的、安慰剂对照的、III期治疗-斑块研究（phase III treat-Plaq study)在治疗具有中度至严重银肩病的患者12周后，成功地满足了 PASI-75分（银 肩病面积和严重指数）得分的显著改善的预先指定主要终点。Biocon在2013年1月从 印度药品管理总局（DCGI)收到了药品销售许可，并且在2013年8月在印度境内开始销售 (Jayaraman，2013)〇
[0073] 从小鼠衍生的NSO细胞系（本文称做"Tlh"）并且还从中国仓鼠卵巢（CHO)细胞 系（本文称做"Bmab-600"）产生Itolizumab。因为翻译后修饰，特别是非岩藻糖基化模式 随着细胞系和培养条件而变化，Bmab-600及Tlh的Fc部分以不同的亲和力与Fc γ RIIIa结 合。
[0074] 可以例如从小鼠衍生的NSO细胞系（本文称做"Tlh"）并且还从中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞系（本文称做"Bmab-600"）产生Itolizumab。因为翻译后修饰，特别是非岩藻 糖基化模式随着细胞系和培养条件而变化，Bmab-600及Tlh的Fc部分以不同的亲和力与 Fcy RIIIa 结合。
[0075] 根据本发明的另一方面，提供了一种糖蛋白，所述糖蛋白用根据本发明的任何方 法或过程的方法或过程来产生。
[0076] 优选地，所述糖蛋白是重组蛋白。更优选地，所述糖蛋白是免疫配体，优选是抗体。 特别优选的是，所述糖蛋白在其糖基化模式上具有减少的岩藻糖含量。
[0077] 优选地，糖蛋白或其子结构域（如Fc区域）具有约35%的非岩藻糖基化水平。
[0078] 在优选实施方案中，提供的是，糖蛋白具有增加的ADCC。优选地，所述糖蛋白是 Itolizumab0
[0079] 在另一个优选实施方案中，提供的是，糖蛋白实现对于CD25和CD4呈阳性的细胞 特别是CD4+T细胞在体外或体内的减少。
[0080] 本发明人出人意料地显示，根据本发明的抗CD6抗体的使用导致对于表面抗原 CD25和CD4(参见图5b及描述）呈成阳性的细胞特别是CD4+T细胞的增殖减少。
[0081] 如本文所使用的术语"细胞的减少"意指（i)增殖的抑制、（ii)耗尽、（iii)细胞 凋亡的诱发或（iv)导致这样的细胞的减少的其它机制。
[0082] 根据本发明的另一方面，提供了如上所示的糖蛋白用于制造治疗人或动物患者的 药物的用途。同样地，提供了如上所示的糖蛋白用于治疗人或动物患者的用途。
[0083] 在这样的用途的优选实施方案中，人或动物患者患有选自以下的疾病或已被诊断 为处于发生选自以下的疾病的风险中：
[0084] ?肿瘤疾病，包括肿瘤、淋巴瘤及白血病，特别是B细胞慢性淋巴细胞性白血病 (B-CLL)，特别是T细胞白血病
[0085] ?自身免疫疾病，包括类风湿性关节炎、银肩病、克罗恩氏病、红斑狼疮和/或舍格 伦病
[0086] ?神经退行性疾病，包括多发性硬化和/或帕金森氏病、阿尔茨海默病、亨廷顿病 和/或肌萎缩侧索硬化，和/或
[0087] ?感染性疾病
[0088] 优选地，这样的用途涉及治疗或预防已进行移植的人或动物中的不良反应如移植 物抗宿主病（GVHD)。这样的移植包括器官移植以及骨髓移植。
[0089] 实验和附图/实施例
[0090] 虽然已在附图以及前文描述中详细说明及描述本发明，但这样的说明及描述应被 认为是示例性或范例性的且不是限制性的；本发明并不受限于所公开的实施方案。本领域 普通技术人员在实施请求保护的发明中可以通过研读附图、公开内容及所附权利要求书而 理解并实现对公开的实施方案的其它变化。在权利要求书中，单词"包含"未排除其它元素 或步骤，而且不定冠词"一个"或"一种"并未排除复数。仅某些措施记载于互相不同的从 属权利要求中的事实并非表明不能使用这些措施的组合以处于优势。权利要求中的任何参 考记号不应被解释为限制范围。
[0091] 图1 :用具有Fc区域的抗体进行的去糖基化实验的结果。
[0092] 将抗⑶抗体Itolizumab (也称做Tlh)用去糖基化缓冲液（50mM Tris，ImM CaC12, pH = 8. 1)以对于Itolizumab(5mg/ml) 1:1的比例进行温育，随后用肽-N-糖苷酶 F(PNGase)酶（对于Img抗体为10U)温育24小时。
[0093] 在37°C下温育24小时后，在样品中加入相等体积的Tlh缓冲液（组氨酸海藻糖缓 冲液）并且在4°C、4000rpm于centricon管（50kD截断过滤器）中离心15分钟。将残留 体积再次以相等体积的Tlh缓冲液重新悬浮，并在4°C、4000rpm下离心15分钟。将去糖基 化的Ab储存于最终的储存管中，并通过Nano drop估计浓度。通过CE-SDS (毛细管电泳） 确认去糖基化。随后进行荧光活化细胞分选仪（FACS)分析。简言之，用抗CD6抗体Tlh或 如上所述产生的去糖基化的Tlh抗体标记HUT78细胞（T细胞系）。
