用于借助极高压匀浆破裂小球藻细胞壁的优化方法
【专利说明】用于借助极高压匀浆破裂小球藻细胞壁的优化方法
[0001] 本发明涉及用于在工业规模上破裂小球藻（Chlorella)属微藻，更具体地是普 通小球藻（Chlorella vulgaris)、异养小球藻（Chlorella sorokiniana)或原壳小球藻 (Chlorella protothecoides)的细胞壁的优化方法。
【背景技术】
[0002] 本领域普通技术人员熟知的是，小球藻是食品的潜在来源，因为它们富含蛋白质 和其他必需营养素。
[0003] 具体地，它们包含45%的蛋白质、20%的脂肪、20%的碳水化合物、5%的纤维素和 10%的矿物质和维生素。
[0004] 为了在食品中有效地使用小球藻，通常利用"细胞破裂"，以便促进其可消化性和 吸收速率。
[0005] 通过使用不同技术，在专利性和非专利性文献中很好地描述了微藻的这一"细胞 破裂"：
[0006] -物理技术（超声、微珠粒、热休克、高压等）
[0007] -化学技术（酸、碱、亲水有机溶剂等）
[0008] -酶技术（纤维素酶、脂肪酶等）。
[0009] 然而，不同的机械的、化学的或酶的替代方案一般不能非常成功地外推至工业规 模并且实质上是在实验室规模上进行描述的。
[0010] 此外，如果细胞壁具有特别高的机械强度（具体地是对小球藻属而言）并且如果 培养基中的细胞密度高（>l〇〇g/l)，则技术的选择会变得非常有限。
[0011] 当除此之外还有外推的工业问题（高容量、可靠性、运营成本、投资成本等）时，现 实的机械替代方案还实质上受限于使用微珠粒进行研磨以及受限于高压技术。
[0012] 通过常规高压匀浆的细胞破裂技术，本发明解决的领域，例如描述于专利申请 或专利CN 102433015(用于从单细胞蓝藻中提取花菁）、CN 101817738(用于从产DHA 微生物中提取DHA)、US 5 885 564(用于获得包含磷脂和氟烷的载氧组合物）或者CN 101352249(用于从微藻生物质提取脂质和蛋白质组分）中。
[0013] 高压匀浆（在本披露的其余部分中称为"HPH"），也称为动态高压匀浆，已经通过 新一代匀浆器的开发而提出，能够达到高于常规机器10-15倍的压力。
[0014] 已知待"破裂"的细胞材料的性质，HPH导致产生乳液，这些乳液实质上由细胞碎 片、细胞内的水性液体以及油的混合物构成。
[0015] 在20世纪80年代初期，已经提出新技术，用于借助能够在液体中产生并且管理极 高压（大于IOOMPa并且高达300-500MPa的压力）的机器的可用性，以及还借助匀浆室的 新设计，来产生乳液。
[0016] 因此高压匀浆器的不同制造商提出了原型或工业规模的设备，例如 Microfluidics 公司、Stansted Fluid Power 公司、AVP 公司、Avestin 公司或 Niro Soavi 公司。
[0017] 从概念上讲，基本匀浆器是由高压发生器，例如偶联至压力放大器上的正排量栗 制成，该栗迫使流体穿过一系列专门设计的匀浆阀。
[0018] 加工流体的迅速增压（高达350MPa)引起约3°C /100MP的升温，同时在匀浆阀中 发生的瞬时压力下降诱导更大热增加（15°C至20°C /IOOMPa)。
[0019] 可以将次级阀（在那里发生远远更小的压力下降）放置在主阀的旁边，以便破裂 第一步骤中可能形成的聚结物。
[0020] 鉴于最终温度会很高，取决于输入温度并且取决于操作压力水平，加工流体的迅 速冷却代表了用于保存加工的产物的不耐热组分的良好实践。
