用于控制蛋白质中的岩藻糖基化水平的方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年7月23日向印度专利局提交的印度临时专利申请3262/ CHE/2013及在2013年7月23日向印度专利局提交的印度临时专利申请3265/CHE/2013的 权益及优先权。依据专利合作条约实施细则4. 18,为了所有目的，2013年7月23日提交的 所述申请的内容整体援引加入到本文中，包括加入未包含在本文中并在专利合作条约实施 细则20. 5 (a)中提到的结论、权利要求书或附图的任何项目或部分。
技术领域
[0003] 本发明涉及用于控制蛋白质中的岩藻糖基化水平的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 在真核生物表达系统中表达的蛋白质经历涉及糖基化的翻译后修饰过程。现今已 被建立用于产生糖蛋白（如IgG及其它包含Fc区域的单克隆抗体）的真核生物表达系统 将N-聚糖添加至多肽链。
[0006] 在IgG中，最重要的N-聚糖连接至两条CH2链的Asn297处（参见图14)，其尤其 包括N-乙酰基-神经氨酸（唾液酸）、N-乙酰基-葡糖胺、半乳糖、甘露糖及岩藻糖残基。
[0007] 这基本上适用于转基因植物表达系统以及适用于哺乳动物细胞系、昆虫细胞系 等。在所有这些情况下，N-聚糖包含至少一个岩藻糖残基，其以α-3-糖苷或α-6-糖苷 连接至与多肽链的Asn残基连接的N-乙酰基-葡糖胺残基。
[0008] 酵母表达系统易于产生富含甘露糖的高糖蛋白，其在治疗性抗体被施用至患者时 常常导致非期望的免疫反应。杆状病毒转染的昆虫细胞系统因低糖基化而引起问题，其负 面地影响治疗性抗体的效应子功能。此外，主要的缺点是感染性杆状病毒的催化性质，其使 得用于完整IgG生产的范围（window)变窄。
[0009] ADCC是细胞介导免疫的机制，藉此免疫系统的效应细胞主动地裂解已被特异性抗 体结合的靶细胞。它是作为体液免疫反应的一部分的抗体可以通过其作用来限制及遏制感 染的多种机制中的一种。经典的ADCC介导的效应细胞是自然杀伤（NK)细胞；但单核细胞 和嗜酸性粒细胞也可以介导ADCC。由于其依赖于先前的抗体反应，所以ADCC是适应性免疫 反应的一部分。
[0010] 用于在靶细胞中引发ADCC的治疗性抗体需要Fc区域，以被所述效应细胞的Fc γ 受体所识别。
[0011] 近来的研究已显示，相较于岩藻糖基化抗体，在其糖基化模式中具有减少量的岩 藻糖的单克隆抗体显示出高得多的抗体依赖性细胞毒性（ADCC)活性。再次，岩藻糖残基的 缺乏导致增加的ADCC的位置基本上是Asn297位置。低/无岩藻糖抗体的ADCC增加的机 制似乎是由如此修饰的Fc区域针对Fc γ R(例如，Fc γ IIIa(CD16)，其是在人免疫效应细胞 中针对ADCC的主要Fc受体）的亲和力增加所介导的（Shields等人，2002)。
[0012] 岩藻糖基化是牵涉糖蛋白或糖脂上的寡糖的最常见修饰中的一种。岩藻糖基化包 括将岩藻糖残基附接至N-聚糖、0-聚糖及糖脂。0-岩藻糖基化（一种特殊类型的岩藻糖 基化）对于Notch信号转导非常重要。岩藻糖基化的调控机制是复杂的。许多种类的岩藻 糖基转移酶、GDP-岩藻糖合成途径及GDP-岩藻糖转运蛋白参与了岩藻糖基化的调控。
[0013] 已知糖基化影响治疗性单克隆抗体的效应子功能。在抗体的寡糖链中的不同糖残 基中，岩藻糖是影响由产物诱导的抗体依赖性细胞毒性（ADCC)的关键糖类之一。
[0014] 通常使用细胞培养参数的操作来控制抗体的半乳糖苷化及唾液酸化。岩藻糖基化 的控制主要通过使用FUT8敲除细胞和其它基因沉默模型通过细胞系工程改造来完成。
[0015] US20090208500公开了通过操作FUT8敲除细胞来产生具有减少的岩藻糖和改善 的Fc功能的抗体。
[0016] US7972810公开了细胞培养方法和含锰培养基，其改善糖蛋白（包括红细胞生成 素及其类似物或衍生物）的糖基化或唾液酸化。根据该公开内容，锰增加了唾液酸化和在 〇-连接及N-连接糖基化的情况下的位点占用（即较少的非糖基化产物），而且还增加末端 半乳糖苷化。
[0017] 此外，可以由培养基渗透压来控制单克隆抗体的岩藻糖含量以用于高抗体依赖性 细胞毒性（Konno等人，2012) 〇
[0018] 然而，存在对于在所需细胞系中产生糖蛋白同时控制重组工程改造抗体的岩藻糖 含量而无需每次经历在所选细胞系中产生FUT8基因敲除的费力过程的有效方法的需要。
[0019] 发明的实施方案
[0020] 这些目标通过使用根据本发明的独立权利要求的方法和手段得到满足。从属权利 要求涉及优选实施方案。还应理解，由数值限定的取值范围应被理解为包含该限定值。
[0021] 发明概述