[0094] 随后使用FITC标记的抗Fc的第二抗体，观察到信号。图1显示Thl的Fc区域的 去糖基化并未损及其与表达CD6的细胞系结合的能力。这些结果进一步由等离子体共振实 验确认。
[0095] 图2 :使用具有Fc区域的抗体进行的去糖基化实验的结果。
[0096] 具体地，如上文所讨论的，将抗⑶抗体Itolizumab去糖基化。其抑制活化的T细 胞增殖的能力随后在合适的增殖测定法中与未经修饰的Tlh的能力进行比较。使用尼妥珠 单抗作为阴性对照，尼妥珠单抗是具有与Itolizumab相同的IgG骨架但与EGFR结合的抗 体。
[0097] 简言之，使用碳酸氢盐缓冲液（pH 9. 5)将抗体以0至1 μ g/ml范围的浓度涂布在 无菌的96孔板中过夜。在洗涤后，将来自正常健康志愿者的纯化淋巴细胞加至板中。加入 从80至lμg/ml的Itolizumab，并且将培养物温育4天。加入阿拉玛蓝以测量增殖。相 对于未受刺激的细胞对照来计算倍数差异。使用同种型尼妥珠单抗抗体作为对照。附着在 板上的抗CD3 (所使用的抗CD3是在古巴分子免疫学中心制造的0KT3克隆）刺激来自正常 健康的志愿者的幼稚T细胞（来自在Ficoll密度梯度上纯化的人供体的外周血单核细胞 (PBMC))的增殖。
[0098] 尼妥珠单抗（80 μ g/ml)不显示任何的T-细胞增殖抑制，与未受刺激的细胞相比， 导致了大约2. 75倍的细胞增加，而天然的Tlh显示T-细胞增殖的抑制（在80 μ g/ml至 1. 25 μ g/ml的范围为35至20%抑制）。与此相反，去糖基化的Tlh的影响与尼妥珠单抗的 影响类似。这意味着，在去糖基化后，抗体失去其抑制T细胞增殖的能力。
[0099] 图3 :比较天然抗体和去糖基化抗体的细胞毒性测定法的结果
[0100] 将冷冻的PBMC于具有10% FBS的RPMI1640培养基中在IL-2 (浓度2. 5ng/mL)的 存在下解冻，并于37°C、5% CO2培养箱中温育过夜。第二天，将细胞重新悬浮于没有IL-2的 培养基中并温育4至5小时。将12, 000个Hut-78细胞/50 μ L加入96孔板中的每一孔。按 照模板加入50 μ L的3Χ浓缩药物（10微克/毫升的天然的Tlh、去糖基化的Tlh或抗⑶3) 并于37°C、5% CO2培养箱中温育2小时。将PBMC重新悬浮于测定培养基中并加入240, 000 个PBMC/50 μ!7孔，以获得1:20的靶对效应物的比例。将板于37°C、5% CO2培养箱中温育 22小时。将50 μ L的Cyto Tox-Glo加至板并且于室温温育30分钟。使用Spectramax来 读取板的发光，以测定细胞毒性。
[0101] 虽然天然的Tlh相较于抗CD3(其为靶向T细胞的部分耗尽抗体）显示轻微的但 统计上一致性的抗体依赖性细胞毒性（ADCC)活性，但该ADCC活性在分子的去糖基化后显 著地降低，表明了 Tlh的效应子功能。使用Itolizumab的Fab2片段也可以可与去糖基化 分子相当地降低ADCC活性。
[0102] 图4 :比较天然的抗体和去糖基化的抗体的混合性淋巴细胞反应（MLR)实验的结 果。
[0103] PBMC的制备：从健康供体收集30ml的血液。通过标准FICOLL密度梯度离心来分 离 PBMC0
[0104] 单核细胞耗尽及建立
[0105] 树突细胞（DC)衍生测定：将这些细胞于CO2培养箱中温育2小时。使单核细胞附 着在塑料表面上。随后将未附着的细胞（PBL)从培养瓶移除。用IXPBS洗涤所有的培养瓶 一次。将20ml的DC培养基（制成50ml贮存液，在50ml的测定培养基中的10 μ 1粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF)和5 μ 1的IL-4)加至每一培养瓶。将培养瓶保持在0)2培 养箱中6天。
[0106] 对生长中的树突细胞进行LPS处理：在第6天，将具有脂多糖（LPS)的DC培养基 加入每一培养瓶（在培养瓶中的LPS最终浓度为4ug/ml)并且放回C02培养箱中40至48 小时。
[0107] DC的制备：在LPS处理后，从两个培养瓶收集细胞悬浮物（DC)。用IXPBS洗涤每 一培养瓶一次。以1500rpm、5分钟转下细胞悬浮物，并且于3ml培养基中重建。计数LPS 处理过的DC，并且按照测定要求在培养基中重建。
[0108] PBL的制备：采用如前文所述的相同方案，在从另一健康个体收集血液后，进行 Ficoll分离。在单核细胞耗尽之后，收集未附着的外周血淋巴细胞（PBL)并以1500rpm、5 分钟转下并在5ml培养基中重建。计数PBL并重建至1.0 xlO6个细胞/毫升。
[0109] 对树突细胞（DC)进行SEB处理：葡萄球菌肠毒素 B(SEB)贮存液浓度为lmg/ml。 从贮存液中