄糖中培养。在4周后，将沉淀物用 4% PFA固定并通过阿辛蓝染色法分析。
[0101] 使用双重SMD抑制方案，如先前所述生成胚胎干细胞衍生的神经干细胞 (ESC-NSC) (Chambers等人，2009)。将NSC于37°C，5% (：02在POL包被的平板上在补充有 bFGF(10ng/ml)、EGF(10ng/ml)、BDNF(20ng/ml)的 N2B27 中培养。
[0102] 为了鉴定化合物B，将NSC在POL包被的平板上于N2B27中以21000个细胞/cm2 接种。在细胞贴壁后（4小时），以所示浓度添加化合物。用DMSO处理阴性对照细胞。将细 胞温育4天并且随后使用CellTiterGlo?试剂盒（Promega)根据制造商的说明书测定ATP 的量。
[0103] 对于iSC/NSC-神经元共培养，将NSC在分化培养基中培养13天。用Accutase解 离NSC-神经元并且随后将其以120000个NSC-神经元/12孔接种在分化培养基中仅P0L，成 纤维细胞或iSC上。成纤维细胞和iSC已经事先用CFSE细胞示踪物（Invitrogen，10 μ M， 20分钟）标记。每隔1日，更换50%培养基。在共培养第13日，将细胞用4% PFA固定。
[0104] 激酶选择性概况分析
[0105] 使用来自Caliper (Per