[0022] 在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限制于所描述的装置的特定组成部分 或所描述的方法的特定工艺步骤，因为这样的装置以及方法可发生变化。还应理解，本文使 用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，并不意欲进行限制。必须注意，如在说明书及 所附权利要求书中所使用的，除非上下文另外地清楚指明，单数形式"一个"、"一种"和"所 述"包括单数和/或复数对象。此外，还应理解，在通过数值限定给出参数范围时，该范围被 视为包括这些限定值。
[0023] 根据本发明的一个实施方案，提供了一种用于在真核生物和/或真核生物的蛋白 质表达系统中修饰岩藻糖基化的方法或过程，在该方法或过程中，控制培养基中的锰或锰 离子的总浓度。
[0024] 糖蛋白的岩藻糖基化是由岩藻糖基转移酶（FUT)完成的。这些酶是将L-岩藻糖 从GDP-岩藻糖（鸟苷二磷酸岩藻糖）供体底物转移至受体底物的酶。受体底物可以是另 一种糖，例如在N-连接糖基化的情况下将岩藻糖转移至核心GlcNAc (N-乙酰基葡糖胺）糖 或是在由〇-岩藻糖基转移酶产生的〇-连接糖基化的情况下将岩藻糖转移至蛋白质。在哺 乳动物中有不同的岩藻糖基转移酶，其中绝大多数位于高尔基体。最近已显示〇-岩藻糖 基转移酶定位于内质网（ER)。哺乳动物岩藻糖基转移酶的实例是FUT1、FUT2、FUT3、FUT4、 FUT5、FUT6、FUT7、FUT8、FUT9、FUT10 及 FUT11。
[0025] 尽管锰的作用还未被完全理解，锰是参与许多酶系统的必需微量元素。它在对于 能量产生是必需的酶中用作辅因子，并且涉及葡萄糖的代谢作用、肝脏中的糖原储存、蛋白 质消化作用以及胆固醇及脂肪酸的合成。它对于DNA和RNA分子的合成也是必需的。
[0026] 锰对于神经系统的生长及维护、骨和关节的发育及维护、雌性性激素及甲状腺激 素的功能是必需的。超氧化物歧化酶（SOD，MnSOD)是一种在其结构中含有锰的抗氧化酶。
[0027] 在细胞外液体或真核生物中，锰实际上不存在，然而在哺乳动物中，锰的细胞内浓 度是在0. 010皮克/细胞至0. 10皮克/细胞的范围内。
[0028] 然而，本发明人出人意料地发现，锰的浓度对于糖蛋白的岩藻糖基化水平具有直 接效应。
[0029] 因此，本发明提供用于通过在过程中改变培养基及进料中的锰或锰离子的总浓度 来修改糖基化蛋白质的岩藻糖含量。
[0030] 优选地，该方法或过程是降低岩藻糖基化的方法或过程。在这样的方法或过程中， 蛋白质表达和/或翻译后修饰是在存在升高的锰或锰离子的总浓度的情况下进行的。
[0031] 出人意料地，本发明人发现，在这样的条件下，所表达的糖蛋白具有降低的岩藻糖 基化水平。此外，他们发现，细胞生长、存活力及所产生的蛋白质的滴度未受锰或锰离子浓 度升高的影响。
[0032] 此外，他们发现，糖基化模式的其它性质（即GO以及Man5)在存在升高的锰或锰 离子的总浓度的情况下增加。
[0033] 如本文所使用，术语"岩藻糖基化水平"意指其中聚糖携带岩藻糖的糖蛋白的总 量。同样地，术语"非岩藻糖基化水平"以及"非岩藻糖基化百分比"意指在其聚糖中没有 岩藻糖的糖蛋白的百分比。
[0034] 在根据本发明的方法或过程的优选实施方案中，提供的升高的锰或锰离子浓度是 在彡0· 05mM至彡IOmM的范围内。
[0035] 优选地，升高的锰或锰离子浓度为 0. 05 ;0. 1 ;0. 15 ;0. 2 ;0. 25 ;0. 3 ;0. 35 ;0. 4 ; 0· 45 ;0· 5 ;0· 55 ;0· 6 ;0· 65 ;0· 7 ;0· 75 ;0· 8 ;0· 85 ;0· 9 ;0· 95 ;1 ;1· 05 ;1. 1 ;1· 15 ;1· 2 ; 1. 25 ；1. 3 ；1. 35 ；1. 4 ；1. 45 ；1. 5 ；1. 55 ；1. 6 ；1. 65 ；1. 7 ；1. 75 ；1. 8 ；1. 85 ；1. 9 ；1. 95 ；2 ； 2. 05 ；2. I ；2. 15 ；2. 2 ；2. 25 ；2. 3 ；2. 35 ；2. 4 ；2. 45 ；2. 5 ；2. 55 ；2. 6 ；2. 65 ；2. 7 ；2. 75 ；2. 8 ； 2. 85 ;2· 9 ;2· 95 ;3 ;3· 05 ;3· 1 ;3· 15 ;3· 2 ;3· 25 ;3· 3 ;3· 35 ;3· 4 ;3· 45 ;3· 5 ;3· 55 ;3· 6 ; 3. 65 ；3. 7 ；3. 75 ；3. 8 ；3. 85 ；3. 9 ；3. 95 ；4 ；4. 05 ；4. I ；4. 15 ；4. 2 ；4. 25 ；4. 3 ；4. 35 ；4. 4 ； 4. 45 ；4. 5 ；4. 55 ；4. 6 ；4. 65 ；4. 7 ；4. 75 ；4. 8 ；4. 85 ；4. 9 ；4. 95 ；5 ；5. 05 ；5. I ；5. 15 ；5. 2 ；