[0021] 显著地，在这些动态高压操作中，流体暴露于高压持续非常短的时段（I-IOs)。
[0022] 在这一时段，流体必须从放大器流动至破裂阀。主要通过用可调节限定孔口使加 工流体在高压下穿过排放阀，而不是通过暴露于高压，来调节破裂操作。
[0023] 无论匀浆阀是何种类型，加工流体在高压下穿过称为"匀浆空间"的合流段，然后 扩张。
[0024] 由致动器控制压力，由此使得能够调节施加在阀上的力。
[0025] 因此，必须精细地控制这一 HPH技术，以便是有效的，并且必须根据预期目的来进 行调节。
[0026] 因此，与使用HPH来破裂例如微藻的细胞壁并列，为了使微藻更易消化，或为了释 放其感兴趣的内容物，另一应用涉及微生物净化。
[0027] 在此领域，Stansted Fluid Power公司已经对勾衆器阀的设计引入了显著改进， 这使得能够借助增加流体的压力水平至高达350MPa，来通过改变乳液的或生物聚合物的质 地，原位消毒产物。
[0028] 由于所有上述内容，当意在这一细胞破裂技术的有效工业外推时，HPH技术似乎是 有前途的。
[0029] 然而，当必须应用其来破裂一般微藻细胞，并且具体是破裂小球藻的细胞时，出现 了多个问题。
[0030] 涉及用HPH加工小球藻生物质的第一个问题关系到产生的乳液的性质。
[0031] 尤其是，这一乳液的稳定性将取决于位于界面的分子，并且还取决于匀浆技术所 提供的乳化工作。
[0032] 对于将其用于多种食品应用，所述乳液的稳定性一般是必需的。
[0033] 第二个问题涉及干燥所述乳液。
[0034] 的确，当此乳液被干燥（例如通过喷雾干燥）时，乳液的精细度将决定粉末流动的 特性，脂质封装的特性，以及相对于氧化的稳定性的特性。
[0035] 根据预期应用，最终产物都将是更易于使用的。
[0036] 取决于基质，乳化所需的能量可以是极高的，以便设法产生足够细并且稳定的乳 液。
[0037] 第三个问题是在用于精炼/纯化湿生物质例如小球藻发酵汁的方法期间，待观察 的微生物质量。
[0038] 在其中在未灭菌环境中进行精炼/纯化方案的情况下，要采取具体预防措施来限 制微生物污染的发展（例如冷冻方法、限制中间贮存期持续时间等）。
[0039] 然而，这些预防手段可能是不充足的，并且在产生最终产物的最终步骤中，巴氏消 毒/灭菌步骤证明是必需的。
[0040] 面对这三个问题，本领域普通技术人员将不得不依靠具有连续研磨步骤、巴氏消 毒步骤/灭菌步骤和采用适当技术的匀浆步骤的费力的方法。
[0041] 发明主题
[0042] 为了克服这些限制，本申请公司选择对极高（或超高）压技术控制进行研究，以便 成功地同时进行这三个作用并且因此显著简化操作顺序。
[0043] 更具体地，本申请公司决定利用应由本领域普通技术人员常规地分开考虑的HPH 技术应用的不同领域中的两个。
[0044] 第一个领域涉及可以由HPH技术引起的物理变化，例如悬浮液的或乳液的颗粒 的、小滴的或微团的尺寸减小和尺寸分布的变窄（总体上描述并且用于制备或稳定乳液或 制备纳米颗粒和纳米悬浮液类型，或出于获得粘度和质地方面的改变的目的）。
[0045] 第二个领域中心是围绕由HPH诱导的细胞"破裂"的作用，这一般应用于生物技术 和制药工业中回收细胞内物质，其中通常，HPH用于降低食品和药剂产品中的微生物负载。
[0046] 因此以此方式进行HPH使得能够有效将其单独用于破裂微藻细胞，同时利用此技 术提供的所有功能性，以便管理与以下项有关的问题：
[0047] -产生乳液，
[0048] -干燥所述乳液
[0049] -在精炼/